Différencier les rôles fonctionnels de l'expression des gènes de cellules immunitaires et non immunitaires dans l'intestin de souris par greffe de moelle osseuse

L’objectif global de l’expérience démontrée dans cette vidéo est d’évaluer si le peptide antimicrobien lyne joue un rôle dans l’amélioration de la colite induite par le sulfate de dextran chez la souris. Ceci est réalisé en injectant de la moelle osseuse de souris de type sauvage dans des souris licites et knock-out irradiées et de la moelle osseuse de souris knock-out dans des souris de type sauvage irradiées. La moelle osseuse transplantée générera de nouvelles cellules sanguines chez le receveur du génotype du donneur.

Les souris receveuses sont ensuite exposées au sulfate de dextran pour induire une colite après quatre semaines. La réussite de la transplantation est validée par cytométrie en flux et les lésions du tissu colique sont évaluées par histologie. Des résultats sont obtenus qui montrent que la colite est améliorée lorsque la moelle osseuse de type sauvage est transplantée chez des souris knock-out.

À l’inverse, la colite s’aggrave lorsque la moelle osseuse knock-out est transplantée chez des souris de type sauvage. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour déterminer l’expression génique à partir de cellules dérivées de la moelle osseuse ou de cellules non dérivées de la moelle osseuse dans l’inflammation ou l’infection. Les souris C 57, black six, wild type et C induites knockout sont recommandées pour cette expérience afin de permettre de suivre les souris de type sauvage et les souris knockout.

Cellules de donneur après une greffe de moelle osseuse. Utilisez des souris CD 45.1 pour représenter les souris de type sauvage et CD 45.2 pour les souris knock-out. Le tableau présenté ici décrit la configuration expérimentale : cinq souris donneuses et 10 souris receveuses sont attribuées à chaque groupe.

Pour les groupes A et B, la moelle osseuse sera transplantée des souris de type sauvage aux souris knock-out. La colite sera induite dans le groupe A, mais pas dans le groupe B.Pour les groupes C et D.La moelle osseuse sera transplantée des souris knock-out au type sauvage et la colite sera induite dans le groupe C uniquement pour E et F.La greffe se fera du type sauvage au type sauvage et pour les groupes G et H, La greffe se fera de KO en KO. Pour préparer la moelle osseuse d’un donneur à être transférée à des souris irradiées, commencez par extraire la moelle osseuse des os des souris sacrifiées dans une enceinte de biosécurité.

Utilisez des instruments de dissection stériles pour exposer les os de l’humérus, du fémur, du tibia et du péroné libres de muscles et de ligaments et transférez-les dans une boîte de Pétri. Coupez les deux extrémités des os pour montrer la moelle osseuse rouge. Puis saisir l’un des os avec une pince.

Rincez la moelle osseuse rouge avec du PBS froid avec une seringue de trois millilitres et des aiguilles de calibre 25 dans une autre boîte de Pétri. Ensuite, rincez l’os de l’autre extrémité pour produire plus de cellules de moelle osseuse. Répétez ce processus avec chacun des os.

Mettez en pool la moelle osseuse de type sauvage et assommez les souris séparément. Utilisez une seringue de six millilitres avec une aiguille d’un demi-pouce de calibre 18 pour briser les bouchons de moelle osseuse rouges par aspiration et éjection répétées. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, transférez la moelle osseuse prélevée dans un tube conique de 50 millilitres.

Une fois que toute la moelle osseuse a été transférée, faites tourner la moelle osseuse à 740 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la rotation, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension en tourbillonnant pendant cinq à 10 secondes. À la pastille, ajoutez à nouveau cinq millilitres d’un tampon de lyse XRBC par vortex de souris donneuse pendant cinq secondes et incubez pendant exactement trois minutes à température ambiante.

