Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

L'objectif de cette procédure est de surveiller le comportement de la culture de méninges crâniennes. Dans des conditions de culture définies. La première étape consiste à prélever les cornes utérines d'une souris gestante dont la gestation est datée.

8,5 jours après la saillie. Une fois isolés, les embryons sont retirés du décidual et le sac vitellin est prélevé pour le génotypage. Ensuite, les ébauches méchyniennes crâniennes sont microdisséquées et transférées dans des plaques de culture tissulaire recouvertes de matrice extracellulaire.

Les explants X sont laissés à s'attacher et cultivés jusqu'à 48 heures en présence ou en l'absence d'agents pharmacologiques définis. Enfin, des images sont prises des explants afin de montrer les différences dans la migration cellulaire. Cette méthode est utile pour répondre à des questions clés telles que quelles sont les voies de signalisation et les protéines de la matrice extracellulaire impliquées et contrôlant le comportement du crâne au cours de l'élévation du pli neural.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de la microdissection sont difficiles à apprendre et nécessitent de la patience et de la pratique pour être maîtrisées. Pour commencer, si une immunohistochimie doit être réalisée, préparez des lamelles ; sinon, sautez cette étape et recouvrez directement les plaques de culture tissulaire avec de la matrice extracellulaire. Stérilisez les lamelles circulaires en verre de 12 millimètres en les trempant dans de l'éthanol. Laissez-les sécher à l'air libre. Ensuite, placez une lamelle stérilisée dans chaque puits d'une plaque de 12 puits.

Travailler dans une hotte à flux laminaire et utiliser un millilitre de matrice extracellulaire (MEC) pour recouvrir les lamelles ou le fond d'une plaque de culture cellulaire. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures ; après l'incubation, aspirer la solution de MEC et rincer trois fois avec du PBS. À ce stade, les plaques recouvertes peuvent être utilisées immédiatement ou enveloppées et conservées à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à deux semaines.

Adé pour visualiser l'embryon translucide. Des plaques de protection Syl avec des fonds noirs résistants sont préparées. Suivant le protocole du fabricant.

Préparez les outils de dissection en insérant une épingle minutienne dans un support à épingles. Utilisez un bloc de polissage pour aiguiser la pince une fois que tout est prêt. Prélevez l’utérus d’une souris gestante dont la gestation est synchronisée à 8,5 jours post coïtum.

Placer l'utérus isolé dans une boîte contenant du PBS stérile et rincer. Une fois sous un microscope de dissection, séparer les décidualités individuelles à l’aide de ciseaux et de pinces. Enlever les tissus conjonctifs utérins par un mouvement de déchirement, en prenant soin de ne pas exercer de pression et de faire sortir l’embryon de la décidue.

Utilisez une pince pour déchirer soigneusement le tissu utérin du côté opposé au placenta. Pour exposer l'embryon enfermé dans la vésicule vitelline, pincez l'embryon et la vésicule vitelline avec la pince afin de les détacher du placenta, puis retirez le tissu utérin de la boîte. Ensuite, en utilisant la pince pour déchirer délicatement, retirez la vésicule vitelline de l'embryon.

Placer la poche vitelline dans un tube Eppendorf pour le génotypage à l’aide d’une pipette ; une fois isolé, stager l’embryon en comptant les somites. Idéalement, l’embryon se situera entre les stades six et dix somites. À ce stade, les plis neuraux commencent tout juste à s’élever et la majeure partie de la morphogenèse du mésenchyme crânien n’a pas encore eu lieu.

Une fois le stade déterminé, transférez l'embryon sur une plaque de garde noire contenant du DMEM sans rouge de phénol. Tout d'abord, sous un microscope stéréo avec le grossissement le plus élevé possible, focalisez-vous sur la tête de l'embryon en utilisant une aiguille de dissection dans chaque main, puis disséquez la tête en avant des mères rmba. Ensuite, incisez le long de la ligne médiane pour obtenir un bi.

Dissez la tête en deux moitiés égales à l’aide d’une aiguille de dissection dans chaque main. Disséquez les bords externes le long de la marge de la tête de l’embryon et de la ligne médiane. Retirez au besoin pour éviter de confondre l’épithélium souhaité avec des tissus indésirables.

Le milieu de culture contiendra des crêtes neurales crâniennes migratrices, du mésoderme paraxial et de l'ectoderme superficiel afin d'éliminer les cellules faiblement attachées. Pipetez soigneusement plusieurs fois vers le haut et vers le bas à l’aide d’une pipette de 200 microlitres. Pour Pepin, ramassez délicatement l’explant avec une pipette.

Dans environ 10 microlitres de DMEM, placer au centre d'un puits de culture tissulaire revêtu, 20 microlitres de DMEM chaud supplémenté avec 15 % de FBS ; la boîte de culture peut désormais être transférée dans une étuve à culture tissulaire. Après environ une à deux heures, l'explant est fixé et un supplément de 250 microlitres de milieu peut être ajouté. Après environ 24 heures, l'explant sera fermement attaché au lamelle.

À ce stade, des agents pharmacologiques peuvent être ajoutés au milieu après encore 24 heures ; les cellules migrent alors à partir des souches. Des images sont généralement acquises afin de documenter la distance et le nombre de cellules migrantes issues des souches. À ce stade, les cellules commencent à présenter des signes de viabilité réduite avec des incubations plus longues.

Voici des exemples de cellules migrantes issues du mésoderme crânien et de plantules de poulet. Après 48 heures sur différents substrats, la forme et la taille des cellules migrantes issues de l'explant dépendent du substrat. La migration cellulaire a été observée sur de la fibronectine, de la laminine, du gel Max, de la matrice extracellulaire (ECM) et de l'acide hyaluronique.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunofluorescence et l'imagerie en temps réel peuvent être utilisées pour approfondir l'étude des voies régulant le comportement des cellules de la crête mékinienne lors de l'élévation du pli neural.