L'étude de la protéolyse de la cycline B au niveau de la cellule unique dans les populations de cellules entières

L'objectif de cette procédure est de surveiller la manière dont la protéolyse de la cycline B régule le début de l'anaphase et la sortie de la mitose. Cela est réalisé en semant d'abord des cellules rapporteuses de la cycline B sur des lames de microscopie. La deuxième étape consiste à marquer la molécule rapporteuse chimérique de la cycline B avec le substrat fluorescent TMR star.

Ensuite, les séries d'images sont acquises sur une station de microscopie. La dernière étape consiste à analyser les cellules et à calculer l'intensité de fluorescence du TMR star au cours du temps, ce qui reflète la protéolyse de la cycline B. En fin de compte, la microscopie en immunofluorescence de cellules vivantes rapporteuses révèle la cinétique de la protéolyse de la cycline B qui se déroule pendant la mitose.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la surveillance de la cyclone BGFP, est que la cyclone B SNAP permet de suivre la dégradation de la cyclone B plutôt que l'expression totale de la protéine. Les cellules rapporteuses snap pour cette expérience sont d'abord laissées à croître de manière asynchrone en phase logarithmique pendant au moins 48 heures. Pour commencer, la procédure de semis de la trypsine consiste à utiliser des cellules rapporteuses snap en sous-confluence afin de semer les cellules dans des chambres microscopiques à huit puits avec une distribution constante sur toute la surface de la centrifugeuse de chambre.

10 000 cellules et le milieu de resuspension dans 350 microlitres de milieu de croissance normal sans rouge de phénol. Transférez la suspension cellulaire dans la chambre du microscope pour la mise en place des cellules dans des chambres microscopiques à huit puits avec une densité cellulaire maximale au centre de la chambre. Remplissez d'abord la chambre avec 300 microlitres de milieu de croissance normal sans rouge de phénol.

Ensuite, ajoutez soigneusement 5 000 cellules au centre de la chambre du microscope pour ensemencer les cellules dans des plaques 96 puits à optique spéciale avec une répartition constante sur toute la surface du puits. Centrifugez à 5 000 cellules et remettez en suspension dans 300 microlitres de milieu de croissance normal sans rouge de phénol, selon le nombre total de puits contenant des cellules requis. Ajustez le nombre de cellules et le volume total du milieu de suspension.

Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans une plaque de 96 puits pour la mise en culture des cellules sur des plaques optiques spéciales de 96 puits présentant une densité cellulaire maximale au centre du puits. Ajoutez soigneusement 1 500 cellules dans 15 microlitres de milieu de croissance normal sans rouge de phénol sous forme d'une petite goutte au centre de chaque puits.

Cela limitera la croissance cellulaire au centre du puits. Laisser toutes les cellules semées croître pendant au moins 18 heures dans des conditions standard de culture cellulaire, 30 minutes avant le début de la procédure de coloration. Préchauffer des aliquotes de milieu de croissance normal sans rouge de phénol à 37 degrés Celsius.

Le substrat de fixation dans cette démonstration est le TMR star, afin de faciliter la manipulation. Dissoudre le TMR star dans du DMSO pour obtenir une solution mère à une concentration de 400 micromolaire. Diluer 0,5 microlitre de la solution mère de TMR star dans 200 microlitres de milieu de croissance normal sans phénol rouge, préchauffé, afin d'obtenir une concentration finale de marquage de 1 micromolaire. Ensuite, retirer le milieu de croissance normal des cellules en croissance asynchrone et le remplacer par le milieu de marquage. Incuber les cellules dans le milieu de marquage pendant 25 minutes dans des conditions de culture standard.

Après 25 minutes, retirez le milieu de marquage et lavez les cellules quatre fois avec du milieu de croissance normal sans rouge de phénol, préchauffé. Après le dernier lavage, incubez les cellules dans 300 microlitres de milieu de croissance normal sans rouge de phénol, préchauffé, pendant 30 minutes avant de les transporter au microscope. Remplacez le milieu par du milieu de croissance normal sans rouge de phénol, frais et préchauffé, afin d'éliminer le substrat de marquage non lié, puis transportez les cellules au microscope dans une boîte en polystyrène sur un bloc chauffant préchauffé à 37 degrés Celsius.

