Name: Hétérotypique tridimensionnelle In Vitro Modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de linitiation et la progression du cancer des ovaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Découvrez la modélisation 3D hétérotypique pour étudier les interactions stroma-épithéliales dans le cancer de l'ovaire. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes d'initiation tumorale et de progression.

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Cette recherche a été effectuée à la Keck School of Medicine, University of California, Etats-Unis, et l&#39;University College London, Royaume-Uni. KL est financé par l&#39;Institut national de la Santé subvention de 5 U19 CA148112-02. BG a été financé par une subvention de projet de la charité appel Eve oncologie gynécologique (Royaume-Uni). Certains de ces travaux entrepris à UCLH / UCL a été en partie le financement du ministère de la Santé INDH recherche biomédicale système de financement du Centre.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La biologie du stade précoce de cancer ovarien épithélial (COE) est mal comprise. Peut-être l&#39;un des principaux obstacles dans ce domaine depuis de nombreuses années a été le manque de compréhension des origines tissulaires spécifiques de la maladie, et de l&#39;importance du rôle du microenvironnement dans le développement des COE. Au cours des dernières années, est devenu clair que des COE est une maladie hétérogène avec de multiples sous-types distincts histophathological, probablement avec différentes origines c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Fournisseur </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> PolyHEMA, adapté pour la culture cellulaire </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P3932 </td></tr><tr><td> Moléculaire éthanol de qualité biologie </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E7023 </td></tr><tr><td> Eau stérile pour culture cellulaire </td><td> VWR </td><td> 12001-356 </td></tr><tr><td> MCDB105 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M6395 </td></tr><tr><td> Milieu 199 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M2154 </td></tr><tr><td> Hyclone sérum fœtal bovin </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30088.03 </td></tr><tr> &lt;td&gt; gentamicine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1397 </td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2942 </td></tr><tr><td> pBABE-hygro-hTERT </td><td> Addgene </td><td> 1773 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> VWR </td><td> 12001-766 </td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-072 </td></tr><tr><td> Cellule filtre (40 ou 70 microns) </td><td> VWR </td><td> 21008-949 21008-952 </td></tr><tr><td> Anti-anticorps protéine de surface des fibroblastes, clone 1B10 </td><td> Sigma </td><td> F4771 </td></tr><tr><td> Anti-pan-cytokératine anticorps (C11) </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8018 </td></tr><tr><td> Polybrène (hexadiméthrine bromure) </td><td> Sigma </td><td> 107689 </td></tr><tr><td> TeloTAGGG télomérase PCR ELISA PLUS </td><td> Roche </td><td> 12013789001 </td></tr><tr><td> TeloTAGGG Assay longueur des télomères </td><td> Roche </td><td> 12209136001 </td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 1. Et du matériel visés dans la présente étude.

hétérotypique tridimensionnelle<em&gt; in vitro</em&gt; modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de l&#39;initiation et la progression du cancer des ovaires

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Cancers épithéliaux de l&#39;ovaire (COU) sont la principale cause de décès par cancer gynécologique dans les sociétés occidentales. Malgré les progrès dans les traitements chirurgicaux et l&#39;amélioration des chimiothérapies à base de platine, il ya eu peu d&#39;amélioration dans les taux de survie des COE pendant plus de quatre décennies 1,2. Bien que les tumeurs de stade I ont des taux de survie à 5 ans&gt; 85%, les taux de survie pour le stade III / IV maladies sont &lt;40%. Ainsi, les taux élevés de mortalité pour COE pourrait être considérablement diminué si les tumeurs ont été détectées au plus tôt, plus traitables les étapes 3-5. À l&#39;heure actuelle, la base génétique moléculaire et biologique de stade de développement précoce de la maladie est mal comprise. Plus précisément, on sait peu au sujet du rôle du microenvironnement tumoral lors de l&#39;initiation, mais les facteurs de risque connus pour la COU (par exemple l&#39;âge et la parité) suggèrent que le microenvironnement joue un rôle clé dans la genèse précoce de la COU. Nous avons donc développé des modèles tridimensionnels hétérotypiquesà la fois de l&#39;ovaire normal et du début des cancers de l&#39;ovaire stade. Pour l&#39;ovaire normal, nous co-cultivées surface épithéliale ovarienne normale (IOSE) et des fibroblastes du stroma normale (INOF) cellules, immortalisé par transduction retrovrial de la sous-unité catalytique de la télomérase humaine holoenzyme (hTERT) pour prolonger la durée de vie de ces cellules en culture. Pour modéliser les premières étapes de la transformation cellulaire épithélial de l&#39;ovaire, la surexpression de l&#39;oncogène dans les cellules CMYC IOSE, nouveau co-cultivées avec des cellules INOF. Ces modèles hétérotypiques ont servi à étudier les effets du vieillissement et de la sénescence sur la transformation et l&#39;invasion des cellules épithéliales. Ici, nous décrivons les étapes méthodologiques dans le développement de ces modèles en trois dimensions; ces méthodologies ne sont pas spécifiques au développement de l&#39;ovaire normal et les tissus du cancer de l&#39;ovaire, et pourrait être utilisée pour étudier les autres types de tissus où les interactions cellules stromales et épithéliales sont un élément fondamental aspect de l&#39;entretien des tissus et didéveloppement malad.

