Name: La culture ex vivo de plénier, en développement chez la drosophile Brains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Apprenez la culture ex vivo de cerveaux de Drosophila pour étudier le développement du corps pédonculé. Cette technique permet d'analyser en haute résolution les processus de développement neural et les effets pharmacologiques.

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Nous tenons à remercier tous les membres de notre laboratoire pour leurs conseils, discussions et commentaires utiles sur le manuscrit. Nous aimerions également remercier particulièrement Marta Koch et Bassem Hassan pour la suggestion excellente que nous attendre 1,5 heures CSA avant la dissection des cerveaux pour la culture dans les expériences de rénovation. Nous remercions également le centre d&#39;imagerie NHGRI pour l&#39;utilisation de leur microscope confocal. Ce travail a été soutenu par le Programme des neurosciences fondamentales du programme de recherche intra-muros NINDS, NIH (Z01 NS003106).

A. Préparation des médias <ol><li> Préparez le support complets par le filtre-stérilisation Drosophila de Schneider médias supplémenté avec 10% sérum de veau foetal et 1% de pénicilline / streptomycine. </li><li> Les médias devraient être préparées à chaque fois. Alternativement, une partie aliquote de la pré-congelés médias peuvent être décongelés avant chaque utilisation. </li><li> Avant la mise en culture, ajouter 10 g / ml d&#39;insuline et 2 pg / ml ecdysone aux médias. Les médicaments ont été préparés comme les stocks de concentrés et congelés dans de petites aliquotes. Aliquotes décongelées ne sont pas recongeler. </li><li> Toutes les solutions de travail doit être maintenue à 25 ° C. </li></ol> La culture de Brains larvaires 1. Sélection et dissection des cerveaux des larves <ol><li> Ajouter 500 ul de médias pour un insert de 12 mm Millicell culture cellulaire. Les cerveaux disséqués sera placé dans ces inserts pour faciliter immunomarquage facile. </li><li> Ajouter une petite quantité de milieu préparé à un verre de montre de dissection. </li><li> Uchanter une petite spatule, ramasser les larves de troisième stade errance et de les placer dans le verre de montre. (Nous présumons que la méthode culture ex vivo s&#39;appliquerait aussi bien pour les larves de premier stade larvaire ou la deuxième, mais nous n&#39;avons pas testé cela.) </li><li> Tenir l&#39;extrémité postérieure de la larve avec une paire de pince, ouvrir avec précaution jusqu&#39;à l&#39;extrémité antérieure avec une deuxième paire de pince n ° 5. </li><li> Rapidement disséquer le cerveau, en gardant la corde nerveuse ventrale intacte. </li></ol> 2. La culture ex vivo de disséqués Brains larvaires <ol><li> En utilisant des pointes de pipette pré-humides, de transférer le cerveau avec précaution dans les inserts de culture cellulaire, les pré-remplis avec les médias. </li><li> Cerveaux de transfert, dans les médias, à un incubateur à 25 ° C jusqu&#39;à ce que le temps désiré-point est atteint. Cette méthode fonctionne efficacement pour un maximum de 48 heures dans la culture. </li><li> Remplacer les médias à 8 heures. Au-delà de ce que, remplacer la moitié des médias toutes les 5-6 heures. </li></ol> 3. La manipulation pharmacologique deBrains larvaires Cette méthode de culture ex vivo peuvent être utilisés pour corroborer pharmacologiquement interactions génétiques déjà démontré dans notre laboratoire 1. <ol><li> Ajouter 100 roscovitine uM et 100 uM olomoucine aux médias préparés. </li><li> Transfert cerveaux disséqués à ce média. </li><li> Cerveaux Culture à 25 ° C pendant 24 heures. </li><li> Remplacer les médias à 8 heures. Au-delà de ce que, remplacer la moitié