Name: Les changements de profilage dans phosphorylation tyrosine kinase du récepteur à laide des puces à anticorps - Publicité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Découvrez le profilage de la phosphorylation des récepteurs tyrosine kinase dans les cellules cancéreuses MDA-MB-453 et KATO III à l'aide de puces à anticorps. Cette méthode multiplexée permet d'évaluer l'efficacité des inhibiteurs sélectifs ErbB et FGFR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été financé par la R &amp; D Systems, Inc

1. Préparation des échantillons <ol><li> Recueillir des lysats de traitement, ligand traité, ou d'un inhibiteur et les cellules ligand traités suivant les directives de la fiche gamme Phospho-RTK humaines. Le tampon de lyse a été optimisé pour ce kit. La substitution des tampons de lyse autres peuvent affecter la performance finale du tableau. Pour éviter la dégradation protéolytique échantillon, ajouter 10 pg / ml d'aprotinine, 10 ug / ml de leupeptine, et 10 pg / ml pepstatine A du volume de tampon de lyse pour chaque préparation de lysat de cellules fraîches pour chaque utilisation. </li><li> Concentration lysat doit être mesurée à l'aide d'un acide bicinchoninique (BCA) de dosage. Concentration de l'échantillon peut être ajusté empiriquement pour une sensibilité optimale et faible bruit de fond. Une gamme de 100-300 mg de lysat est recommandé comme un point de départ. </li><li> Cycles gel / dégel des échantillons devraient être évités et la bonne conservation de lysats est nécessaire pour des performances optimales. Dégeler les échantillons de lysat sur la glace. </li></ol><ol><li> Apportez tous les composants du kit à température ambiante avant utilisation. Pour éviter la contamination, porter des gants pour effectuer les procédures. </li><li> Pipeter 2,0 ml de 1 tampon de tableau dans chaque puits de la 4-Eh bien Multi-vaisselle doit être utilisé. 1 Tampon tableau sert de tampon de bloc. </li><li> En utilisant des pinces à pointe plate, retirez chaque membrane à utiliser entre les feuilles de protection et les placer dans un puits de la 4-Eh bien Multi-vaisselle. Le numéro de réseau doit être orientée vers le haut. </li><li> Lors du contact avec 1 tampon Array, le colorant bleu dans les taches disparaissent, mais les anticorps de capture sont conservés dans leurs emplacements spécifiques. </li><li> Incuber pendant 1 heure sur une plate-forme à bascule. Orienter le plateau de telle sorte que chaque extrémité des roches tableau se termine à son puits. La surface de la matrice doit être complètement mouillée et couverte par un tampon de bloc. </li><li> Tandis que les membranes sont de blocage, diluer la quantité désirée de lysat cellulaire à un volume final de 1,5 ml de tampon 1 Array. </li> &lt;li&gt; Tampon tableau Aspirer 1 à partir des puits de la 4-Eh bien Multi-plat et ajouter des solutions de lysat dilué. Placez le couvercle sur le 4-Eh bien Multi-vaisselle. <li> Incuber une nuit à 2-8 ° C sur un agitateur oscillant. Un temps d'incubation plus courte peut être utilisée si la sensibilité optimale n'est pas nécessaire. </li><li> Détachez délicatement chaque membrane de la 4-Eh bien Multi-plat et le placer dans des conteneurs en plastique avec 20 ml de tampon de lavage 1X. Le 4-Eh bien Multi-vaisselle ne peut pas être utilisé pour compléter les étapes de lavage. Rincer le 4-Eh bien Multi-vaisselle avec de l'eau déminéralisée ou distillée et séchez soigneusement. </li><li> Laver chaque membrane avec le tampon de lavage 1X pendant 10 min sur un agitateur à bascule plate-forme. Répéter l'opération deux fois pour un total de 3 lavages. </li><li> Diluer l'anticorps anti-phospho-tyrosine-peroxydase de raifort tampon de détection (HRP) dans du tampon 1X tableau 2 en utilisant le facteur de dilution sur l'étiquette du flacon. Pipeter 2,0 ml de solution diluée dans chaque puits de la 4-Eh bien Multi-vaisselle. </li><li> Détachez délicatement chaque membrane de son récipient de lavage.Permettre le tampon en excès de s'écouler à partir de la membrane et la membrane retourne à la 4-multi-puits contenant la vaisselle dilué anti-phospho-tyrosine-HRP. Couvrir les puits avec le couvercle. </li><li> Incuber pendant 2 heures à température ambiante sur un agitateur oscillant. </li><li> Laver chaque baie comme décrit précédemment. </li><li> Effectuez les étapes restantes sans interruption. Détachez délicatement chaque membrane de son récipient de lavage. Permettre le tampon en excès de s'écouler à partir de la membrane en épongeant le bord inférieur sur du papier absorbant. Placer chaque membrane sur une feuille de matière plastique protecteur avec le numéro d'identification vers le haut. </li><li> Pipeter 1 ml du réactif préparé Chemi Mélanger uniformément sur chaque membrane. Utiliser moins de 1 ml de mélange de réactifs Chemi par membrane peut entraîner une couverture incomplète membrane. La substitution de certains réactifs à haute intensité de chimioluminescence de réactifs Chemi 1 et 2 peuvent provoquer soit augmenté ou fond signal diminué en fonction du réactif. </li><li> Soigneusement couvrir avec un plastiqueProtège-document. Doucement lisser les bulles d'air et d'assurer Mix Réactif Chemi est répartie uniformément à tous les coins de chaque membrane. Incuber pendant 1 min. </li><li> Serviettes en papier de position sur le dessus et les côtés du protecteur de feuille de plastique contenant les membranes et bien presser l'excès Mix Réactif Chemi. </li><li> Retirez le protecteur de