L'étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

Métaphase anaphase de transition est déclenchée par l'anaphase de promotion de complexe (APC / C) en fonction de l'ubiquitination et la destruction subséquente de la cycline B. Ici, nous avons mis en place un système qui, à la suite pulse-chase étiquetage, permet de suivre la cycline B protéolyse dans des populations de cellules entières et facilite la détection des interférences par le checkpoint mitotique.

Le but de cette procédure est de surveiller comment la protéolyse du cycle B régit l’apparition de l’anaphase et la sortie mitotique. Ceci est accompli en ensemenceant d’abord des cellules rapporteures B Snap sur des lames de microscopie. La deuxième étape consiste à marquer la molécule déclarante chimérique Cyclin B avec l’étoile TMR à substrat fluorescent

Ensuite, les séries d’images sont acquises à une station de microscopie. La dernière étape consiste à analyser les cellules et à calculer l’intensité de la fluorescence des étoiles TMR au fil du temps, qui reflète le cycle de protéolyse B. En fin de compte, la microscopie par immunofluorescence de cellules rapporteures vivantes révèle la cinétique du cycle de protéolyse B qui a lieu pendant la mitose.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la surveillance du cyclone BGFP est que le cyclone B SNAP permet de surveiller la dégradation du cyclone B plutôt que l’expression de la protéine entière. Les cellules rapporteures instantanées de cette expérience sont initialement autorisées à croître de manière asynchrone en phase logarithmique pendant au moins 48 heures. Pour commencer, la procédure d’ensemencement de la trypsine est celle des cellules rapporteures à enclenchement de la sous-confluence pour l’ensemencement des cellules sur des chambres de microscope à huit puits à une distribution constante sur toute la surface de la centrifugeuse à chambre.

10 000 cellules et Resus passent dans 350 microlitres, un milieu de croissance normal sans rouge de phénol. Transférez la suspension cellulaire dans la chambre de microscope pour l’ensemencement des cellules dans des chambres de microscope à huit puits avec une densité cellulaire maximale au centre de la chambre. Chargez d’abord la chambre avec 300 microlitres de milieu de croissance normal sans phéno rouge.

Ensuite, ajoutez soigneusement 5 000 cellules au centre de la chambre du microscope pour l’ensemencement des cellules sur 96. Plaques optiques spéciales de puits à une distribution constante sur toute la surface du puits centrifuger, 5 000 cellules et remettre en suspension dans 300 microlitres de milieu de croissance normale sans rouge de phénol en fonction du nombre total de cellules contenant des puits nécessaires. Ajustez le nombre de cellules et le volume total du support de suspension.

Transférez ensuite la suspension cellulaire sur une plaque à 96 puits pour l’ensemencement des cellules sur 96. Plaques optiques spéciales avec une densité cellulaire maximale au centre du puits. Ajoutez soigneusement 1 500 cellules dans 15 microlitres de milieu de croissance normal sans rouge de phénol en une petite goutte au centre de chaque puits.

Cela limitera la croissance cellulaire au centre du puits. Laissez toutes les cellules ensemencées se développer pendant au moins 18 heures dans des conditions de culture cellulaire standard 30 minutes avant le début de la procédure de coloration. Échauffement des quats de rouge de phénol libre de croissance normale moyenne à 37 degrés Celsius.

Le substrat instantané dans cette démonstration est l’étoile TMR pour une manipulation facile de l’étoile TMR dissoute dans le DMSO pour obtenir une solution mère avec une concentration de 400 micromolaires diluée 0,5 microlitre de la solution mère étoile TMR. Dans 200 microlitres de milieu de croissance normal exempt de rouge de phénol chaud pour obtenir une concentration finale de marquage d’une micromolaire. Ensuite, retirez le milieu de croissance normal des cellules à croissance asynchrone et remplacez-le par un milieu de marquage Incuber les cellules dans le milieu de marquage pendant 25 minutes dans des conditions de culture standard.

Après 25 minutes, retirez le milieu de marquage et lavez les cellules quatre fois avec un milieu de croissance normal chaud sans rouge de phénol. Après le lavage final, incubez les cellules dans 300 microlitres de milieu de croissance normal chaud sans rouge de phénol pendant 30 minutes avant de les transporter au microscope. Remplacez le milieu par un milieu de croissance normal frais et chaud exempt de rouge de phénol pour éliminer les cellules résiduelles de transport du substrat de snaps non liés au microscope dans une boîte en polystyrène sur un bloc de chaleur préchauffé à 37 degrés Celsius.