des médias (avec des médicaments) toutes les 5-6 heures. </li></ol> La culture de Brains chrysalides 1. Sélection des pupes pour la dissection <ol><li> Marquer les pupes blanc sur les bouteilles ou flacons. </li><li> Ne choisissez que les nymphes sont complètement blancs. Les pupes avec n&#39;importe quelle sorte de coloration ne devrait pas être inclus. </li><li> Cette étape est 0 heures après la formation Pupe (APF). </li><li> Ces nymphes sera prêt pour la dissection de 1,5 heures après le marquage. Cette étape est cruciale pour assurer que la taille pour le développement survient dans l&#39;ex vivo </em&gt; la culture. </li></ol> 2. Dissection de pupes <ol><li> Ajouter 500 ul de médias pour un insert de 12 mm Millicell culture cellulaire. (Les cerveaux disséqués sera placé dans ces inserts pour faciliter immunomarquage facile). </li><li> Une fois le temps désiré-point a été atteint, ajouter une petite quantité de milieu préparé à un verre de montre de dissection. </li><li> En utilisant une petite spatule humide, ramasser les pupes préalablement marqué pour la dissection et les placer dans le verre de montre. </li><li> Tenir l&#39;extrémité postérieure de la pupe avec une paire de pince, ouvrir avec précaution l&#39;extrémité antérieure de l&#39;affaire nymphe avec une deuxième paire de pince n ° 5. </li><li> Rapidement disséquer le cerveau, en gardant la corde nerveuse ventrale intacte et fixée. </li></ol> 3. La culture ex vivo de disséqués Brains chrysalides <ol><li> Transfert du cerveau avec précaution dans les inserts de culture cellulaire, les pré-remplis avec les médias. </li><li> Cerveaux de transfert, dans les médias, à un incubateur à 25 ° C jusqu&#39;à la désirée de temps point est atteint. Nous avons utilisé cette méthode pour un maximum de 10 heures dans la culture de l&#39;expérience le montre, mais il peut être étendu à de plus longues périodes d&#39;observation et de traitement, si nécessaire. </li><li> Pour le temps des points de plus de 8 APF heures, remplacer le support toutes les 5-6 heures. </li></ol> A partir de cette étape, le protocole reste inchangé pour les larves et les nymphes. B. Fixation Brains disséqués <ol><li> Une fois le temps désiré-point est atteint, retirer le support et ajouter 500 ul de formaldéhyde à 4% dans du PBS 1X avec 0,5% de Triton X-100 (PBST) pendant 30 minutes, en remplacement de frais avec du formaldéhyde après 15 minutes. </li><li> Assurez-vous de ne pas laisser le cerveau à sécher tout en remplaçant les médias avec un fixateur. </li><li> Laver formaldéhyde avec quatre 10 lavages minute de 1x PBS avec 0,5% TritonX-100 (PBST). </li></ol> C. La coloration Brains fixes <ol><li> Après le formaldéhyde a été lavé, bloquer les cerveaux pendant 1 heure dans une solution de blocage de 1x PBS avec 1% normalDu sérum de chèvre et 1% de sérumalbumine bovine. </li><li> Ajouter anticorps primaires réalisées dans une solution de blocage. </li><li> Cerveaux incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain matin, laver les anticorps primaires avec quatre 10 lavages minute de PBST. </li><li> Ajouter Anticorps secondaires faites dans une solution de blocage. </li><li> Laisser à température ambiante pendant 4 heures. </li><li> Laver Anticorps secondaires avec quatre 10 lavages minute de PBST. </li></ol> D. Montage Brains fixées et colorées pour la microscopie <ol><li> Equilibrer les cerveaux dans les médias Vectashield de montage pendant 1 heure. </li><li> Montez les cerveaux sur lames de verre en utilisant les médias Vectashield de montage. </li><li> Placez les éclats de verre de chaque côté du cerveau avant de monter la lamelle. Cela empêche le cerveau d&#39;être écrasé, tout en gardant l&#39;échantillon