feuille supérieure en plastique et posez avec soin un laboratoire essuie-tout absorbant au-dessus des membranes pour éponger tout restant Mix Réactif Chemi. </li><li> Laissant membranes sur le protecteur de feuille de plastique en bas, couvrir les membranes d'une pellicule plastique en prenant soin de lisser doucement les bulles d'air. Enroulez le wrap excès de plastique autour de l'arrière de la feuille de protection de sorte que les membranes et les protecteurs de feuilles sont complètement enveloppé. </li><li> Placer les membranes avec les numéros d'identification vers le haut, dans une cassette de film d'autoradiographie qui n'est pas utilisé avec la détection des isotopes radioactifs. </li><li> Exposer à la lumière du film Kodak BioMax pour 1-10 min. Expositions multiples sont recommterminé. Sinon, les images peuvent être recueillies à l'aide d'un imageur chimiluminescence compatible comme le Carestream Health Image Station 4000MM PRO. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Signaux positifs observés sur le film développé peut être rapidement identifié en plaçant la superposition sur l'image de la transparence et de matrice en l'alignant avec les paires de points de référence imprimées dans les coins à cet effet. Le numéro d'identification estampé sur le tableau doit être placé sur le côté gauche avait. L'emplacement des commandes et des anticorps de capture est mentionnée dans l'annexe de la fiche gamme Phospho-RTK humaines. </li><li> Densités de pixels sur le film développé peut être recueillie à l'aide d'un scanner de mode de transmission tels que l'Epson Perfection V750 PRO. </li><li> Créer un modèle pour analyser la densité de pixel de chaque point du tableau en utilisant un programme d'imagerie appropriée des logiciels d'analyse. Programmes compatibles comprennent le logiciel ImageQuant ou ArrayVision de GE, sof Vision de l'Ouesttware avec des modèles spécifiques à protéome tableaux de profils, BioRad Quantité One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ et AlphaView Protéines simple. </li><li> La valeur des exportations de signaux dans un fichier tableur pour manipuler dans un programme tel que Microsoft Excel. </li><li> Déterminer la moyenne du signal (densité de pixels) de la paire de points représentant chaque dupliquée RTK. </li><li> Soustraire un signal de fond moyenne de chaque spot. Utilisez un signal provenant d'une zone claire de l'ensemble ou des taches de contrôle négatif comme une valeur de fond. </li><li> Comparer les signaux correspondants sur des tableaux différents pour déterminer la variation relative des niveaux de phosphorylation RTK entre les échantillons. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Ce protocole démontre comment l'homme Phospho-RTK réseau peut être utilisé pour cribler les effets de la stimulation du ligand et des inhibiteurs de la phosphorylation RTK. Dans la figure 1, les données sont indiquées pour MDA-MB-453 cellules qui ont été traitées, traitées avec 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) pendant 5 min, ou pré-traités avec des inhibiteurs connus de la famille ErbB 8-11 avant HRGβ1 traitement. Pour les expériences d'inhibition, les cellules ont été incubées avec 1 uM HDS 029, 200 nM PD 153035 ou 200 nM PD 158780 dans la GDF pendant trois heures. Chaque tableau a été incubé avec 100 pg de lysat. Une augmentation de la phosphorylation est observée pour ErbB2, ErbB3, ErbB4 et taches de capture lors de la comparaison avec les cellules non traitées HRG-β1 traitée MDA-MB-453 cellules. Le traitement des cellules avec les trois inhibiteurs sélectifs de la famille ErbB avant HRG-β1 incubation provoqué des réductions dans ErbB2, ErbB3, ErbB4 et de phosphorylation. Dans la figure 2, les données sont indiquées pour les cellules Kato III connus pour surexprimer le FGF R2 RTK. Dans cette série d'expériences, les cellules Kato III n'ont pas été traités, traités avec 100 ng / ml rhFGF acide (FGF) et 1 ug / ml d'héparine, ou prétraitée avec le FGF R inhibiteurs sélectifs 12-15 avant le traitement parFGF et de l'héparine. Le PD173074 inhibiteurs, PD 161570 et PD 166285 ont été utilisés à une concentration de 1 uM et incubées avec les cellules Kato III pour 3 heures dans un milieu sans sérum. Bien qu'il y ait une phosphorylation constitutive à la fois de l'EGF R et R2 FGF dans les cellules non traitées III KATO, une augmentation de la phosphorylation R2 FGF a été observée lors du traitement FGF. L'incubation des cellules avec PD 173074, PD 161570, PD 166285 ou entraîné une baisse de FGF R2 et R EGF phosphorylation. Bien que ces inhibiteurs sont connus affecter la phosphorylation des membres de la famille FGF R, ces résultats démontrent l'utilité de l'homme Phospho-RTK réseau pour surveiller l'effet d'une concentration spécifique de l'inhibiteur peut avoir sur d'autres RTK, tels que EGF R dans ce cas. <img alt="Figure 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig1.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. L'induction et l'inhibition de la réceptionteur phosphorylation de la tyrosine kinase dans les cellules cancéreuses du sein. images Array de Proteome Profiler homme Phospho-RTK tableaux et les profils correspondants histogramme sont affichés. MDA-MB-453 ont des cellules non traitées ou traitées avec des inhibiteurs de RTK suivie d'un traitement avec NRG-β1/HRG-β1. Le tableau a été utilisé pour surveiller les effets des inhibiteurs de la phosphorylation de la kinase MDA-MB-453 cellules. