Une méthode pratique et roman d'extraire l'ADN génomique à partir de kits de prélèvement sanguin pour la préservation Plasma Protein

Ce vidéo décrira une méthode pratique et novatrice pour extraire l'ADN génomique à partir du nouveau système de conservation des protéines plasmatiques BDP 100, appelé tubes P 100 TNA. L'extraction à partir de sérum ou de tubes plasmatiques était une procédure assez courante par le passé, mais la combinaison de ce nouveau tube P 100 et de la méthode d'extraction présentée ici offre une approche nouvelle et plus simple pour obtenir de l'ADN de meilleure qualité avec beaucoup moins d'efforts. L'intérieur du tube P 100 est recouvert de K-EDTA et d'inhibiteurs de protéases.

Ceci empêche la coagulation et stabilise les protéines plasmatiques. Le sang est recueilli dans ces tubes afin d'obtenir du plasma pour des analyses après centrifugation. Le sang contenu dans un P 100 se séparera en couches selon la densité : le plasma en haut, les globules rouges en bas et les globules blancs.

Le buffy coat se situe entre ces deux couches. La récupération du plasma est généralement l'utilisation principale de ces tubes. Plusieurs mesures sont effectuées à l'aide de ce plasma, telles que les taux d'anticorps et de protéines.

Le culot blanc est généralement éliminé, mais comme cela sera montré dans cette vidéo, il contient suffisamment d'ADN pour plusieurs analyses, notamment le séquençage, le génotypage, l'identification de biomarqueurs, etc. Les P100 sont composés de trois éléments principaux : le tube, le bouchon et le séparateur. Le séparateur mécanique migre juste au-dessus la couche du culot blanc.

Pour accéder au culot blanc, il est nécessaire d'augmenter la distance entre le séparateur et le culot blanc. Ceci est obtenu par l'ajout de 17 % de saccharose. Le culot blanc est normalement éliminé avec le P 102, mais comme cela sera montré dans cette vidéo, il est possible de récupérer facilement suffisamment d'ADN à partir de cette couche pour effectuer plusieurs tests analytiques avant de sortir les tubes P 100 du congélateur à –80 °C.

Préchauffez un bain-marie à 37 degrés Celsius, placez chaque tube P 100 dans le bain d’eau chaude et incubez pendant environ cinq minutes afin de décongeler tous les échantillons. Une fois que tous les échantillons sont complètement décongelés, tout sérum restant au-dessus du séparateur doit être éliminé. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de saccharose à 17 % au-dessus du séparateur. Après avoir ajouté le saccharose, centrifugez tous les tubes pendant 20 minutes à 2 500 ×g. Maintenant que le séparateur se trouve au sommet du tube et est libéré de la couche buffy, il peut être retiré facilement.

Il faut pulvériser de l'éthanol à 70 % sur un chiffon chimique et stériliser un crochet en trombone en essuyant soigneusement toute sa surface. Tenir le tube P 100 à un angle de 45 degrés avec le trombone stérile. Commencer à extraire le séparateur du tube en tirant doucement sur le rebord du séparateur et en le dirigeant vers un sac de déchets biologiques.

Avec le séparateur retiré, éliminer autant que possible la couche de sucrose à 17 % sans perturber la couche du buffy coat ni celle des globules rouges ; le buffy coat doit désormais constituer la couche supérieure dans le tube. Transférer cette couche dans un nouveau tube conique de 15 millilitres étiqueté. Le volume de buffy coat prélevé pour chaque tube peut varier, mais ne doit pas dépasser trois millilitres.

Pour normaliser le volume de tous les tubes, ajouter suffisamment de PBS (solution saline tamponnée au phosphate) afin d'amener le volume de chaque tube à trois millilitres. Maintenant que toutes les couches blanches sont suspendues dans un volume égal, les érythrocytes restants doivent être éliminés par l'ajout de neuf millilitres de solution de lyse des érythrocytes (RBC).