Nous décrivons les méthodes pour établir<em&gt; In vitro</em&gt; Hétérotypiques modèles tridimensionnels comprenant des fibroblastes et la surface de l&#39;ovaire ou de l&#39;ovaire normale des cellules ovariennes cancéreuses épithéliales. Nous discutons de l&#39;utilisation de ces modèles pour l&#39;étude du stroma-épithéliales interactions qui se produisent au cours du développement du cancer de l&#39;ovaire.

Hétérotypique tridimensionnelle<em&gt; In Vitro</em&gt; Modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de l&#39;initiation et la progression du cancer des ovaires

Les cancers épithéliaux de l'ovaire (CEO) sont la principale cause de décès par tumeur maligne gynécologique dans les sociétés occidentales. Malgré les progrès de la chirurgie...

L'objectif général de l'expérience suivante est de générer des modèles tridimensionnels typiques du développement du cancer de l'ovaire à un stade précoce. Tout d'abord, produire des lignées cellulaires immortalisées H turt issues de tissus primaires d'épithélium ovarien normal et de fibroblastes. Ensuite, afin de recréer l'architecture in vivo et les interactions complexes entre cellules présentes dans l'ovaire, réaliser une co-culture des lignées cellulaires épithéliales et stromales dans des modèles sphéroïdes tridimensionnels, puis fixer et colorer les cultures d'organoides et analyser l'expression de marqueurs spécifiques afin d'étudier les caractéristiques moléculaires des interactions stromales et épithéliales.Les résultats obtenus montrent comment des altérations dans le compartiment des cellules stromales de modèles 3D typiques peuvent influencer le phénotype des cellules épithéliales cultivées en co-culture. Les modèles tridimensionnels typiques peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer de l'ovaire, telles que l'exploration des origines de cette maladie et l'élucidation du rôle du microenvironnement stromal dans l'initiation et le développement tumoral. Les applications de ces techniques s'étendent vers le diagnostic et le traitement des maladies, par rapport à d'autres méthodes de culture 3D.Cette technique peut être appliquée à une gamme plus étendue de volumes de culture cellulaire et à diverses applications en aval. Par exemple, les cultures tridimensionnelles homotypiques peuvent être utilisées pour des tests de médicaments in vitro. Cette approche peut également être appliquée à d'autres systèmes modèles, comme dans l'étude d'autres types de tumeurs solides ou des maladies bénignes.Transportez le tissu ovarien frais au laboratoire de culture cellulaire dans un milieu de croissance pour fibroblastes ovariens normaux immortalisés, supplémenté d'antibiotiques et d'antimycosiques supplémentaires. Lavez l'échantillon trois fois avec cinq millilitres de PBS afin d'éliminer toutes les cellules épithéliales encore faiblement attachées au tissu. Ensuite, transférez l'échantillon avec le PBS dans une boîte de culture P 100 propre. À l'aide d'instruments stériles, transférez le tissu dans une deuxième boîte de culture P 100 sèche et propre.Coupez le tissu en morceaux de 0,5 centimètre carré et transférez chaque morceau dans une boîte de Pétri P 100 séparée. Continuez à couper le tissu en morceaux de moins d'un millimètre carré de taille. Ajoutez ensuite 20 millilitres de milieu INOF GM et cultivez en surveillant la croissance cellulaire par microscopie de phase.Vérifiez que les cellules adhèrent à la boîte dans les 24 heures. Surveillez la croissance cellulaire à l’aide d’une microscopie en contraste de phase. Les cellules adhèrent généralement à la boîte dans les 24 heures. Après une semaine, retirez les tissus non adhérents par aspiration, renouvelez le milieu, puis nourrissez les cultures deux fois par semaine pendant une à trois semaines, lorsque les colonies cellulaires atteignent environ 500 microns de diamètre.Isolez les clones à l'aide de triplicats et de disques de clonage revêtus. Afin de confirmer la présence de cellules fibroblastiques à 100 %, ensemencez un échantillon de la