suffisamment mince pour analyser tous les plans focaux avec un microscope confocal. Brains étaient à peu près orientée lors du montage pour faciliter la visualisation des points d&#39;intérêt. Lorsque cela est nécessaire,des images du cerveau ont été mis en rotation avec le logiciel Imaris pour fournir une vue optimale de la documentation et la mesure. </li><li> Couvercle d&#39;étanchéité glisse avec du vernis à ongles transparent. </li><li> Magasin glisse abri de la lumière. </li></ol> E. Les résultats représentatifs La figure 1 montre un panel de troisième stade larvaire de cerveaux (A) de type sauvage mouches et (B) les mouches qui expriment un dérivé dominant négatif de Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Les deux expriment l&#39;actine-GFP (green) dans les neurones gamma MB. Comme décrit précédemment (Trunova et al., 2011), il ya une région dans les axones proximaux de neurones gamma de type sauvage qui ne parvient pas à accumuler des actine-GFP, ce qui apparaît-elle comme une «zone claire» (A, support), et fasciclin 2 protein (rouge) s&#39;accumule dans les axones que jusqu&#39;à la frontière de cette zone ventrale (ligne blanche horizontale). La ligne en pointillé dans le troisième panneau de la figure 1 (A) indique la position de la MB, en soulignant l&#39;actedans la «zone claire» et son bord ventral. Dans exprimant mouches Cdk5DN, la zone claire est absent actine (B) et deux Fasciclin (FasII) immunoréactivité s&#39;étend à travers cette région dorsale. (Notez que des nombres variables de FasII positif du projet axones horizontalement à travers le Mo; ce ne sont pas pertinentes pour le phénotype). La barre d&#39;échelle représente 20 um. Grâce à notre méthode de culture ex vivo, nous avons traité des mouches de type sauvage avec une combinaison de roscovitine et olomoucine, des inhibiteurs pharmacologiques de Cdk5 activité. La figure 2 montre un panel de troisième stade larvaire cerveaux de contrôle (A) et traités par le médicament (B ) de type sauvage. mouches Semblable à mouches exprimant un dominant négatif Cdk5 construction, les cerveaux traités avec des inhibiteurs de cdk5 pour 24 heures, montrent la perte caractéristique de l&#39;actine zone claire et une rupture dans la limite FasII (entre crochets). Des lignes blanches montrent la position de type sauvage limite FasII. La barre d&#39;échelle représente 20 um. Figure 3 montre une série représentative de corps pédonculés drosophile de 0-10 heures du CSA, marqué par une membrane-cible mCD8-GFP (green). Les parenthèses indiquent le calice, qui est, les projections dendritiques de la MB. Avant la métamorphose, on peut voir les axones MB coursing dorso-ventralement en faisceaux épais, ainsi que d&#39;une «brume» du signal fluorescent provenant de la dendritique dense arbre (support). Panneau de cerveaux A spectacles disséqués à l&#39;heure indiquée. Notez la taille des dendrites dans la région indiquée par les parenthèses, de telle sorte que par 6-8 heures CSA, la brume du signal dendritique est parti (si le signal n&#39;est pas affecté axonale). Brains dans le panneau B ont été disséqués à 0 heures CSA, avant le pic interne ecdysone (Truman et Riddiford, 2002), et cultivés ex vivo comme indiqué. Ceux-ci révèlent pas d&#39;élagage de développement des dendrites, mais plutôt le signal dendritique persiste à 10 heures du CSA. Pour contourner cela, les nymphes sont marqués à 0 APF heures, mais disséqués à 1,5 heures CSA et cultivé. Vitrel C montre une série représentative de ces corps pédonculés drosophile de 0-10 APF heures. Comme dans les échantillons non-cultivées, le signal dendritique est indétectable par 8 heures CSA. La barre d&#39;échelle représente 20 um.

