Modèles de métastases osseuses

L'objectif général de cette procédure est d'injecter des cellules tumorales de manière à induire une croissance tumorale dans l'os et une destruction osseuse ultérieure. Pour ce faire, on commence par resuspendre les cellules tumorales dans du PBS froid et à les placer sur de la glace. Ensuite, un nombre approprié de cellules est injecté dans le ventricule cardiaque gauche ou dans la tibia d'une souris anesthésiée.

Ensuite, la croissance de la tumeur osseuse et les paramètres osseux sont surveillés longitudinalement à l'aide de plusieurs techniques d'imagerie. Enfin, une quantification finale des paramètres tumoraux et osseux est réalisée. En définitive, une combinaison de radiographies 2D et 3D de fluorescence ou de bioluminescence in vivo et ex vivo.

La micro-TDM et l'histologie sont utilisées pour montrer la croissance tumorale et les modifications de l'environnement osseux au niveau cellulaire et structural. Ces méthodes permettent de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la métastase cancéreuse, comme les facteurs présents dans l'os qui favorisent la colonisation métastatique des cancers du sein et de la prostate. La préparation des cellules sera démontrée par Alisa Merkel, assistante de recherche dans mon laboratoire. Conserver les cellules moins d'une semaine.

Qui contiennent le clone M-D-A-M-B 2 3 1 marqué par la GFP dans du DMEM contenant 10 % de FBS et 0,1 milligramme par millilitre de pénicilline-streptomycine, à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de 5 à 8 % de dioxyde de carbone. Entretenir les cellules à une confluence de 80 à 90 % et les repiquer à un dilution de 1 à 10. Pour préparer les cellules en vue d'une inoculation, les trypsiner à une confluence de 80 à 90 % avec une solution de trypsine-EDTA à 0,15 % en utilisant 10 millilitres.

Transférez immédiatement les cellules dans un tube conique de 50 millilitres contenant du DMEM glacé avec 10 % de FBS et centrifugez pendant cinq minutes. Resuspendez le culot dans un tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres de PBS glacé sans calcium ni magnésium, puis comptez les cellules. Éliminez les cellules indésirables, puis resuspendez-les dans du PBS glacé à une concentration de 10⁶ cellules par millilitre pour l'inoculation intracardiaque et à 250 000 cellules par millilitre pour l'injection intratibiale.

Des souris femelles immunodéprimées âgées de quatre à six semaines, ayant reçu un régime alimentaire Tela 29 20 x cinq à dix jours avant l'injection, sont utilisées pour ces expériences. Après avoir anesthésié la souris dans une chambre contenant 2,5 % d'isoflurane, déplacer la souris sous une hotte ventilée vers un embout nasal et la placer sur le dos. Utiliser une solution de povidone iodée à 10 % pour nettoyer la poitrine, suivie d'éthanol à 70 %.

Marquer la poitrine de la souris pour l'injection au milieu entre l'incisure sterno-claviculaire et le sommet du processus xiphoïde, et légèrement à gauche du sternum. Ensuite, à l'aide d'une seringue à insuline de 280 microlitres, 28 G, d'un demi-pouce, prélever une petite bulle d'air afin de créer un espace entre le piston et le ménisque, puis aspirer 100 microlitres de cellules tout en tenant la peau de la souris tendue avec une main.

Gardez l'aiguille verticale et insérez-la ; une insertion réussie dans le ventricule cardiaque gauche doit produire un pouls sanguin rouge vif distinct dans la seringue. À cette profondeur, appuyez soigneusement sur le piston de la seringue sans mouvement important de l'aiguille afin d'éviter de percer le cœur ou de répandre des cellules dans la cavité thoracique. Pour réduire l'écoulement de cellules dans la cavité thoracique, tirez légèrement sur le piston afin de créer une petite quantité de pression négative.

Ensuite, retirez directement l'aiguille du thorax en veillant à ne pas incliner l'aiguille pendant le retrait, ce qui pourrait déchirer la paroi cardiaque et provoquer un saignement. Appliquez une pression douce sur le site d'injection pour réduire le saignement pendant environ une minute. Lors du retrait du cône nasal, déplacez la souris sur un tapis chauffant jusqu'à ce qu'elle reprenne complètement conscience.

