Name: Progénitrices dérivées de Système de culture Oligodendrocyte du cerveau foetal humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-20T11:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Découvrez une méthode de différenciation de progéniteurs neuronaux fœtaux humains en oligodendrocytes sans cellules de soutien. Ce protocole produit des populations pures pour étudier la biologie des oligodendrocytes et les maladies démyélinisantes.

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Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros au National Institutes of Health, NINDS. Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du Laboratoire de médecine moléculaire et de neurosciences, Rick Dreyfuss pour aider à la microscopie et Pamela C. Tamiser pour son aide à l&#39;édition.

Remarque: Pour la culture de routine de progéniteurs neuronaux et cellules de la lignée oligodendrogliome, l&#39;incubation se fait à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 5% atmosphère. Tous les 2 jours, le milieu est remplacé à partir de 50 à 100% de milieu frais si la culture est confluente 40-70%. Au moment de la confluence proche, les cultures sont passées à 2-2.5e6/T75 flacon généralement sur une base hebdomadaire. 1. Préparer le flacon couché <ol><li> Pour préparer des flacons revêtus de diluer 5 mg de poly-D-lysine (PDL) dans 100 ml d&#39;eau déminéralisée (eau déminéralisée), puis les enrober flacons T75 avec 50 pg / ml de PDL à la température ambiante (RT) dans l&#39;obscurité. Après 1 ½ h, aspirer le PDL et rincer les flacons une fois avec de l&#39;eau déminéralisée. Laissez les flacons secs avant l&#39;ensemencement des cellules (tableau 1). </li></ol> 2. À partir de différenciation des cellules progénitrices neurales progénitrices oligodendrocytes en dérivés (AOP) Le protocole estolate des cellules progénitrices du système nerveux central est décrit dans une publication antérieure et il ne fait pas partie de ce protocole 1. Les cellules souches du système nerveux central ont été isolés à partir du télencéphale d&#39;un cerveau de 8 semaines de gestation du fœtus, obtenus conformément aux directives du NIH. <ol><li> Accroître la population multipotentielle des cellules progénitrices neurales sur PDL flacons revêtus en milieu neurobasal additionné de 25 ng / ml de bFGF et 20 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF) (figure 1A). Ne les utilisez pas si élevé que le passage 11 (p11). </li><li> Commencent à se différencier les cellules progénitrices neurales lorsque la culture est d&#39;environ 70% de confluence. </li><li> Assurez milieu de différenciation des oligodendrocytes complète à l&#39;aide du DMEM sans sérum / JAMBONS milieu F12 01:01 complétée par la sérum albumine bovine, de L-glutamine, la gentamicine, composants N2, T3, Chut, NT-3, bFGF et PDGF-AA (tableau 1) . Ce milieu sera définie comme moyen oligo des facteurs de croissance (oligo moyenne + GF). </li><li> Retirer Progenmédias Itor des flacons, rincer les cellules une fois avec un tampon phosphate salin (PBS), puis ajouter du milieu oligo + GF (détails décrits en 2.3) pour commencer la différenciation des oligodendrocytes. Seules les cellules engagées dans la lignée oligodendrogliome va croître (figure 1B). Culture des cellules dans ce milieu pendant 3 semaines. </li><li> Chaque semaine, lorsque les cellules sont à confluence, passage de 90-95% les utilisant de la trypsine (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml pour un flacon T75). Transférer le support d&#39;ensemble à partir des cellules à un passage dans un tube conique de 50 ml, ce milieu conditionné est utilisé pour étancher la trypsine. Assurez-vous de ne pas dessécher les cellules. Ensuite, ajoutez la trypsine. </li><li> Incuber les cellules à la trypsine pendant 5 min à température ambiante, en tapotant doucement le flacon plusieurs fois pour aider le détachement des cellules. </li><li> Étancher la trypsine en ajoutant 4-5 ml de milieu conditionné dans le ballon avec les cellules individuelles. </li><li> Transférer le milieu et les cellules de la même 50 ml tube conique. Centrifuger le milieu et les cellules à 1200 rpm (~300 xg) pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire, doucement basculer le tube, puis ajouter du milieu frais oligo + GF. Doucement moyen pipette et de cellules de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. </li><li> Compter le nombre de cellules de transfert, et 2.5e6 dans chaque