Hétérotypique tridimensionnelle In Vitro Modélisation des interactions stroma-épithéliales lors de l'initiation et la progression du cancer des ovaires

L’objectif général de l’expérience suivante est de générer des modèles tridimensionnels typiques du développement du cancer de l’ovaire à un stade précoce. Tout d’abord, générer des lignées cellulaires immortalisées de tourte H dérivées de tissus épithéliales ovariens primaires et normaux et de fibroblastes. Ensuite, pour recréer l’architecture in vivo et les interactions cellulaires complexes présentes dans la co-culture ovarienne, les lignées cellulaires épithéliales et stromales dans des modèles tridimensionnels de sphéroïdes S procèdent à la fixation et à la coloration des cultures organoïdes et analysent l’expression de marqueurs spécifiques afin d’étudier les caractéristiques moléculaires des interactions épithéliales stromales.

Les résultats obtenus montrent comment les altérations du compartiment cellulaire stromal des modèles 3D typiques peuvent influencer le phénotype des cellules épithéliales co-cultivées. Des modèles typiques tridimensionnels peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le cancer de l’ovaire, telles que l’exploration des origines de cette maladie et l’élucidation du rôle du microenvironnement stromal dans l’initiation et le développement des tumeurs. Les applications de ces techniques s’étendent au diagnostic et au traitement des maladies par rapport aux autres méthodes de culture 3D.

Cette technique peut être appliquée à un plus large éventail de volumes de culture cellulaire et d’applications en aval. Par exemple, les cultures homo 3D et les cultures typiques peuvent être utilisées pour les tests de dépistage de drogues in vitro. Cette approche peut également être appliquée à d’autres systèmes modèles, comme dans l’étude d’autres types de tumeurs solides ou dans les maladies bénignes.

Transportez le tissu ovarien frais au laboratoire de culture cellulaire dans un milieu de croissance de fibroblastes ovariens normaux immortalisé, complété par des antibiotiques et des bouffonneries supplémentaires. Lavez l’échantillon trois fois avec cinq millilitres de PBS pour éliminer toutes les cellules épithéliales qui restent lâchement attachées au tissu. Ensuite, transférez l’échantillon plus le PBS dans une boîte de culture P 100 propre À l’aide d’instruments stériles, transférez le tissu dans une deuxième boîte de culture propre P 100 sèche.

Coupez le mouchoir en morceaux de 0,5 centimètre carré et transférez chaque morceau dans un plat P 100 séparé. Continuez à couper le tissu en morceaux de moins d’un millimètre carré. Ajoutez ensuite 20 millilitres de milieu INOF GM et de culture Surveillez la croissance cellulaire à l’aide de la microscopie de phase.

Vérifiez que les cellules adhèrent à la parabole dans les 24 heures. Surveillez la croissance cellulaire à l’aide de la microscopie de phase Les cellules adhèrent généralement à la boîte dans les 24 heures après une semaine. Retirez tout tissu non adhérent par aspiration, réapprovisionnez le milieu et réalimentez ensuite les cultures deux fois par semaine dans un délai d’une à trois semaines lorsque les colonies cellulaires ont une taille d’environ 500 microns.

Isolez les clones à l’aide de trips et de disques de clonage enrobés. Afin de confirmer 100 % cellules fibroblastiques. Plaquez un échantillon de la lignée cellulaire sur des lamelles de verre et effectuez une coloration immunofluorescente pour un marqueur fibroblastique, un marqueur épithélial et un marqueur de cellules endothéliales.

Un jour avant la transduction rétrovirale du passage de H Tourt, les cellules normales des fibroblastes ovariens isolent d’une seule boîte P 100 dans trois boîtes P 100. Des supnatan viraux préfabriqués peuvent être achetés ou produits en interne en utilisant des protocoles standard pour la transfection de cellules T HEC 2 9 3. Pour préparer la solution de poly Hema, pesez 1,5 gramme de poly hema et placez-le dans une bouteille stérile.

Ajoutez 95 millilitres d’éthanol absolu de biologie moléculaire et cinq millilitres d’eau distillée de culture cellulaire. Placez la solution de poly Hema dans un bain-marie à 65 degrés Celsius jusqu’à dissolution complète. Enduisez les boîtes de culture tissulaire d’une solution de poly Hema fraîchement préparée.

Faites sécher à l’air libre les boîtes de culture cellulaire à l’intérieur de la hotte à flux laminaire. Un balancement doux sur une plate-forme basculante peut être utilisé pour assurer un revêtement uniforme de plats ou de flacons de plus grande taille. Si la solution polyaire sèche trop rapidement, la surface ne sera pas lisse.

Si vous le souhaitez, prétraitez les fibroblastes avant la culture 3D, par exemple, pour l’induction de la sénescence, prétraitez les cellules avec des doses sublétales de peroxyde d’hydrogène. Récupérer et étendre les cultures de cellules INOF et épithéliales in vitro pour préparer suffisamment de cellules pour l’établissement de stéroïdes hétérotopiques 3D. Après un lavage PBS de cinq minutes, ajoutez 15 millilitres de milieu à la plaque de poly hema.

Pendant ce temps, ajoutez de la trypsine aux cellules de fibroblastes ovariens normaux immortalisées pour les détacher de la boîte de culture. Après trois à cinq minutes, neutralisez la trypsine avec un volume égal de milieu de culture et récoltez les cellules par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un milieu de cinq millilitres et mélangez bien en pipetant de haut en bas ou en tourbillonnant doucement.