Ensuite, retourner les tubes plusieurs fois pendant une incubation de 10 minutes à température ambiante afin de séparer les globules rouges lysés du buffy coat. Centrifuger pendant cinq minutes à 2 500 ×g ; cette centrifugation forme un culot à partir duquel l'ADN sera extrait. Verser ce déchet de chaque tube dans un récipient liquide pour déchets biologiques dangereux, en laissant un petit volume dans lequel le culot sera resuspendu. Vortexer le tube pour détacher et resuspendre le culot.

Ajoutez trois millilitres de solution de lyse cellulaire et vortexez vigoureusement pendant au moins 10 secondes. Après lyse, les protéines et l'ADN sont désormais en suspension libre dans la solution et doivent être séparés. Commencez par précipiter les protéines à l'aide d'un millilitre de solution de précipitation des protéines, en VORTEXANT à haut régime pendant au moins 15 secondes. Centrifugez ensuite les tubes pendant cinq minutes à 2 500 ×g pour former un culot protéique durant cette centrifugation.

Procédez de manière appropriée. Étiquetez un flacon conique de 15 millilitres pour chaque échantillon en cours de traitement dans chaque nouveau tube. Transférez trois millilitres d'isopropanol à 100 %.

Une fois les protéines précipitées et centrifugées, chaque tube doit présenter un culot relativement important et un surnageant transparent principalement aqueux. Verser le surnageant contenant l'ADN de chaque tube dans le tube correspondant d'isopropanol préparé lors de la dernière centrifugation. L'isopropanol doit provoquer la précipitation de l'ADN en solution sous forme de fins filaments blancs duveteux. Inverser tous les tubes 50 fois pour assurer un bon mélange, puis centrifuger tous les tubes pendant trois minutes à 2 500 ×g afin de former un culot d'ADN. L'ADN est généralement visible sous la forme d'un petit culot blanc au fond du tube. Toutefois, un faible rendement en ADN peut être invisible à l'œil nu. Poursuivre toutes les extractions jusqu'à ce que les concentrations soient mesurées.

Indépendamment de la présence d'un culot d'ADN, éliminer le surnageant d'isopropanol. Rincer l'ADN en ajoutant de l'éthanol à 70 %. Cette étape permet d'éliminer toute composante indésirable résiduelle susceptible d'interférer avec les analyses ultérieures. Centrifuger pendant une minute à 2 500 ×g. Pour s'assurer que le culot d'ADN adhère correctement au fond du tube, éliminer tout l'éthanol à 70 % des tubes, puis les retourner sur une serviette en papier propre afin de les faire sécher à l'air pendant une heure.

Il ne devrait rester aucun éthanol visible dans les tubes lors de la poursuite du protocole. La dernière étape de l'extraction consiste à resuspendre l'ADN dans une solution. Une solution d'hydratation de l'ADN ou de l'eau constituent des options adéquates pour la plupart des extractions.

Ajoutez 250 microlitres de solution d'hydratation de l'ADN en moins pour les échantillons qui produisent peu ou pas de filaments ou de culots d'ADN visibles, puis vortexez délicatement et progressivement l'ADN pour le mettre en suspension. Enfin, transférez tout l'ADN en suspension dans un tube de centrifugation. À ce stade, la concentration et la pureté de l'ADN peuvent être mesurées à l'aide d'un NanoDrop ou d'un autre spectrophotomètre.

En général, la pureté de l'ADN devrait être proche de celle de l'ADN extrait directement à partir de sang total obtenu dans des tubes contenant de l'EDTA de potassium prélevés uniquement dans le but de récupérer de l'ADN. La concentration dépend de la quantité de matériel initial, mais peut varier de 50 nanogrammes par microlitre à près de 1000 nanogrammes par microlitre, avec une moyenne autour de 200 nanogrammes par microlitre. L'avantage de l'utilisation de ce protocole est double. Premièrement, il permet aux cliniciens d'utiliser un seul prélèvement sanguin pour deux tests cliniques au lieu de réaliser deux ponctions sanguines.

Deuxièmement, cela simplifie le processus d'accès aux cellules contenant de l'ADN en utilisant des tubes séparateurs mécaniques modernes plutôt que les générations précédentes. Dans les tubes avec gel séparateur de la génération précédente, à la fois le gel séparateur lui-même et le caillot sanguin constituaient des barrières aux cellules contenant de l'ADN. Avec les tubes P 100, le séparateur mécanique est facilement éliminé par séparation de densité à l'aide de saccharose à 17 %.