nouvelle PDL revêtu T75 ballon. </li></ol> 3. Étape finale dans la différenciation des oligodendrocytes <ol><li> Après 3 semaines de culture en oligo moyenne + GF, lorsque les cellules sont à confluence de 70-80%, démarrez le processus final de différenciation (figure 1C). </li><li> Préparer le milieu de la même manière que le moyen oligo + GF, mais sans adjonction de quatre GF: Shh, NT-3, bFGF et du PDGF-AA. Ce milieu sans le GF quatre seront définis comme moyen oligo - GF. </li><li> Aspirer le milieu oligo + GF du flacon, rincer une fois avec du PBS puis ajouter un volume total de 16 ml de milieu, dont ¾ (12 ml) est un oligo moyennes - GF et ¼ (4 ml) est PDN milieu conditionné par 6-10 Jours). L&#39;utilisation d&#39;un milieu conditionné provenant PDN n&#39;est pas critique pour le processus de différenciation ou de la survie des cellules. Nous avons en fait constaté que seulement le contact direct avec les cellules de l&#39;AOP PDN dans des expériences de co-culture a eu un effet sur la durée de la survie PDO. Le temps de survie moyen en oligo - GF pourrait être prolongée jusqu&#39;à deux ou trois semaines si les cellules AOP sont co-cultivées avec des cellules PDN. Le protocole de différencier des cellules souches neurales dans PDN est décrit dans une publication antérieure et il ne fait pas partie de ce protocole 1. Retrait du facteur de croissance à partir des résultats de milieux de culture en culture progressivement différenciées des cellules avec plusieurs processus (figure 1D). </li></ol> 4. Essai de cytométrie en flux Le test de cytométrie en flux compare l&#39;acquisition de marqueurs oligodendrocytes au cours du processus de différenciation par rapport à ceux de leur population parentale. <ol><li> Utilisez pro neuronesgéniteurs que le contrôle. Semences cellules PDO à 2,5.10 6 cellules dans deux flacons T75 recouvertes de poly-D-lysine en oligo moyenne + GF. </li><li> Une semaine plus tard, remplacer moyenne avec oligo milieu frais + GF dans des flacons en tant que culture de contrôle pour la viabilité cellulaire, tandis que d&#39;autres flacons ont oligo moyennes - GF. </li><li> Pour dissocier les cellules AOP dans les médias utilisent 20 U / ml de papaïne et la trypsine pas. En effet, la papaïne a un doux effet sur les cellules au cours de la dissociation préserver la morphologie cellulaire. </li><li> Ajouter 5 ml de solution saline équilibrée de Earle (EBSS) dans un flacon à la papaïne. Placer la fiole à 37 ° C pendant 10 minutes, ou jusqu&#39;à ce que la papaïne est totalement dissous et la solution apparaît clairement. C&#39;est la solution la papaïne utilisée pour dissocier les cellules. </li><li> Ajouter 0,5 ml de EBSS à une désoxyribonucléase I (DNase) flacon (tableau 1). Mélanger doucement. Ajouter 0,25 ml de cette solution dans le flacon de la papaïne dissous. Cette préparation contient une concentration finale d&#39;environ 20 U / ml et la papaïne 00,005% DNase. </li><li> Lieu papaïne solution (comme décrit ci-dessus) sur les cellules et incuber à 37 ° C pendant 15-30 min, à surveiller le détachement des cellules à l&#39;aide d&#39;un microscope. Arrêter la réaction avec 5 ml de milieu avec ou sans GF et centrifuger à 1200 tours par minute pendant 7 min. </li><li> Transfert culots cellulaires des deux flacons en deux différents tubes de 5 ml en polypropylène et lavez-les avec le milieu physiologique normal (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES et 10 mM glucose) additionné de 1 mg / ml sérum-albumine bovine (BSA + NPM). </li><li> Effectuer surface immunomarquage à 4 ° C pendant 20 min en utilisant de manière appropriée spécifiques et titré les anticorps primaires pour A2B5, O4, GalC (tableau 2). </li><li> Laver les cellules avec NPM + BSA à 4 ° C pendant 5 minutes et les incuber avec des anticorps secondaires à 4 ° C pendant 20 min (tableau 2). </li><li> Pour colorer les antigènes intracellulaires, y compris la nestine, protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), classe III et êtreta;-tubuline, protéine basique de myéline et (MBP) (tableau 2), fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% (PFA) pendant 20 min à température ambiante et perméabiliser avec de l&#39;éthanol 70% froid pendant 15 min à -20 ° C. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 1x et incuber avec des anticorps secondaires (tableau 2). </li><li> Faire la distinction entre les cellules intactes et les débris subcellulaire lors de l&#39;analyse par cytométrie en flux, colorer les cellules avec 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dichlorhydrate (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> En optimisant le protocole ci-dessus, nous avons effectué toutes les expériences de contrôle appropriés pour confirmer la spécificité de chaque réactif immunologique. En bref, pour les anticorps directement marqués, le contrôle négatif approprié était un anticorps directement conjugués de la classe même isotype d&#39;immunoglobulines (ou sous-classe) et conjugué fluorochrome comme anticorps primaire (c.-à-isotype contrôle). Pour immunomarquage indirect des anticorps primaires, le contrôle négatif approprié wcomme anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome l&#39;intérêt que spécifiquement ciblé la classe d&#39;immunoglobulines (ou sous-classe) de l&#39;hôte dans lequel l&#39;anticorps primaire a été généré. Lorsque anticorps primaires de plusieurs hôtes (souris, lapin, poulet) ont été utilisés ensemble, nous avons utilisé l&#39;anticorps secondaire ciblant l&#39;anticorps primaire de chaque hôte et chaque anticorps secondaire utilisé est généralement contre-adsorbé contre les immunoglobulines des autres hôtes pour minimiser les contre- accueillir immunoréactivité. Les contrôles positifs inclus immunomarquage direct ou indirect des préparations cellulaires connues pour exprimer les antigènes d&#39;intérêt en utilisant soit des réactions immunologiques directs ou indirects avec les anticorps primaires spécifiques de ces antigènes. Les méthodes d&#39;optimisation ci-dessus ont été effectuées une fois pour chaque type d&#39;immunocoloration expériences. Immunoréactions de contrôle n&#39;a pas révélé croisée significative épitope immunoréactivité des anticorps primaires et secondaires. La cytométrie en flux a été réalisée sur uniformesuspension des cellules marquées par fluorescence en utilisant une cellule SE FACVantage trieur (BD Biosciences, San Jose, CA) équipé de trois lasers qui fournissent des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation accordés à 488 nm, 647 nm, et une large UV (351-364 nm) (Figure 2) . </li></ol> 5. Immunofluorescence Remarque: Pour les expériences d&#39;immunofluorescence, PDO sont plaqués en oligo moyenne + GF ou oligo moyennes - GF à 2.5e5 plaques à 6 puits revêtus de PDL. Les cellules sont fixées à 2% de PFA à différents moments après le retrait des facteurs de croissance. L&#39;anticorps tache est réalisée sur plaques de 6 puits en plastique au lieu de lamelles de verre. <ol><li> Retirez le support et ajouter les 2% de PFA. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Jeter PFA. Laver les cellules 3 fois avec du PBS, à 5 min à chaque fois. Veillez à ne pas dessécher les cellules. </li><li> Perméabiliser les cellules pour les marqueurs intracellulaires qui utilisent la solution de triton 0,25% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Pour éviter la liaison non spécifique des cellules de bloc, fou 10 min avec HHG (1 mM de tampon HEPES, de sérum de cheval à 2%, et de sérum de chèvre à 10% dans une solution saline équilibrée de Hank). Diluer anticorps primaires spécifiques (tableau 2) à une concentration prédéterminée dans HHG. Placez anticorps dilué sur les cellules. Incuber 1 h à température ambiante sur l&#39;agitateur ou à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Laver les cellules 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes à chaque fois. Diluer appropriées Anticorps secondaires (tableau 2) couplées à un fluorochrome à une concentration prédéterminée dans HHG. Placer le mélange dilué d&#39;Anticorps secondaires sur les cellules. Incuber 1 h à température ambiante sur un agitateur dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes à chaque fois. </li><li> Pour éviter photoblanchiment ajouter 10 ul de prolonger l&#39;or avec du DAPI dans les cellules et placer une lamelle de verre sur le dessus d&#39;eux. Visualisez les cellules marquées à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (figure 3). </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce protocole décrit la façon de calculer les oligodendrocytes à partir de fœtus humains primaires cellules progénitrices neurales et de caractériser leur phénotype en utilisant la cytométrie en flux à la fois et immunofluorescence. L&#39;expansion et la croissance des progéniteurs neuronaux du système nerveux central du fœtus a été très bien décrit 1-4. Cependant, l&#39;obtention