lignée cellulaire sur des lamelles en verre et réalisez une coloration immunofluorescente pour un marqueur fibroblastique, un marqueur épithélial et un marqueur de cellule endothéliale.Un jour avant la transduction rétrovirale du passage H Turt, isoler les fibroblastes ovariens normaux d'une seule boîte P 100 en trois boîtes P 100. Le surnageant viral préparé peut être acheté ou produit en interne selon des protocoles standard de transfection simultanée de cellules HEC 2 9 3 T. Pour préparer la solution de poly-héma, peser 1,5 gramme de poly-héma et placer dans un flacon stérile.Ajouter 95 millilitres d'éthanol absolu de qualité pour biologie moléculaire et 5 millilitres d'eau distillée de qualité pour culture cellulaire. Placer la solution de poly-HEMA dans un bain-marie à 65 degrés Celsius jusqu'à dissolution complète. Recouvrir les boîtes de culture cellulaire avec une solution fraîchement préparée de poly-HEMA.Laisser sécher à l'air les boîtes de culture cellulaire à l'intérieur de la hotte à flux laminaire. Un mouvement doux de basculement sur une plateforme agitatrice peut être utilisé pour assurer un revêtement uniforme des boîtes ou des flacons de grande taille. Si la solution de polyus sèche trop rapidement, la surface ne sera pas lisse.Si désiré, prétraitez les fibroblastes avant la culture en 3D ; par exemple, pour induire la sénescence, traitez les cellules avec des doses sub-létales de peroxyde d'hydrogène. Récupérez et amplifiez les cultures de cellules INOF et épithéliales in vitro afin d'obtenir suffisamment de cellules pour établir des stéroïdes hétérotopiques en 3D. Après un lavage au PBS de cinq minutes, ajoutez 15 millilitres de milieu dans la plaque en poly-héma.Entre-temps, ajoutez de la trypsine aux cellules de fibroblastes ovariens normaux immortalisés afin de les détacher de la boîte de culture. Après trois à cinq minutes, neutralisez la trypsine avec un volume équivalent de milieu de culture et récoltez les cellules par centrifugation. Resuspendez le culot cellulaire dans cinq millilitres de milieu et mélangez soigneusement en pipetant plusieurs fois ou en vortexant doucement.Ensuite, utilisez un échantillon de 10 microlitres pour dénombrer les cellules viables à l’aide de bleu de trypan. Ajoutez maintenant 4 millions de cellules INOF au milieu déjà distribué dans la plaque revêtue de poly-héma. Complétez le volume du milieu de culture jusqu’à 20 millilitres et incubez à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone.Surveiller l'agrégation cellulaire en stéroïde multicellulaire par microscopie de phase afin de nourrir à nouveau les cultures de sphéroïdes S tous les deux à trois jours. Incliner les plaques sur une pipette. Laisser les sphéroïdes se déposer, puis retirer soigneusement environ 16 millilitres du milieu épuisé à l’aide d’une pipette de cinq millilitres.Ajoutez 16 millilitres de milieu frais à la culture et remettez-la dans l'incubateur le jour sept. Créez des cultures hétérotypiques en ajoutant des cellules épithéliales aux fibroblastes phe. Préparez d'abord des suspensions de cellules épithéliales ovariennes par trypsine, comme décrit précédemment, après avoir dénombré les cellules.Laver une fois dans le milieu GM INOF afin d'éviter tout transfert de facteurs de croissance provenant du milieu de croissance épithélial. Après renouvellement du milieu des cultures d'OID fibroblastes, ajouter les cellules épithéliales selon un ratio de quatre fibroblastes pour une cellule épithéliale. Les OID hétérotopiques dans le milieu GM INOF nécessitent un renouvellement du milieu tous les deux à trois jours pendant encore 14 jours.Pour l'immunohistochimie, fixer le PHE avec du formol tamponné neutre, centrifuger le PHE et remplacer le formol par de l'éthanol à 70 %. Procéder au traitement dans la paraffine en utilisant des protocoles standards employés pour les tissus humains. Les stéroïdes inclus dans la paraffine peuvent être coupés en sections et colorés en H-E ou avec des marqueurs moléculaires spécifiques par immunohistochimie.Alternativement, lavez