<ol><li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li>
<li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li>
<li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5%3A+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li>
<li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Drosophila%3A+behavior%2C+genetics%2C+and+neural+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li>
<li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis%3A+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li>
<li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li>
<li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li>
<li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

<html> Chroniques les manipulations génétiques de la structure des tissus et la fonction, y compris les mutations et l&#39;expression des transgènes, produisent typiquement une combinaison d&#39;effets immédiats et tardifs conséquences indirectes qui peuvent être très difficiles à séparer. En complément des méthodes génétiques à la pharmacologie peut faciliter les interrogatoires de l&#39;évolution dans le temps derrière un phénotype. Par exemple, cela a été une approche puissante pour disséquer les contributions des dif...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> Drosophila de Schneider médias </td><td> Invitrogen </td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (inactivé par la chaleur) </td><td> Invitrogen </td><td> 10082-147 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Invitrogen </td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/ml </td></tr><tr><td> Ecdysone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td> Roscovitine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7772 </td><td> 100 um </td></tr><tr><td> Lolomoucine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0886 </td><td> 100 um </td></tr><tr><td> Sérum de chèvre normal </td><td> Invitrogen </td><td> 50062Z </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> Fisher Scientific </td><td> M9501 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Formaldéhyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4551 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP151 </td><td> 0,5% </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H1000 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Inserts de culture cellulaire Millicell </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish, 4 et </td><td> Thermo Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont n ° 5 Pince </td><td> Outils belle science </td><td> 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td> Couverture de verre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

la culture ex vivo de plénier, en développement chez la drosophile brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Nous décrivons une méthode pour la culture ex vivo du cerveau chez la drosophile entiers. Ceci peut être utilisé comme un contrepoint à des manipulations génétiques chroniques pour étudier la biologie cellulaire et le développement des structures cérébrales centrales en permettant des interventions pharmacologiques aigus et d&#39;imagerie en direct des processus cellulaires. Comme un exemple de la technique, avant de travailler à partir de notre laboratoire 1 a montré que d&#39;un compartiment non comptabilisé antérieurement subcellulaire se situe entre les compartiments axonaux et somato d&#39;axones du cerveau chez la drosophile centrale. Le développement de ce compartiment, appelé le segment initial de l&#39;axone (AIS) 2, a été montré génétiquement dépendre de la kinase spécifique des neurones cycline-dépendantes, Cdk5. Nous montrons ici que le traitement ex vivo du cerveau chez la drosophile de type sauvage larvaires avec la roscovitine Cdk5-pharmacologique spécifique et les inhibiteurs de olomoucine 3 provoque des changements dans l&#39;organisation aigus actine, etdans la localisation de la protéine de surface cellulaire Fasciclin 2, qui imitent les changements observés chez les mutants qui n&#39;ont pas Cdk5 activité génétiquement. Un deuxième exemple de la technique de culture ex vivo est prévu pour le remodelage des connexions du corps champignons embryonnaire (MB) des neurones gamma lors de la métamorphose de la larve à l&#39;adulte. Le corps du champignon est le centre de l&#39;apprentissage olfactif et de la mémoire chez la mouche 4, et ces neurones gamma élaguer leurs branches axonales et dendritiques au cours du développement nymphal et puis re-branches s&#39;étendent à un instant plus tard, pour établir le modèle innervation adulte 5. La taille de ces neurones de la MB a été démontré que la dégénérescence se produire via des branches locales neurites 6, par un mécanisme qui est déclenchée par l&#39;ecdysone, une hormone stéroïde, agissant au niveau du récepteur d&#39;ecdysone B1 7, et qui dépend de l&#39;activité de la système ubiquitine-protéasome 6. Notre méthode de culture ex vivo peut be utilisé pour interroger davantage le mécanisme de remodelage de développement. Nous avons constaté que dans le cadre de la culture ex vivo, les neurones gamma de la MB a récapitulé le processus d&#39;élagage de développement avec une évolution similaire à celle in vivo. Il était essentiel, cependant, attendre 1,5 heures après la formation puparium avant explantation du tissu pour que les cellules de commettre de façon irréversible à la métamorphose; la dissection des animaux au début de la nymphose a conduit à la métamorphose peu ou pas dans la culture. Ainsi, moyennant des modifications appropriées, l&#39;approche ex vivo de la culture peut être appliquée à l&#39;étude dynamique ainsi que les aspects de l&#39;état d&#39;équilibre la biologie du cerveau central.