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4199/4199fig2.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Images de tableaux d'induction et l'inhibition de la phosphorylation de tyrosine kinase du récepteur dans les cellules de cancer gastrique. D'un profileur Human Proteome Phospho-RTK réseau et les profils correspondants histogramme sont affichés. Kato cellules III étaient untréé ou traités avec des inhibiteurs de RTK suivi d'un traitement avec FGF acide et de l'héparine. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4199/4199fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Références <ol><li> Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenbourg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegård, J., Stenling, R., &amp; Palmqvist, les cellules R. cancer colorectal activer les fibroblastes adjacents, résultant dans FGF1/FGFR3 signalisation et l'invasion accrue. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011). </li><li> Morishita, A., Gong, J., Nomura, T. Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., &amp; Masaki, T. L'utilisation de réseau pour identifier des protéines kinases de récepteurs tyrosine ciblables pour le traitement du cancer du côlon humain. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010). </li><li> Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T. Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., &amp; Antonescu, CR caractérisation moléculaire des tumeurs stromales gastro-intestinales pédiatriques. Clin. Cancer Res. 14, 3204-3215 (2008). </li><li> Stommel, JM, Kimmelman, CA, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C, Chin, L., &amp; DePinho, RA coactivation des récepteurs tyrosine kinases affecte la réponse des cellules tumorales aux thérapies ciblées. Science. 318, 287-290 (2007). </li><li> Agarwal, S., Zerillo, C, Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, et Stern, DF Association constitutivement activée de récepteur du facteur de croissance des hépatocytes (Met) à la résistance à un double inhibiteur de EGFR/Her2 non à petites cellules cellules cancéreuses du poumon. Br. Cancer juge. 100, 941-949 (2009). </li><li> Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schöffski, P., Marynen, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., &amp; Dębiec-Rychter, M. Co-actif et PDGFRA EGFR sont des cibles thérapeutiques potentielles dans le sarcome intimal. Cancer Res. 70, 7304-7314 (2010). </li><li> Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, et Kim, Combinaison TY de l'EGFR et MEK1 / 2 inhibiteur montre les effets synergiques de supprimer EGFR/HER3-dependent l'activation d'Akt dans les cellules humaines de cancer gastrique. Mol. Ther cancer. 8, 2526 à 2536 (2009). </li><li> Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V. Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., &amp; Ponts, les propriétés biochimiques et AJ antiproliférative de 4 - [Ar (alk) ylamino] pyridopyrimidines, une nouvelle classe chimique du puissant et spécifique du facteur de croissance épidermique inhibiteur de la tyrosine kinase du récepteur. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997). </li><li> Bos,M. Mendelsohn, J. Kim, YM, Albanell, J. Fry, DW, et Baselga, J. PD153035, un inhibiteur de tyrosine kinase, empêche l'activation du récepteur épidermique de facteur de croissance et inhibe la croissance des cellules cancéreuses dans un récepteur de numéro de façon dépendante. Clin. Cancer Res. 3, 2099-2106 (1997). </li><li> Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Léopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M. Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, et Elder, l'utilisation différentielle JT et la localisation des tyrosine kinases récepteurs erbB dans la peau par rapport aux kératinocytes normaux et malins. néoplasies. 3, 339-350 (2001). </li><li> Klutchko, SR, Zhou, H., Les hivers, RT, Tran, TP, ponts, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., Smaill, JB, Denny, WA, et Showalter, les inhibiteurs de tyrosine kinase HD. 19. 6-alknyamides de 4-4-anilinoquinazolines et anilinopyrido [3,4-d] pyrimidines comme inhibiteurs irréversibles de la famille erbB de récepteurs à tyrosine kinase. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006). </li><li> Kunii, K. Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M. Di Bacco, A., Elbi, C., &amp; Lutterbach, B. FGFR2-amplifiés gastriques lignées de cellules cancéreuses nécessitent FGFR2 et ErbB3 de signalisation pour la croissance et la survie. Cancer Res. 68, 2340-2348 (2008). </li><li> Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Sharma, SV, Bruges, J., Meyerson, M., Settleman, J . &amp; Gray, NS Une approche guidée par la structure à la création d'inhibiteurs de FGFR covalentes. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010). </li><li> Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, les savoirs traditionnels, Hwang, O., Crickard, K., &amp; Panek RL L'inhibition de l'activité du FGF-1 récepteur tyrosine kinase de PD 161570 , une nouvelle protéine-Tyrosine kinase. Life Sci. 62 143-150 (1998). </li><li> Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, les savoirs traditionnels, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, &amp; Keiser, JA In vitro caractérisation pharmacologique de PD 166285, un puissant nouveau nanomolaire et largement actif inhibiteur de protéine tyrosine kinase. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997). </li></ol>