Il s'agit d'une capture d'écran de la mesure réalisée avec le NanoDrop pour une extraction d'ADN moyenne. En utilisant cette méthode par échantillon P 109, l'extraction a permis d'obtenir une solution de 250 microlitres à une concentration de 209 nanogrammes par microlitre d'ADN. Le rendement total était d'environ 52 microgrammes.

Le rapport 260 sur 280, la mesure principale de la pureté de l'ADN, se situait dans la plage optimale de 1,8 à 1,9, avec une valeur de 1,88. Une mesure secondaire de la pureté de l'ADN, le rapport 260 sur 230, était proche de la plage attendue de 2 à 2,2, avec une valeur de 2,35.

Ces résultats sont assez typiques. En pratique, les extractions varient en rendement et en qualité, selon le volume et l'état du sang avant l'extraction, en utilisant une électrophorèse sur gel standard avec une coloration au bromure d'éthidium. Des analyses de qualité supplémentaires montrent que l'ADN génomique extrait de tubes P 100 est aussi intact que l'ADN extrait de sang total.

Cela est évident à partir de la bande épaisse et intense apparaissant au sommet de chaque piste contenant de l'ADN génomique. L'utilisation de ce protocole présente deux avantages majeurs par rapport aux méthodes précédentes. Premièrement, il combine ce qui serait habituellement deux prélèvements sanguins en un seul.

Deuxièmement, ce protocole est plus rapide et plus simple qu'un protocole utilisant des tubes classiques avec gel séparateur SST. En supprimant la nécessité de dissocier systématiquement le sang coagulé, les cliniciens prélèvent habituellement deux tubes de sang lorsque des tests génétiques et sérologiques sont requis. Généralement, un tube avec gel séparateur SST, appelé tube à bouchon doré, et un tube contenant de l'EDTA au potassium, appelé tube à bouchon violet, sont utilisés ; le sérum est prélevé à partir du tube SST et l'ADN est extrait du tube à bouchon violet. Avec cette méthode, il suffit de prélever un seul tube à bouchon rouge P100.

Bien que les institutions familières avec la méthode d'extraction de l'ADN utilisant un séparateur de gel puissent déjà prélever un tube destiné à des tests sérologiques et génétiques. La méthode présentée ici constitue une amélioration progressive mais significative par rapport à ces méthodes existantes utilisant un séparateur de gel. Les deux méthodes nécessitent le retrait d'un certain type de séparateur, bien que le gel soit généralement plus salissant que le séparateur en plastique.

Les tubes séparateurs nécessitent que le sang coagulé soit homogénéisé à travers une maille métallique avant l'extraction de l'ADN. Cette homogénéisation peut être salissante, et l'extraction de l'ADN s'avère plus difficile lorsque des globules rouges, qui ne contiennent pas d'ADN, sont présents en quantité notable. Cette méthode d'extraction P 100 permet de séparer les globules blancs contenant de l'ADN de l'hématocrite, laissant peu de globules rouges susceptibles d'interférer avec l'extraction de l'ADN.

Ce système de récupération de l'ADN à partir d'un tube plasmatique P 100, au lieu des tubes séparateurs de gel de génération antérieure, présente de nombreux avantages. Les tubes P 100 contiennent de l'EDTA, qui inhibe l'endonucléase dépendante du magnésium ainsi qu'un anticoagulant empêchant la coagulation sanguine. Le résultat final est une intégrité de l'ADN accrue et un protocole d'extraction nettement plus simple, notamment grâce à l'éviction de la lyse et de l'homogénéisation du sang coagulé.

En outre, le sang appauvri en plasma peut être conservé dans des P100 indéfiniment, testé jusqu'à trois ans, jusqu'à ce que l'extraction de l'ADN soit souhaitée. De plus, les cliniciens pourraient obtenir des données patient plus utiles avec moins de prélèvements sanguins, et donc moins de stress pour les patients subissant les procédures.