les stéroïdes dans du PBS et fixez-les dans du paraformaldéhyde à 4 %. Ensuite, incluez les échantillons dans un milieu OCT et congélez-les rapidement pour la coupe au cryostat et la coloration immunofluorescente, suivies d'une analyse par cytométrie en flux. Lavez les stéroïdes dans du PBS et dissociez-les par digestion à la trypsine ou à l'Accutase à 37 degrés Celsius.La dissociation complète des stéroïdes en une suspension de cellules uniques peut être favorisée en aspirant et expulsant la solution plusieurs fois à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Veillez à ne pas endommager les cellules. Neutralisez la réaction avec un volume égal de milieu de culture et éliminez les agrégats cellulaires en faisant passer la suspension à travers un tamis cellulaire de 40 à 70 microns. Ensuite, centrifugez les cellules pour former un culot, lavez-les avec du PBS, comptez-les, resuspendez le nombre désiré de cellules dans un tampon facts et réalisez la coloration selon les instructions du fabricant. Dans notre laboratoire, nous avons partiellement transformé des cellules épithéliales ovariennes et nous avons mis en co-culture ces cellules avec des fibroblastes ovariens normaux et sénescentes afin de modéliser le développement d’un cancer de l’ovaire au stade précoce.Dans un ovaire pré-ménopausé, la coloration immunofluorescente de fibroblastes ovariens normaux immortalisés h hert montre que les fibroblastes ovariens normaux primaires ainsi que les fibroblastes ovariens normaux immortalisés expriment la protéine spécifique des fibroblastes, mais n'expriment pas la cytokeratine 7 et expriment menton. Les cellules de fibroblastes ovariens normaux cultivées seules en 3D dans un gel de PHE présentent une morphologie fusiforme et une matrice extracellulaire abondante. Ici, les fibroblastes ovariens normaux ont été exposés au peroxyde d'hydrogène afin d'induire un état de sénescence pendant sept jours, puis cultivés avec des cellules épithéliales ovariennes partiellement transformées pendant 14 jours.Pour distinguer les deux types cellulaires, les stéroïdes obtenus ont été marqués par immunohistochimie pour mim-1, utilisé comme marqueur de prolifération, et pour la pan-cytokératine, utilisée comme marqueur épithélial. La quantification des données suggère que le microenvironnement âgé favorise les caractéristiques néoplasiques de cellules épithéliales partiellement transformées, tandis qu'un microenvironnement normal inhibe la progression néoplasique. Des caractéristiques histologiques des cellules normales et malignes, non détectables lorsque les cellules sont cultivées en monocouche, sont restaurées. Lorsque les cellules sont transférées en culture sphéroïde, par exemple, les caractéristiques histologiques des cancers ovariens à cellules claires peuvent être détectées dans des cultures tridimensionnelles de lignées cellulaires de cancer ovariens à cellules claires, mais pas dans des cultures en monocouche des mêmes cellules.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place des cultures tridimensionnelles typiques permettant d'étudier les interactions entre les cellules épithéliales et les cellules stromales au cours des premières étapes de la genèse tumorale. Lors de la mise en place d'une culture en 3D, il est important d'ajuster le nombre de cellules en fonction de l'application en aval, en tenant compte d'une éventuelle perte de matériel pendant le traitement.Une fois maîtrisées, les cultures en 3D peuvent être mises en place en une heure en suivant cette procédure. D'autres méthodes, telles que la cytométrie en flux combinée à l'analyse d'expression génique par microréseaux, peuvent être réalisées afin d'analyser les modifications globales de l'expression génique qui surviennent dans les cultures typiques en 3D mais qui ne sont pas détectées dans des conditions de culture en monocouche. Cela permettra d'élucider les voies de signalisation bidirectionnelles qui se produisent spécifiquement dans un microenvironnement de culture en 3D.