Ensuite, utilisez un échantillon de 10 microlitres pour énumérer les cellules viables à l’aide du bleu trian. Ajoutez maintenant 4 millions de cellules INOF au milieu déjà distribué dans la plaque revêtue de poly hema. Augmenter le volume du milieu de culture à 20 millilitres et incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone.

Surveillez l’agrégation cellulaire en stéroïde multicellulaire par microscopie de phase pour réalimenter les cultures de sphéroïdes S tous les deux à trois jours. Posez les plaques en biais sur une pipette. Laissez les sphéroïdes se déposer et retirez soigneusement environ 16 millilitres du milieu épuisé à l’aide d’une pipette de cinq millilitres.

Ajouter 16 millilitres de milieu frais à la culture et retourner à l’incubateur le septième jour. Créez des cultures hétérotypiques en ajoutant des cellules épithéliales aux fibroblastes phe. Tout d’abord, préparez des suspensions de cellules épithéliales ovariennes par la trypsine comme décrit précédemment après le dénombrement des cellules.

Laver une fois dans un milieu INOF GM pour éviter que des facteurs de croissance ne soient entraînés par le milieu de croissance épithélial. Après avoir reconstitué le milieu des cultures de fibroblastes OID, ajoutez les cellules épithéliales dans un rapport de quatre pour un fibroblaste à la culture de cellules épithéliales. Les OID hétérotopiques dans INOF GM réalimentent les cultures typiques tous les deux à trois jours pendant 14 jours supplémentaires.

Pour l’immunohistochimie, fixez le PHE avec de la formine tamponnée neutre, granulez le PHE et remplacez le formol par de l’éthanol à 70 %. Procéder au traitement en paraffine en utilisant les protocoles standard utilisés pour les tissus humains. Les stéroïdes inclus dans la paraffine peuvent être sectionnés et colorés avec h et e de marqueurs moléculaires spécifiques en utilisant la chimie immunochimique.

Alternativement, lavez les stéroïdes dans du PBS et fixez-les dans 4 % de para formaldéhyde. Ensuite, intégrez les échantillons dans un milieu OCT et congelez-les instantanément pour le sectionnement du cryostat et la coloration immunofluorescente pour l’analyse par cytométrie en flux. Lavez les stéroïdes dans du PBS et dissociez-les par digestion à la trypsine ou à l’Accutane à 37 degrés Celsius.

La dissociation complète des stéroïdes en une suspension unicellulaire peut être favorisée en pipetant la solution de haut en bas avec une pointe de pipette d’un millilitre. Veillez à ne pas surdimensionner les cellules, neutralisez la réaction avec un volume égal de milieu de culture et éliminez les amas cellulaires en passant la suspension dans une crépine cellulaire de 40 à 70 microns. Ensuite, granulez les cellules et lavez-les avec du PBS et énumérez, mettez en suspension le nombre souhaité de cellules, tamponnez et colorez selon les instructions du fabricant. Dans notre laboratoire, nous avons partiellement transformé les cellules épithéliales ovariennes et co-cultivé ces cellules avec des fibroblastes ovariens normaux et sénescents pour imiter le développement précoce du cancer de l’ovaire.

Dans un ovaire préménopausique, la coloration immunofluorescente des fibroblastes ovariens normaux immortalisés montre que les fibroblastes ovariens normaux primaires et les fibroblastes ovariens normaux immortalisés expriment la protéine spécifique des fibroblastes, mais ils n’expriment pas la cytokératine sept et expriment menton. Les cellules de fibroblastes ovariens normaux cultivées seules sous forme 3D présentent une morphologie fusiforme et une matrice extracellulaire abondante. Ici, des fibroblastes ovariens normaux ont été exposés au peroxyde d’hydrogène pour induire la sénescence pendant sept jours, puis cultivés avec des cellules épithéliales ovariennes partiellement transformées pendant 14 jours.

Pour distinguer les deux types de cellules, les stéroïdes résultants ont été immuno-colorés pour mim one comme marqueur de prolifération et pancytokératine comme marqueur épithélial. La quantification des données suggère que le microenvironnement vieillissant favorise les caractéristiques néoplasiques des cellules épithéliales partiellement transformées, tandis qu’un microenvironnement normal inhibe la progression néoplasique, les caractéristiques histologiques des cellules normales et malignes qui ne sont pas détectables lorsque les cellules sont cultivées lorsque les monocouches sont restaurées. Lorsque les cellules sont transformées en culture sphéroïde, par exemple, les caractéristiques histologiques des cancers de l’ovaire à cellules claires peuvent être détectées dans les cultures 3D de lignées cellulaires de cancer de l’ovaire à cellules claires, mais pas dans les cultures monocouches des mêmes cellules.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place des cultures typiques tridimensionnelles avec lesquelles étudier les interactions entre les cellules épithéliales et stromales. Au cours de la genèse tumorale précoce. Lors de la mise en place d’une culture 3D, il est important d’ajuster le nombre de cellules en fonction de l’application en aval, en tenant compte d’une certaine perte de matière pendant le traitement.

Une fois maîtrisées, les cultures 3D peuvent être mises en place en une heure suite à cette procédure. D’autres méthodes, telles que la cytométrie en flux combinée au profilage microradiscopique de l’expression génique, peuvent être effectuées pour analyser les changements globaux d’expression génique qui se produisent dans les cultures 3D typiques, mais qui ne sont pas détectés dans des conditions de culture monocouche. Cela permettra de disséquer les voies de signalisation bidirectionnelles qui se produisent spécifiquement dans le cadre d’une culture centrale 3D. Microenvironnement.