Cet article décrit une méthode par laquelle on peut imiter<em&gt; In vivo</em&gt; Le développement de la<em&gt; Drosophila</emCorps pédonculé&gt; dans un<em&gt; Ex vivo</emSystème de culture&gt;.

La culture ex vivo de plénier, en développement chez la drosophile Brains

Nous décrivons une méthode de culture ex vivo de cerveaux entiers de Drosophila. Celle-ci peut être utilisée comme contrepoint aux manipulations génétiques chroniques pour...

L'objectif général de cette procédure est de cultiver des cerveaux entiers de drosophile en développement, de larve et de nymphe, dans un environnement ex vivo. Cela est réalisé en identifiant d'abord les stades appropriés de drosophiles, de larves et de nymphes. Ensuite, les cerveaux sont rapidement disséqués.Ensuite, les cerveaux sont cultivés pendant la période requise à 25 degrés Celsius. Enfin, les cerveaux cultivés sont fixés, colorés, montés et observés en microscopie. En définitive, les résultats montrent qu'il est possible de reproduire le développement in vivo du corps en champignon oph à l'aide d'une technique de culture ex vivo.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que nous pouvons désormais imiter in vivo les phénotypes du corps en crochets de drosophile dans un environnement de culture ex vivo, permettant une analyse à haute résolution des dynamiques du processus de développement. Pour cultiver les cerveaux de larves, préparez un milieu complet frais avec de l'insuline et ajoutez Dyson à 500 microlitres dans une boîte de culture cellulaire de 12 millimètres avec insert pour le traitement médicamenteux. Préparez un milieu complet contenant chacun 100 micromolaire de Rosco battin et d'oli moin.Ajoutez une petite quantité de milieu à une lame creuse. À l’aide d’une petite spatule, prenez les larves libres de troisième stade et placez-les dans la lame creuse. Ensuite, à l’aide de pinces, maintenez l’extrémité postérieure de la larve.Ensuite, à l’aide de la pince numéro cinq, ouvrez soigneusement l’extrémité antérieure et disséquez rapidement le cerveau en conservant le cordon nerveux ventral intact. À l’aide de pointes de pipette préalablement humidifiées, transférez délicatement le cerveau dans la boîte de culture cellulaire préparée au préalable. Ensuite, préparez une chambre humide et placez la boîte à l’intérieur de cette chambre.Incuber le cerveau à 25 degrés Celsius pendant jusqu'à 48 heures pour cultiver les cerveaux pupaux. Commencez par marquer le blanc de puy sur les flacons. Enregistrez cette étape comme étant zéro heure après la formation de l'ER ou un PF à 1,5 heure.Ajouter 500 microlitres de milieu complet dans une boîte de culture cellulaire de 12 millimètres avec insert. Ajouter une petite quantité de milieu préparé dans une coupelle de dissection. Ensuite, à l’aide d’une petite spatule humide, prélever l’EPI précédemment marqué pour la dissection et le placer dans la coupelle.La nymphe blanche à gauche correspond au point zéro du temps, et celle de droite montre l’état après 1,5 heure A PF. Ensuite, tout en tenant l’extrémité postérieure de la nymphe avec une pince, utilisez une pince n°5 pour ouvrir délicatement l’extrémité antérieure de l’exuvie pupale. Retirez ensuite rapidement le cerveau en conservant le cordon nerveux ventral intact et attaché. Après avoir coupé le haut d’une pipette plastique de 20 microlitres, humidifiez l’embout et utilisez-le pour transférer soigneusement les cerveaux des nymphes vers les boîtes contenant le milieu.Incubez-les à 25 degrés Celsius pendant la durée souhaitée. Une fois que les cerveaux de larves ou de pupes ont été incubés pendant la durée souhaitée, retirez le milieu et ajoutez 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon PBST. Incubez pendant 15 minutes, puis remplacez par du paraformaldéhyde tamponné à 4 % frais et incubez pendant 15 minutes supplémentaires.Utiliser un XPBS avec 0,5 % de Triton X-100 pour laver les cerveaux quatre fois pendant 10 minutes chacun. Après le dernier lavage, incuber les échantillons pendant une heure dans