The Human Phospho-RTK est une alternative économique et rapide aux méthodes traditionnelles telles que l&#39;immunoprécipitation (IP) de l&#39;Ouest pour les changements de dépistage de la phosphorylation RTK. En utilisant cette méthode, les niveaux relatifs de 42 phospho-RTK ont été projetés simultanément en utilisant un seul échantillon de cellules MDA-MB-453 ou un lysat de cellules Kato III. En outre, ce test tableau dont 2,5 heures de temps de manipulation, ce qui rend cette méthode beaucoup plus efficace que de temps effectuez plusieurs IP-Western. En utilisant une méthode de détection par chimiluminescence, aucun équipement spécialisé delà de ce qui est généralement utilisé pour recueillir des données occidentaux était nécessaire. Les tableaux sont sensibles et peuvent être utilisées pour comparer les changements de phosphorylation causées à la fois par ligand et le traitement inhibiteur. Cette méthode permet également l&#39;évaluation de la sélectivité inhibiteur de hors-cible RTK. Réponses positives peuvent en outre être évaluée en utilisant un dosage quantitatif comme un test ELISA. Pour utiliser efficacement des tableaux pour détecter des changementsde la phosphorylation, certaines lignes directrices clés expérimentaux doivent être suivies. Tout d&#39;abord, les expériences devraient inclure des échantillons de contrôle appropriés. Par exemple, dans ces expériences l&#39;effet des inhibiteurs de cellules MDA-MB-453 ou Kato III lysats ont été mesurées sur des échantillons de lysat préparés le jour même. Seules les données de tableau qui sont collectées au sein de la même expérience doit être analysé afin de minimiser les variations de signal en raison des différences de manipulation d&#39;échantillon, le temps d&#39;incubation, la technique de la pipette, ou la technique de lavage. Comparaison des intensités de signal entre deux analytes sur la même membrane n&#39;est pas recommandé, car les anticorps de capture n&#39;ont pas été sélectionnés pour avoir des affinités parallèles.