d&#39;oligodendrocytes humains suffisants pour une expérimentation in vitro reste difficile, même si il est possi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td> DME / HAMS F12 01:01 </td><td> Omega scientifique </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Albumine bovine </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Qualité des produits biologiques </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 pg / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Qualité des produits biologiques </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> Composants N2 </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> PeproTech Inc </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Shh </td><td> R &amp; D System </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech Inc </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 pg / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 15712 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Qualité des produits biologiques </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> La papaïne </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> Flacons DNase </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0,005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> Or ProLong avecDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Primaire Abs (tout à 1 ug / ml) </td><td></td><td> Isotype espèces </td><td> Source </td><td> Secondaire Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Cytométrie en flux </td></tr><tr><td> A2B5-biotine </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Cadeau J. Nielson </td><td> Streptavidine PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Cadeau de J. Nielson </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Souris </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Southern Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Poulet </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA </td></tr><tr><td> Nestine </td><td> Souris </td><td> IgG 1 </td><td> Messam et al. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Lapin </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA </td></tr><tr><td> tubuline βIII </td><td> Souris </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2 a-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> Immunocytochimie </td></tr><tr><td> tubuline βIII (1:1,500) </td><td> Souris </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Lapin </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Poulet </td><td> IgY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Souris </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Lapin </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> Anticorps tableau 2 (Abs) utilisés pour la cytométrie en flux et des dosages immunocytochimie conjugués d&#39;anticorps: PE, la phycoérythrine; PETR, la phycoérythrine-Rouge Texas; AMCA, amino-méthyl-coumarine-acétate; Cy, cyanine, FITC, l&#39;isothiocyanate de fluorescéine Ig:.. Immunoglobuline. . AF: Alexa Fluor; gαm: chèvre anti-souris; gαrb: chèvre anti-lapin; dαck: donkey anti-poulet. </td></tr></tbody></table>

progénitrices dérivées de système de culture oligodendrocyte du cerveau foetal humain

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Différenciation des progéniteurs neuronaux de l&#39;homme dans les types de cellules neuronales et gliales propose un modèle pour étudier et comparer la régulation moléculaire du développement neuronal lignée cellulaire. En expansion in vitro des progéniteurs neuronaux du tissu du SNC du fœtus a été bien caractérisée. Malgré l&#39;identification et l&#39;isolement des progéniteurs gliales de l&#39;adulte humain sous-corticale de la substance blanche et le développement des conditions de culture différentes de différenciation directe des cellules progénitrices neurales foetales en oligodendrocytes de myéline produire, acquérir suffisamment oligodendrocytes humains pour une expérimentation in vitro reste difficile. Différenciation des galactocérébroside + (GalC) et O4 + précurseurs d&#39;oligodendrocytes ou cellules progénitrices (OPC) à partir de cellules précurseurs neurales ont été signalés à l&#39;aide du cerveau du fœtus deuxième trimestre. Cependant, ces cellules ne prolifèrent en l&#39;absence de cellules de soutien, y compris les astrocytes et les neurones, et se perdent rapidement au fil du temps dans la culture. Il subsiste le besoin d&#39;un système de culture pour produire des