la solution de blocage.Ajouter les anticorps primaires dans la solution de blocage et incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit. Le lendemain matin, laver les échantillons avec du PBST quatre fois pendant 10 minutes chacun. Puis incuber avec les anticorps secondaires à température ambiante pendant quatre heures.Répétez les étapes de lavage pour monter les cerveaux en microscopie. Commencez par les équilibrer ainsi que le milieu de montage pendant une heure, puis montez-les sur des lames en verre afin d'éviter d'écraser les échantillons. Placez des morceaux de verre de chaque côté.Ensuite, appliquez les lamelles après les avoir scellées avec du vernis à ongles. Conservez les lames à l’abri de la lumière. Cette figure montre un ensemble de cerveaux de larves de troisième stade de drosophiles de type sauvage et de drosophiles exprimant un dérivé dominant négatif de la CDK5 ou CDK5 dn, exprimant toutes deux l’actine GFP dans les neurones du corps mushroom ou neurones γ du MB, comme décrit précédemment. Une région située dans les axones proximaux des neurones γ de type sauvage n’accumule pas l’actine GFP, apparaissant ainsi comme une zone claire, et la protéine fascieline s’accumule dans les axones uniquement jusqu’à la limite ventrale de cette zone.Les lignes pointillées indiquent la position du MB, mettant en évidence la zone claire d'actine et sa limite ventrale. Chez les mouches exprimant CDK cinq dn, la zone claire d'actine est absente et, en général, l'immunoréactivité contre fascicline deux ou fasII s'étend de façon dorsale à travers cette région. En utilisant la méthode présentée ici, des cerveaux de mouches de type sauvage cultivés ex vivo ont été traités avec une combinaison d'inhibiteurs pharmacologiques de l'activité de CDK cinq, la ROS cottine et l'ène.On voit ici un ensemble de cerveaux de larves de troisième stade de mouches sauvages contrôles et traitées par un médicament, semblables à des mouches exprimant un construit dominant négatif de CDK cinq. Les cerveaux traités avec des inhibiteurs de CDK cinq pendant 24 heures présentent la perte caractéristique de la zone claire d’actine et un décalage du corps médian antérieur. Deux lignes blanches en limite indiquent la position du corps médian antérieur de type sauvage. Les deux limites illustrées ici représentent une série typique de corps pédonculés de drosophile allant de 0 à 10 heures.Un PF marqué par une cible membranaire. Huit crochets MCD GFP indiquent les prolongements dendritiques du MB appelés calice avant la métamorphose. Les axones du MB cheminent de façon dorso-ventrale en faisceaux épais et un signal fluorescent provient de l'arborisation dendritique dense.Cette colonne montre des cerveaux disséqués au moment indiqué. Remarquez l'élagage des dendrites dans la région indiquée par les crochets, de sorte qu'entre six et huit heures après PF, le signal dendritique diffus a disparu. Les cerveaux de cette colonne ont été disséqués à zéro heure après PF, avant l'acte interne.Les pics de Dyson et les cultures x vivo aux moments indiqués ne montrent aucune élagage développemental des dendrites. Au contraire, le signal dendritique persiste à 10 heures après la fécondation (a PF) pour contourner ce PPR marqué à zéro heure après la ponte féminine (EPF), mais disséqué à 1,5 heure a PF et mis en culture. Cette colonne présente une série représentative de ces corps en champignon DLA allant de zéro à 10 heures.Un PF comme dans les échantillons non cultivés, le signal dendritique est indétectable huit heures après le PF. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de cultiver des cerveaux de rosier en conditions ex vivo. Vous devriez être en mesure d'isoler des cerveaux de larves en stade tardif ou de préparations blanches, soit avant soit après le pic hormonal qui engage la métamorphose. Vous devriez ensuite pouvoir analyser le matériel fixé par microscopie ou utiliser les cerveaux comme matériau initial pour l'imagerie en temps réel.

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