Pour minimiser les variations de température, deux heures avant la mesure de l'intensité de fluorescence, régler la température de l'air dans la chambre climatique à 37 degrés Celsius en mode sec afin de porter le microscope et tous ses composants à la température souhaitée. Pour éviter la condensation et les dommages subséquents au microscope, il est important de préchauffer avant de régler l'humidité.

Lorsque l'ensemble du système de microscope a atteint 37 degrés Celsius, régler l'humidité de l'air à 60 % et le dioxyde de carbone à 5 %. Démarrer le logiciel de balayage ou d'acquisition et définir les paramètres standards. Définir les positions des puits à analyser. Définir le delta T ou le temps de cycle d'acquisition ainsi que le nombre absolu de cycles d'acquisition.

Dans cette démonstration, l'autofocus matériel est présélectionné pour l'analyse d'un plus grand nombre de puits. Démarrez l'acquisition et supervisez les deux premiers cycles d'acquisition.

Le microscope se focalisera sur le signal de l'histone H2A-GFP, puis acquerra une première image dans ce canal avant que le filtre ne soit changé et que l'image correspondante de TMR Star ne soit acquise. Ceci est ensuite répété pour toutes les positions d'un puits et pour chacun des puits à examiner, avant de recommencer le cycle suivant. Pour analyser les profils protéolytiques, lancez le logiciel d'analyse ScanR.

Analyser les images avec les noyaux cellulaires visualisés par l'histone H deux GFP, définis comme objet principal à l'aide d'un seuil basé sur l'intensité du signal et d'un algorithme de ligne de partage des eaux pour aider à séparer les cellules voisines. Un sous-objet composé du noyau et du cytoplasme doit être créé pour l'analyse du TMR star. Les propriétés importantes de l'objet principal sont les positions X et Y, le temps, les intensités maximales et moyennes du GFP pour l'objet principal, ainsi que l'intensité totale divisée par la surface.

Pour le sous-objet étoile TMR, passez en mode traçage afin de visualiser l'intensité moyenne de fluorescence de l'étoile TMR au fil du temps ou les tracés cellulaires attribués aux objets principaux analysés. L'observation d'un grand nombre de cellules permet une première vue représentative et objective, mais le nombre de cellules à examiner peut être réduit en appliquant un tri sur les mesures durant au moins 140 cycles et présentant une intensité maximale élevée de l'histone H deux GFP. Sélectionnez un tracé cellulaire d'intérêt pour visualiser simultanément, au niveau de la cellule unique, la fluorescence de l'histone H deux GFP et celle de l'étoile TMR.

À l’aide du bouton droit de la souris, cliquez sur une cellule d’intérêt et générez une image exportable. Galerie illustrant l’histone H two GFP et le cyclin B snap TMR star pour chaque point temporel. Passez en mode population dans le logiciel d’analyse du scanner et délimitez la région où la cellule d’intérêt est représentée sur le dot blot.

Appliquez une nouvelle fenêtre de diagramme en nuage de points à la région sélectionnée et visualisez l'intensité moyenne de fluorescence de TMR star en fonction du temps. Exportez les données vers Microsoft Excel pour des calculs supplémentaires. Les figures ci-dessous illustrent la cinétique de la cycline B, représentée par une courbe d'intensité de fluorescence de TMR star d'une cellule traversant une mitose régulière, sans signe de mauvais alignement chromosomique lors de la condensation du cytoplasme après la rupture de l'enveloppe nucléaire, ou NEBD, comme indiqué par le triangle rouge. L'intensité de fluorescence de TMR staph montre une augmentation brutale jusqu'à l'atteinte de la fenêtre isomorphe.

Lorsque la cellule entre en prométaphase, l'intensité de fluorescence reste à un niveau stable tant que la cellule progresse en prophase et en métaphase, puis commence à chuter rapidement. Une fois que tous les chromosomes ont formé une plaque métaphasique stable, cette diminution précède la séparation des chromosomes. En anaphase, indiquée par le point bleu sur la courbe en fin de mitose, la chromatine commence à se décondenser et la cellule adopte une morphologie en phase de division.

Alors que la courbe de l'intensité de fluorescence atteint un plateau, inférieur au plateau observé avant la mitose après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la mitose pour explorer l'équilibre précis entre le cycle cellulaire, la dégradation et la synthèse qui régulent la progression mitotique.