cellules de la lignée oligodendrocytaire apte à une expérimentation in vitro. Culture des oligodendrocytes humains primaires pourrait, par exemple, être un modèle utile pour étudier la pathogenèse de la neurotropes agents infectieux comme le polyomavirus humain, JCV, que in vivo infecte ces cellules. Ces cellules en culture pourrait également fournir des modèles d&#39;autres maladies de démyélinisation du système nerveux central (SNC). Primaire, du fœtus humain dérivé du cerveau, les cellules progénitrices neurales pluripotentes proliférer in vitro tout en conservant la capacité de se différencier en neurones (progéniteurs des neurones dérivés, PDN) et les astrocytes (progéniteurs dérivés des astrocytes, PDA) Cette étude montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites se différencier grâce à de nombreux stades de développement lignée oligodendrogliome (progéniteurs des oligodendrocytes dérivées, AOP). Nous cellules progénitrices neurales culture dans du DMEM-F12 sans sérum supplemented avec le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), le facteur neurotrophique 3 (NT-3), N-2 et de la triiodothyronine (T3). Les cellules cultivées sont passées à cellules 2.5e6 par flacons de 75 cm environ tous les sept jours. L&#39;utilisation de ces conditions, la plupart des cellules en culture maintenir une morphologie caractérisée par quelques procédés et expriment des marqueurs de cellules pré-oligodendrocytes, telles que A2B5 et O-4. Quand nous enlevons les facteurs de croissance quatre (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) et ajouter milieux conditionnés provenant de PDN, les cellules commencent à acquérir davantage de processus et de marqueurs spécifiques expresses de la différenciation des oligodendrocytes, comme GalC et de la myéline protéine de base (MBP). Nous avons effectué la caractérisation phénotypique par cytométrie en flux multicolores pour identifier des marqueurs uniques de oligodendrocytes.

Il est très important de commencer le processus de différenciation à partir d&#39;un 70% -80% culture confluente de cellules progénitrices de neurones (figure 1A). De nombreuses cellules meurent après avoir changé le milieu de culture des progéniteurs à moyen oligo car il inclut des facteurs de croissance spécifiques. Ceci indique que la croissance des cellules progénitrices neurales ne s&#39;engagent pas à un phénotype oligodendrogliome ne seront pas pris en charge par le nouveau média (figure ...

Primaire, l&#39;homme dérivés du cerveau du fœtus, des cellules progénitrices multipotentes prolifèrent<em&gt; In vitro</em&gt; Tout en maintenant la capacité de se différencier en neurones et les astrocytes. Ce travail montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites à se différencier par des étapes de la lignée oligodendrogliome par le conditionnement des facteurs de croissance choisis.

Progénitrices dérivées de Système de culture Oligodendrocyte du cerveau foetal humain

La différenciation des progéniteurs neuraux humains en types cellulaires neuronaux et gliaux offre un modèle pour étudier et comparer la régulation moléculaire du développement des lignées cellulaires neurales. L'expansion in vitro de progéniteurs neuraux issus de tissus du SNC fœtal a été bien caractérisée. Malgré l'identification et l'isolement de progéniteurs gliaux à partir de la substance blanche sous-corticale humaine adulte et le développement de diverses conditions de culture pour orienter la différenciation des progéniteurs neuraux fœtaux en oligodendrocytes producteurs de myéline, l'obtention d'un nombre suffisant d'oligodendrocytes humains pour l'expérimentation in vitro demeure difficile. La différenciation de cellules précurseurs ou progénitrices d'oligodendrocytes (OPC) GalC+ (galactocérébroside) et O4+ à partir de cellules précurseurs neurales a été rapportée en utilisant du cerveau fœtal du deuxième trimestre. Cependant, ces cellules ne prolifèrent pas en l'absence de cellules de soutien, notamment les astrocytes et les neurones, et disparaissent rapidement au fil du temps en culture. Il existe toujours un besoin pour un système de culture permettant de produire des cellules de la lignée oligodendrocytaire adaptées à l'expérimentation in vitro. La culture d'oligodendrocytes humains primaires pourrait, par exemple, constituer un modèle utile pour étudier la pathogenèse d'agents infectieux neurotropes tels que le polyomavirus humain, le JCV, qui infecte ces cellules in vivo. Ces