<table><tbody><tr><td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=ary001%C2%A0%C2%BB%20target=" _blank>Human Phospho-RTK Array Kit</a></td><td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=ary001%C2%A0%C2%BB%20target=" _blank><img src="/img/new_window.png%C2%A0%C2%BB%20/&gt;%20R&amp;%20D%20Sytems&lt;/a&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;ARY001&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Aprotinin&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Sigma&lt;/td&gt;&lt;td&gt;A6279&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Leupeptin&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Tocris&lt;/td&gt;&lt;td&gt;1167&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Pepstatine%20A&lt;/td&gt;&lt;td&gt;Tocris&lt;/td&gt;&lt;td&gt;1190&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;MDA-MB-453%20cellules&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;&lt;tr&gt;&lt;td&gt;Kato%20III&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;/td&gt;&lt;/tr&gt;%20&lt;tr&gt;&lt;td&gt;cellules&lt;a%20href=" http: target="_blank">Domaine EGF humain recombinant NRG1-bêta 1/HRG1-bêta 1</a></td><td>R&amp; D Systems</td><td>396-HB-050</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.rndsystems.com/product_results.aspx?k=232-fa%C2%A0%C2%BB%20target=" _blank>FGF humain recombinant acide (aa 16-155)</a></td><td>R&amp; D Systems</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>HDS 029</td><td>Tocris</td><td>2646</td><td></td></tr><tr><td>153035</td><td>Tocris</td><td>1037</td><td></td></tr><tr><td>158780</td><td>Tocris</td><td>2615</td><td></td></tr><tr><td>173074</td><td>Tocris</td><td>3044</td><td></td></tr><tr><td>161570</td><td>Tocris</td><td>3724</td><td></td></tr><tr><td>166285</td><td>Tocris</td><td>3785</td><td></td></tr><tr><td>Dosage BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffer Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes et pointes</td><td></td><td></td><td></td>de pipette</tr><tr><td>Gants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td></td>déminéralisée ou distillée</tr><tr><td>Pince à épiler</td><td></td><td></td><td></td>à pointe plate</tr><tr><td>Plate-forme à bascule agitateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Récipients en plastique d’une capacité de 50 ml</td><td></td><td></td><td>Pour le lavage des réseaux Protecteur</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>feuille transparente</td></tr><tr><td>en plastique Pellicule</td><td></td><td></td><td></td>plastique</tr><tr><td>Lingettes de laboratoire absorbantes</td> Essuie-tout <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>en papier</td></tr><tr>Cassette <td></td><td></td><td></td><td>d’autoradiographie</td></tr><tr><td>Révélateur</td><td></td><td></td><td></td>de film</tr><tr><td>Kodak BioMax Light Film</td><td>Carestream Health</td><td>178 8207</td><td></td></tr><tr><td>Révélateur</td><td></td><td></td><td></td>de film</tr><tr><td>Image Station 4000MM PRO</td><td>Carestream Health</td><td></td><td>L’imageur de chimiluminescence compatible avec la collecte de données occidentales peut être utilisé à la place du film et d’un film promoteur.</td></tr><tr><td>Epson Perfection Scanner</td><td>Epson</td><td>V750 PRO</td><td>Scanner à plat avec adaptateur de transparence capable de mode de transmission Logiciel d’analyse d’images</td></tr><tr><td></td><td>GE, WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc</td><td></td>. <td>ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, ou tout autre programme compatible</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ordinateur capable d’exécuter un logiciel d’analyse d’images et Microsoft Excel.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