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Le dosage jeu mésothéliales décrite ici prend avantage des cellules marquées par fluorescence et la microscopie vidéo time-lapse de visualiser et de mesurer quantitativement les interactions de sphéroïdes multicellulaires cancer de l'ovaire et les monocouches de cellules mésothéliales. Ce test modélise les étapes précoces de métastases du cancer de l'ovaire.

Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l&#39;ovaire

Dans cette vidéo, nous montrons le développement d’un modèle tridimensionnel in vitro de la muqueuse de la cavité péritonéale. Cette culture organotypique peut aider à étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Modélisation des métastases du cancer de l’ovaire dans la muqueuse de la cavité péritonéale : une méthode pour établir un modèle 3D in vitro de la muqueuse péritonéale

Ici, nous présentons un protocole de co-culture en trois dimensions, qui est utile pour étudier les interactions multicellulaires et la modulation dépendante de la matrice extracellulaire du comportement des cellules cancéreuses. Dans ce modèle expérimental, les cellules cancéreuses sont cultivées sur des gels de collagène intégrés à des fibroblastes humains associés au cancer.

En trois dimensions modèle de co-culture tumeur stromale-Interaction

Ici, nous présentons un protocole pour construire un modèle in vitro tridimensionnel de la muqueuse de la cavité péritonéale, composé de cellules mésothéliales humaines primaires et de fibroblastes superposés avec une matrice extracellulaire, comme outil pour étudier l’adhésion, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses de l’ovaire.

Modélisation des étapes précoces de cancer de l&#39;ovaire Diffusion dans une culture organotypique de la cavité péritonéale humain

Nous faisons la démonstration d’une méthode pour générer des substituts du cancer du sein en 3D, qui peuvent être cultivés à l’aide d’un système de bioréacteur à perfusion pour fournir de l’oxygène et des nutriments. Après la croissance, les substituts sont fixés et transformés en paraffine pour l’évaluation des paramètres d’intérêt. L’évaluation de l’un de ces paramètres, la densité cellulaire, est expliquée.

Préparation et analyse des<em&gt; In vitro</em&gt; Trois Breast Dimensional Carcinome Surrogates

Pour étudier la progression de la tumeur ovarienne dans un modèle physiologiquement pertinente, sphéroïdes multicellulaires ont été cultivées dans un microdispositif dans l'écoulement de fluide simulé. Ce modèle 3D dynamique émule l'environnement intrapéritonéale avec les composants cellulaires et mécaniques où les métastases du cancer de l'ovaire se produit.

Modélisation Comportement cancer de l&#39;ovaire multicellulaire Spheroid dans un Microdevice Dynamic 3D péritonéale

Les cellules souches du cancer de l’ovaire (OCSC) sont responsables de l’initiation du cancer, de la récidive, de la résistance thérapeutique et des métastases. La niche vasculaire OCSC est considérée comme favorisant l’auto-renouvellement des OCSC, conduisant à la chimiorésistance. Ce protocole fournit la base pour établir un modèle reproductible de niche vasculaire OCSC in vitro.

Évaluation des propriétés angiogénétiques des cellules souches du cancer de l’ovaire à l’aide du système de co-culture tridimensionnel, NICO-1

Ce protocole décrit l’établissement d’un modèle tridimensionnel (3D) ex vivo de l’interaction cellule-épiploon cancéreux. Le modèle fournit une plate-forme pour élucider les mécanismes pro-tumoraux dans la niche adipeuse et pour tester de nouvelles thérapies.

Un modèle ex vivo de métastases péritonéales du cancer de l’ovaire à l’aide d’un épiploon humain

Il existe un besoin critique de modèles de cancer 3D qui capturent la diaphonie hétérocellulaire pour étudier les métastases cancéreuses. Notre étude présente la génération d’épithélium stromal hétéromulticellulaire dans un environnement sans échafaudage qui peut être utilisé pour étudier l’invasion et les distributions spatiales cellulaires.

Cellules stromales hétéromulticellulaires dans des cultures 3D sans échafaudage de cellules cancéreuses épithéliales pour stimuler l’invasion

Ce protocole détaille le développement de modèles murins de carcinome séreux de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC) in vitro et in vivo. De la dérivation d’organoïdes murins de trompes de Fallope, leur modification génétique pour récapituler la génétique HGSOC humaine, et leur introduction dans la bourse ovarienne de souris syngéniques pour le développement in vivo de tumeurs.

Développement de lignées organoïdes dérivées de souris à partir de cellules épithéliales de trompes de Fallope pour la modélisation du carcinome de l’ovaire séreux de haut grade

Découvrez la modélisation 3D hétérotypique pour étudier les interactions stroma-épithéliales dans le cancer de l'ovaire. Cette méthode permet d'explorer les mécanismes d'initiation tumorale et de progression.

Hétérotypique tridimensionnelle In Vitro Modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de linitiation et la progression du cancer des ovaires (Vidéo) | JoVE Journal

Hétérotypique tridimensionnelle

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