Après trois minutes, ajoutez 20 millilitres de PBS froid dans chaque tube et mélangez par inversion pour arrêter la lyse. Versez ensuite le contenu à travers une passoire à cellules de 40 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Rincez le tube d’origine avec cinq millilitres de PBS et transférez la solution dans la crépine cellulaire.

Continuer à recueillir le flux dans le tube conique. Portez ensuite le volume à 50 millilitres avec du PBS et mélangez par inversion. Ensuite, déterminez le nombre de cellules viables par exclusion du bleu trian à l’aide d’un hémocytomètre.

Une fois que le nombre de cellules a été déterminé, faites tourner les cellules de la moelle osseuse à 913 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, retirez le surnageant en fonction du nombre total de cellules. Resus suspend le granulé dans le PBS à une fois 10 à la huitième cellules par millilitre.

Les cellules de la moelle osseuse sont maintenant prêtes à être transférées chez des souris receveuses irradiées. Les souris receveuses de type sauvage et knock-out pour cette expérience ont été irradiées avec 1000 rad comme décrit dans le document d’accompagnement, les souris sont élevées et logées dans une installation exempte d’agents pathogènes quatre à 24 heures après l’irradiation qui a réchauffé les souris receveuses sur un coussin chauffant sous une lampe chauffante pour injecter la moelle osseuse du donneur. Placez une souris receveuse dans une contention, essuyez la queue avec de l’éthanol à 70 % pour stériliser le site d’injection et favoriser la vasodilatation locale pour une injection facile.

À l’aide d’une seringue à insuline munie d’une aiguille de calibre 28 et demi, injectez une fois 10 à 10 à 200 microlitres dans la veine de la queue de chaque souris après l’injection. Placez la souris dans une cage avec jusqu’à trois autres souris injectées pendant les quatre premières semaines suivant l’injection. Maintenez les souris receveuses injectées dans des cages d’autoclave avec de l’eau contenant l’antibiotique sulfamides.

Cela laisse le temps aux animaux de retrouver leur immunité, de changer de cages, d’eau traitée aux antibiotiques et de nourriture tous les quatre jours pour maintenir l’hygiène. Quatre semaines après l’irradiation et la greffe de moelle osseuse, passez à de l’eau ordinaire sans antibiotiques et maintenez les souris pendant deux semaines de plus pour retrouver leur microflore intestinale normale. Six semaines après l’injection dans la moelle osseuse, mesurer le poids corporel initial pour induire la colite.

Donnez aux souris du groupe expérimental de la colite 5 % de sulfate de dextran dans l’eau potable. Cinq jours plus tard, mettez en commun le sang périphérique de quatre souris dans des tubes enduits d’héparine vacutainer et placez-le sur de la glace. Ensuite, dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre, combinez 300 microlitres de sang avec 300 microlitres de coloration cellulaire, tamponnez et aliquotez le sang dans cinq tubes à essai de cytométrie en flux étiquetés un à cinq chacun avec 100 microlitres sur glace.

Après avoir sacrifié les souris, mesurez à nouveau le poids corporel et calculez le changement. Disséquez les tissus du côlon et faites-le pénétrer dans du formol pour la coloration h et d. Ensuite, prélevez les cellules de la moelle osseuse comme précédemment.

Divisez la moelle osseuse en suspension dans cinq micro-tubes à centrifuger étiquetés de un à cinq de 100 millilitres chacun. En préparation de l’analyse par cytométrie en flux, préparez le mélange d’anticorps pour chaque tube respectif dans l’obscurité comme décrit dans le document d’accompagnement, les échantillons de sang et de moelle osseuse étiquetés numéro un serviront de témoins et ne seront pas des échantillons de sang et de moelle osseuse colorés. Le numéro deux étiqueté sera coloré avec le contrôle d’isotype fitzy, le contrôle d’isotype PE et la solution de blocage CD 16 slash 32.