les changements de profilage dans phosphorylation tyrosine kinase du récepteur à l&#39;aide des puces à anticorps - publicité

Profiling Changes in Receptor Tyrosine Kinase Phosphorylation using Antibody Arrays - ADVERTISEMENT

Le dérèglement de la tyrosine kinase du récepteur (RTK) expression et la phosphorylation est fréquemment associée à la propagation développement et métastatique des cellules cancéreuses 1-3. D&#39;importants efforts ont été concentrés sur les inhibiteurs de développement pour cibler RTK spécifiques et interrompre les voies de signalisation aberrantes associées à des états pathologiques 4-7. L&#39;objectif de cette étude était de mesurer les effets d&#39;un certain nombre d&#39;inhibiteurs de la phosphorylation sur RTK. Cette étude a utilisé l&#39;homme Phospho-RTK tableau, qui est un immunodosage en sandwich la membrane afin de surveiller les augmentations ou diminutions de la phosphorylation des RTK nombreux simultanément dans un seul échantillon. Dans cet essai, les deux RTK phosphorylée et non phosphorylée présente dans un échantillon de lysat sont capturées par des anticorps distincts imprimés en double à travers une membrane de nitrocellulose de la taille d&#39;une lame de microscope. Après lavage, les tableaux sont mis à incuber avec des anticorps anti-phospho-tyrosine-peroxydase de raifort (HRP),qui prend en sandwich avec RTK phosphorylés capturés sur le tableau. Après une étape de lavage élimine les tableaux sont incubés avec des réactifs chimiluminescents. Signal produit à chaque spot réseau est proportionnelle à la quantité de phospho-protéine liée par chaque anticorps de capture. Dans ces expériences, les tableaux ont été utilisés pour mesurer les augmentations de la phosphorylation suite à une stimulation du ligand soit le cancer du sein MDA-MB-453 ou KATO III cellules cancéreuses gastriques, ainsi que pour caractériser une diminution de la phosphorylation associés au traitement des cellules avec des inhibiteurs sélectifs envers ErbB ou les membres de la famille FGF R.

Tableaux Proteome anticorps profils sont un moyen pratique et économique pour détecter des changements dans la tyrosine kinase du récepteur (RTK) phosphorylation sans effectuer de nombreuses immunoprécipitation (IP) Westerns. Le tableau RTK ARY001 humain permet la mesure qualitative des RTK multiples dans un seul échantillon en utilisant une détection par chimiluminescence.

Les changements de profilage dans phosphorylation tyrosine kinase du récepteur à l&#39;aide des puces à anticorps - Publicité

The dysregulation of receptor tyrosine kinase (RTK) expression and phosphorylation is frequently associated with the development and metastatic spread of ...

profiling-changes-receptor-tyrosine-kinase-phosphorylation-using

Without Section

Les aspects techniques du spectacle LIPS (Systèmes immunoprécipitation luciférase) sont décrits. L'approche globale consiste à exprimer des gènes codant pour des antigènes chimériques fusionnées à luciférase de Renilla (RUC) dans les cellules de mammifères. Ruc-antigène brut extraits sont ensuite préparés et, sans purification, employées dans des essais d'immunoprécipitation de quantifier les anticorps.