Pour minimiser la variation de température deux heures avant la mesure de l’intensité de fluorescence. Ajustez la température de l’air de la chambre climatique à 37 degrés Celsius en mode sec afin d’amener le microscope et tous ses composants à la température souhaitée. Pour éviter la condensation et les dommages ultérieurs au microscope, il est important de préchauffer avant de régler l’humidité.

Lorsque l’ensemble du système de microscope a atteint 37 degrés Celsius, réglez l’humidité de l’air à 60 % et le dioxyde de carbone à 5 %, démarrez le logiciel de numérisation ou d’acquisition et définissez les paramètres standard. Définir les positions des puits à analyser. Définissez le delta T ou temps du cycle d’acquisition et le nombre absolu de cycles d’acquisition.

Dans cette démonstration. L’autofocus matériel est présélectionné pour l’analyse d’un plus grand nombre de puits. Démarrez l’acquisition et supervisez les deux premiers cycles d’acquisition.

Le microscope se concentrera sur le signal GFP de l’histone H deux, puis sur l’acquisition d’une première image dans ce canal avant que le filtre ne soit changé et que l’image de l’étoile TMR correspondante ne soit acquise. Il s’agit de les répéter pour toutes les positions à l’intérieur d’un puits et pour chacun des puits à examiner avant de répéter le cycle suivant. Encore. Pour analyser les profils protéolytiques, démarrez le logiciel d’analyse scan R.

Analysez les images avec les noyaux cellulaires tels que visualisés par l’histone H deux GFP, définie comme l’objet principal à l’aide d’un seuil basé sur l’intensité du signal et d’un algorithme de bassin versant pour aider à séparer les cellules voisines. Un sous-objet composé d’un noyau avec cytoplasme devrait être créé pour l’analyse des étoiles TMR. Les propriétés importantes de l’objet principal sont les positions X et Y, le temps et le maximum, ainsi que les intensités moyennes de la GFP pour l’objet principal et l’intensité totale divisée par l’aire.

Pour le sous-objet étoile TMR, passez en mode trace pour visualiser l’intensité moyenne de fluorescence étoile TMR du sous-objet au fil du temps ou les traces cellulaires attribuées aux objets principaux analysés. L’examen d’un plus grand nombre de cellules permet d’avoir une première vue représentative et objective, mais le nombre de cellules à examiner peut être réduit en se basant sur les mesures d’une durée d’au moins 140 cycles et contenant une grande intensité maximale d’histone H deux GFP. Sélectionnez une trace cellulaire d’intérêt pour visualiser l’histone H, deux GFP et l’étoile TMR fluorescentes simultanément au niveau de la cellule unique.

À l’aide de la souris droite, cliquez sur une cellule d’intérêt et générez une image exportable. Galerie pour l’illustration de l’histone H deux GFP et du cycle B snap TMR étoile pour chaque fois. Passez en mode de remplissage du logiciel d’analyse du scanner et fixez la région où la cellule d’intérêt est représentée sur le transfert de points.

Appliquez une nouvelle fenêtre de diagramme à points à la région fermée et visualisez l’intensité moyenne de fluorescence des étoiles TMR au fil du temps. Exportez les données vers Microsoft Excel pour des calculs ultérieurs. Les figures ci-dessous représentent la cinétique de la cycline B représentée par une courbe d’intensité de fluorescence d’étoile TMR d’une cellule qui passe par une mitose régulière sans signes de désalignement chromosomique lors de la compaction du cytoplasme après rupture de l’enveloppe nucléaire ou NEBD comme indiqué par le triangle rouge L’intensité de fluorescence du staphylocoque TMR montre une augmentation abrupte jusqu’à ce que la fenêtre isomorphe soit atteinte.

Lorsque la cellule entre en prométaphase, l’intensité de la fluorescence reste à un niveau stable tant que la cellule passe par la prophase et la métaphase, puis commence à chuter rapidement. Une fois que tous les chromosomes ont établi une plaque de métaphase stable, cette chute précède la séparation des chromosomes. Au cours de l’anaphase indiquée par le point bleu sur la courbe en fin de mitose, la chromatine commence à se condenser et la cellule adopte la morphologie de phase.

Alors que la courbe d’intensité de fluorescence s’approche du plateau, qui est plus bas que le plateau avant mitose Après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la mitose pour explorer l’équilibre serré entre le cyclisme, la dégradation et la synthèse qui régule la progression mitotique.