Ces contrôles d’isotypes sont utilisés pour confirmer la spécificité des échantillons primaires de liaison aux anticorps. L’étiquette numéro trois sera colorée avec FZ CD 45.1 et CD 16 barre oblique 32. Les échantillons de solution de blocage étiquetés numéro quatre seront colorés avec CD 45.2 et CD 16 barre oblique 32.

Solution de blocage. L’étiquetage unicolore peut révéler la présence de cellules donneuses ou receveuses dans le sang ou la moelle osseuse. Il est clair que les échantillons étiquetés numéro cinq seront colorés pour les CD 45.1, CD 45.2 et CD 16 slash 32.

Le marquage bicolore montre le rapport relatif des cellules donneuses et receveuses dans le sang ou la moelle osseuse. Ajoutez cinq microlitres de mélange d’anticorps, deux et cinq dans leurs tubes d’échantillon respectifs. Ajoutez ensuite trois microlitres de mélange d’anticorps, trois et quatre, dans leurs tubes d’échantillon respectifs.

Incuber tous les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez deux millilitres et un tampon de lyse XRBC dans chaque tube. Ensuite, incubez les échantillons pendant encore 15 minutes sur de la glace dans l’obscurité.

Faites tourner les cellules à 350 fois G, cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille avec un tampon de coloration cellulaire de 500 microlitres dans l’obscurité. Puis vortex brièvement.

Ensuite, effectuez une cytométrie en flux sur les échantillons de sang et de moelle osseuse de l’immunocoloration. Sélectionnez FZ pour représenter le CD 45.1 de type wild et PE pour représenter le CD 45.2 knockout. Analysez les résultats de la cytométrie en flux à l’aide du logiciel Flo Joe.

Calculez le rapport entre le rapport E d’ajustement et le rapport EP ou le rapport PE / e d’ajustement pour déterminer si le génotype du donneur est le génotype dominant dans le sang et la moelle osseuse. Cette image montre des échantillons d’images h et e de côlons avec une histologie normale et une colite DSS. Les images histologiques sont notées en fonction des lésions des tissus muqueux et de l’infiltration des neutrophiles dans les tissus muqueux et sous-muqueux.

Ainsi, un score histologique plus élevé indique une colite plus sévère pour tester si la lyine joue un rôle dans la prévention de la colite. La moelle osseuse a été échangée entre des souris de type sauvage et des souris knock-out, comme décrit dans cette vidéo. L’histologie a ensuite été évaluée et notée comme indiqué ici.

Les scores histologiques ont été significativement augmentés lorsque de la moelle osseuse de souris knock-out a été introduite chez des souris sauvages irradiées. À l’inverse, les scores ont considérablement diminué lorsque de la moelle osseuse de type sauvage a été introduite chez des souris knock-out. Ces données indiquent que le C endogène provenant de cellules dérivées de la moelle osseuse a des effets anti-inflammatoires et améliore la colite pour vérifier que la transplantation a réussi chez ces souris.

Une cytométrie en flux a également été réalisée sur la moelle osseuse et le sang des souris après la transplantation. Coloration de la moelle osseuse de type sauvage pour le Fitz CD 45.1 mais pas pour le pe, le CD 45.2 comme indiqué ici, les taches de moelle osseuse assommantes fortement pour le PE mais pas pour le Fitz comme indiqué ici. Après la transplantation, cependant, la moelle osseuse et le sang de souris de type sauvage qui ont reçu de la moelle osseuse knock-out ont été fortement colorés pour l’EP, mais pas pour Fitz, ce qui indique que la population prédominante de cellules colorées provenait du donneur.

De même, la moelle osseuse et le sang de souris knock-out qui ont reçu de la moelle osseuse de type sauvage ont été fortement colorés pour fitzy, mais pas pe, confirmant à nouveau que les populations colorées prédominantes étaient d’origine donneur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’effectuer une expérience de greffe de moelle osseuse et devriez être en mesure de modifier la colite via des cellules dérivées de la moelle osseuse.