Profilage anticorps par immunoprécipitation Systèmes luciférase (LIPS)

Western blot est une technique d'analyse utilisée pour détecter des protéines spécifiques dans un échantillon donné d'homogénat de tissu ou de l'extrait.

Western Blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

Des mutations dans le récepteur kisspeptine (KISS1R) sont associés à des troubles de la reproduction chez les patients. Nous décrivons ici comment introduire des mutations d'intérêt dans la séquence riches en GC d'KISS1R ainsi que l'utilisation de constructions KISS1R de caractériser la voie de dégradation du récepteur par immunoprécipitation et Western...

Mutagenèse et d&#39;analyse des mutations génétiques dans la séquence riches en GC récepteur KISS1 identifiés chez l&#39;homme souffrant de troubles de la reproduction

FRET basée sur les journalistes sont de plus en plus utilisées pour suivre les activités kinases et de phosphatases dans les cellules vivantes. Nous décrivons ici une méthode sur la façon d'utiliser FRET basé journalistes afin d'évaluer le cycle cellulaire dépendante des changements dans la phosphorylation cible.

Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET

Kinase Leucine Rich Repeat 2 est une kinase multidomaine grandes, les mutations dans lesquelles sont la cause génétique la plus courante de la maladie de Parkinson. Analyse de l'activité kinase de cette protéine s'est révélée être un outil crucial dans la compréhension de la biologie et le dysfonctionnement de cette protéine. Dans ce...

Dosage de l&#39;activité kinase de LRRK2 In vitro</em

Une méthode d'utilisation de l'état solide nanopores pour surveiller l'adsorption non-spécifique de protéines sur une surface inorganique est décrite. La méthode utilise le principe résistif impulsion, permettant à l'adsorption à sonder en temps réel et à la molécule seul niveau. Parce que le processus d'adsorption est seule protéine loin de l'équilibre, nous proposons l'emploi de réseaux parallèles de nanopores de synthèse, permettant pour la détermination quantitative du taux de réaction de...

Surveillance des protéines par adsorption à semi-conducteurs Nanopores

Nous présentons une analyse des flux à haut débit par cytométrie de déterminer l'activité phagocytaire de l'antigène-anticorps spécifiques à partir d'échantillons cliniques, en utilisant fluorescentes recouvertes d'antigène perles et une lignée cellulaire monocytaire exprimer plusieurs récepteurs Fc-récepteur et d'utilisation fournissant des déterminations de l'activité phagocytaire dans un standardisés et façon reproductible pour tout antigène d'intérêt.

Déterminer l&#39;activité phagocytaire des échantillons d&#39;anticorps cliniques

L'abondance des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses en cluster influe fortement sur la force synaptique. Cette méthode permet de quantifier les récepteurs des neurotransmetteurs marquage fluorescent en trois dimensions avec une seule synapse...

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu'ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l'espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l'apoptose subséquente.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Nous avons développé et validé un ensemble de petite empreinte de chemostats miniatures construits à partir de pièces facilement disponibles pour un faible coût. Évolution résulte physiologiques et expérimentales sont similaires à chemostats plus grand volume. Le tableau ministat fournit une plate-forme compacte, peu coûteux et accessible pour les expériences en chémostat traditionnels, la génomique fonctionnelle et les applications de criblage chimique.

Conception et utilisation des tableaux chémostat multiplexés

Découvrez le profilage de la phosphorylation des récepteurs tyrosine kinase dans les cellules cancéreuses MDA-MB-453 et KATO III à l'aide de puces à anticorps. Cette méthode multiplexée permet d'évaluer l'efficacité des inhibiteurs sélectifs ErbB et FGFR.

Les changements de profilage dans phosphorylation tyrosine kinase du récepteur à l'aide des puces à anticorps - Publicité

Explorer plus de vidéos