Juste avant la procédure intra-tibiale, injectez du bup printex à la souris. Après avoir anesthésié la souris et placé son museau dans un embout d'anesthésie, nettoyez les deux pattes avec de la bétadine à 10 %, puis de l'éthanol, à l'aide de quatre doigts et du pouce.

Saisir délicatement le malléole latéral, le malléole médial et la moitié inférieure du tibia. Ensuite, fléchir la jambe afin que le genou soit visible et accessible. À l’aide d’éthanol à 70 %, humidifier la peau pour améliorer la visibilité du ligament rotulien sous-jacent, qui doit apparaître comme une ligne blanche épaisse et bien définie tout en maintenant fermement la cheville.

Insérez une aiguille de calibre 28 d'un demi-pouce sous la rotule, en passant par le milieu du ligament patellaire et dans la région intercondylienne antérieure située au sommet du tibia. Exercez une pression ferme et constante avec un léger mouvement de perçage afin de guider délicatement l'aiguille à travers la plaque de croissance. Une fois la plaque de croissance tibiale pénétrée, l'aiguille rencontrera une résistance nettement moindre.

Utilisez un mouvement latéral doux de l'aiguille pour vous assurer qu'elle est bien dans le tibia et qu'elle traverse la plaque de croissance. Le mouvement sera limité si l'aiguille est correctement positionnée dans le tibia. Appuyez lentement sur le piston pour injecter 10 microlitres de solution cellulaire.

À ce stade, on ne devrait ressentir que très peu, voire aucune résistance. Retirer ensuite lentement l'aiguille. Sortir la souris de l'anesthésie et la maintenir sur un tapis chauffant jusqu'à son réveil.

Surveiller la souris deux à trois fois par semaine. Diverses techniques d'imagerie, telles que la luciférase, la fluorescence GFP et les rayons X, sont réalisées sur des souris anesthésiées. La fluorescence indique les zones de tumeur.

Une numérisation estron est utilisée pour localiser les lésions. Les lésions sont corrélées aux images de fluorescence. D'autres détails sur les techniques d'imagerie sont disponibles dans la partie écrite de ce protocole.

De 21 à 35 jours après l'injection. Sacrifier les souris selon une méthode approuvée par l'IACUC et conserver les os dans du formol à 4 %. Réaliser une analyse ex vivo par micro-CT et une histomorphométrie avec coloration à l'hématine et à la DSN sur les os isolés. Des détails supplémentaires sont disponibles dans le protocole écrit, après inoculation intracardiaque ou intratibiale de cellules tumorales.

Les souris sont surveillées hebdomadairement par radiographie et par fluorescence ou bioluminescence. Les lésions deviennent normalement visibles par rayons X entre la deuxième et la troisième semaine. Bien qu’elles puissent être détectées par fluorescence et bioluminescence dès la deuxième semaine, selon le modèle comme illustré ici, les lésions apparaissent sous forme de trous sombres dans l’os et peuvent s’accentuer avec le temps. Les lésions ont été quantifiées à l’aide d’une analyse métamorphique des radiographies et de la fluorescence.

Ont été quantifiés à l'aide du logiciel d'acquisition et d'analyse d'images Maestro. Dans cette figure, la perte osseuse est quantifiée par analyse micro-CT. Les données structurales et minéralogiques de l'os provenant des mesures micro-CT sont représentées sous forme d'images 3D d'un os sain et d'un os porteur de tumeur, où les zones de destruction osseuse apparaissent comme des espaces vides.

Une analyse histomorphogéométrique a ensuite été réalisée sur les échantillons afin de déterminer la charge tumorale ainsi que le volume osseux par rapport au volume tissulaire. Lors de la réalisation de ces procédures, il est important de faire preuve de patience et de disposer soigneusement chaque souris, tout en surveillant attentivement les animaux. Si des décès surviennent, cela est probablement dû à l'agrégation des cellules, et de nouvelles cellules doivent être préparées immédiatement.

La pire chose que vous puissiez faire est de vous précipiter ou de vous décourager. Rappelez-vous qu'avec plus d'entraînement et de temps, vous deviendrez plus habile et plus rapide après leur développement. Ces techniques ont ouvert la voie aux chercheurs en cancer pour étudier la métastase osseuse in vivo.