cellules cultivées pourraient également fournir des modèles d'autres maladies démyélinisantes du système nerveux central (SNC). Les cellules progénitrices neurales multipotentielles primaires, dérivées du cerveau fœtal humain, prolifèrent in vitro tout en conservant la capacité de se différencier en neurones (neurones dérivés de progéniteurs, PDN) et en astrocytes (astrocytes dérivés de progéniteurs, PDA). Cette étude montre que les progéniteurs neuraux peuvent être induits à se différencier à travers bon nombre des stades du développement de la lignée oligodendrocytaire (oligodendrocytes dérivés de progéniteurs, PDO). Nous cultivons les cellules progénitrices neurales dans un milieu DMEM-F12 sans sérum, supplémenté en facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), facteur neurotrophique 3 (NT-3), N-2 et triiodothyronine (T3). Les cellules cultivées sont repiquées à raison de 2,5e6 cellules par flacon de 75 cm environ tous les sept jours. Dans ces conditions, la majorité des cellules en culture conservent une morphologie caractérisée par peu de prolongements et expriment des marqueurs de cellules pré-oligodendrocytaires, tels que A2B5 et O-4. Lorsque nous retirons les quatre facteurs de croissance (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) et ajoutons du milieu conditionné provenant de PDN, les cellules commencent à acquérir davantage de prolongements et expriment des marqueurs spécifiques de la différenciation oligodendrocytaire, tels que la GalC et la protéine basique de la myéline (MBP). Nous avons réalisé une caractérisation phénotypique par cytométrie en flux multicolore afin d'identifier les marqueurs uniques de l'oligodendrocyte.

Ce vidéo montre une méthode de différenciation de cellules souches neuronales primaires fœtales humaines en oligodendrocytes. D'abord, les cellules souches neuronales sont cultivées dans un milieu de progéniteur jusqu'à une confluence quasi complète. Le milieu de progéniteur est ensuite remplacé par un milieu d'oligodendrocyte, enrichi avec les facteurs de croissance qui favorisent le processus de différenciation. Les cellules sont ensuite cultivées et amplifiées pendant trois semaines.Le milieu pour oligodendrocytes enrichi en facteurs de croissance est ensuite remplacé par un milieu pour oligodendrocytes dépourvu de facteurs de croissance, et les cellules sont cultivées pendant six à dix jours supplémentaires jusqu’à l’observation, par microscopie, de changements phénotypiques. La différenciation est ensuite confirmée par microscopie en immunofluorescence et cytométrie en flux à l’aide d’anticorps spécifiques de la lignée des oligodendrocytes. Enfin, les oligodendrocytes correctement différenciés peuvent être utilisés pour des études in vitro de la biologie des oligodendrocytes et de leurs interactions avec des agents infectieux tels que le polyomavirus humain JCV.Un des véritables avantages de la technique que nous avons mise au point dans ce laboratoire, par rapport à ce qui figure déjà dans la littérature publiée, est que, dans notre système, les oligodendrocytes peuvent être cultivés et différenciés sans avoir besoin de cellules d'appoint telles que les astrocytes et les neurones. Un autre avantage de notre protocole, selon nous, est qu'il permet de cultiver un grand nombre de ces précurseurs d'oligodendrocytes exprimant des marqueurs tels que Oh4, qui peuvent être développés en culture pathogène pendant plusieurs semaines en populations cellulaires nombreuses tout en maintenant leur phénotype. Le résultat final de la différenciation nous donne une population presque pure d'oligodendrocytes.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en consultant la littérature approfondie sur la différenciation in vitro d'oligodendrocytes dans des cellules de rat et mes cellules. D'autres chercheurs retiraient également des facteurs de croissance de cultures restreintes afin de permettre l'achèvement de la différenciation cellulaire. Cette procédure sera démontrée selon notre protocole par Alexa Bandon, une étudiante de premier cycle dans notre laboratoire ici au N-I-N-D-S.En prévision de la différenciation, cultiver une population multipotente de cellules souches neurales dans des flacons revêtus de polylysine, en milieu basal neuronal supplémenté en BFGF et en EGF, et éliminer toutes les cellules non utilisées. Après 11 jours, lorsque la culture atteint une confluence d’environ 70 à 80 %, initier la différenciation. Pour ce faire, aspirer le milieu des cellules souches des flacons.Rincez les cellules une fois avec du PBS, puis ajoutez 12 millilitres de milieu oligo contenant des facteurs de croissance. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone. Après une semaine, les cellules restantes présenteront une morphologie bipolaire étroite.Lorsque les cellules différenciées atteignent au moins 70 % de confluence, retirez le milieu et transférez-le dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Mettez de côté le milieu conditionné conservé pour une utilisation ultérieure. Ensuite, ajoutez rapidement quatre millilitres de trypsine 0,05 %, EDTA 0,1 % aux cellules et incubez-les pendant cinq minutes à température ambiante.Tapotez doucement le flacon plusieurs fois pour favoriser le détachement des cellules. Après l'incubation, arrêtez l'action de la trypsine en ajoutant quatre à cinq millilitres du milieu conditionné conservé au flacon. Ensuite, transférez le milieu et les cellules dans un tube conique de 50 millilitres.Ensuite, centrifuger le milieu et les cellules à 310 RCF pendant sept minutes à température ambiante. Une fois la centrifugation terminée, aspirer le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire en tapotant doucement le tube, puis ajouter du milieu oligo frais contenant des facteurs de croissance.Pipetez doucement le milieu et les cellules de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire homogène. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, transférez 2,5 millions de cellules dans de nouveaux flacons T 75 revêtus de poly-L-lysine, et placez la culture dans l’incubateur ; après trois semaines, lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 85 %, aspirez le milieu oligo contenant les facteurs de croissance du flacon.Rincer une fois avec du PBS, puis ajouter 12 millilitres de milieu oligo sans facteurs de croissance et 4 millilitres de milieu non conditionné de neurones dérivés de progéniteurs. Maintenir les cellules dans ce milieu pendant six à dix jours, en alternant les jours. Examiner les cellules par microscopie de contraste de phase afin d’évaluer la différenciation et la confluence, et remplacer au moins 50 % du milieu après le retrait des facteurs de croissance ; les cellules développeront progressivement de multiples prolongements, indiquant une différenciation réussie en oligodendrocytes dérivés de progéniteurs.À ce stade, les oligodendrocytes dérivés des progéniteurs peuvent être utilisés pour des expériences de cytométrie en flux ou d'immunofluorescence, comme décrit dans les sections suivantes de cette vidéo. Le test de cytométrie en flux compare l'acquisition de marqueurs d'oligodendrocytes au cours du processus de différenciation par rapport à ceux de leur population parentale. Les cellules progénitrices neuronales humaines sont utilisées comme témoins C. Placer 2,5 millions de cellules oligodendrocytaires dérivées de progéniteurs dans chacun de deux flacons T 75 revêtus de poly-d-lysine, en milieu oligo contenant des facteurs de croissance, et incuber à 37 degrés Celsius. Une semaine plus tard, remplacer le milieu dans un flacon par du milieu oligo frais contenant des facteurs de croissance, afin de servir de témoin pour la viabilité cellulaire.Remplacer le milieu dans le deuxième flacon par du milieu oligo frais sans facteurs de croissance. Cultiver ces cellules jusqu'à 10 jours ; trois à neuf jours après le retrait des facteurs de croissance, les cellules commenceront à développer davantage de prolongements typiques d'un phénotype d'oligodendrocyte. Pour dissocier les oligodendrocytes dérivés des progéniteurs, aspirer le milieu et ajouter 5,25 millilitres de solution perian à chaque flacon.Le perian est utilisé à la place de la trypsine car il a un effet plus doux sur les cellules pendant la dissociation. Pour préserver la morphologie cellulaire, incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes. Vérifier périodiquement le détachement des cellules à l’aide d’un microscope.Une fois les cellules détachées, ajoutez cinq millilitres de milieu avec ou sans facteurs de croissance pour arrêter la réaction. Ensuite, transférez le contenu de chaque flacon dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les tubes à 310 RCF pendant sept minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et resuspendez les culots cellulaires dans quatre millilitres de milieu physiologique normal, supplémenté avec un milligramme par millilitre d'albumine sérique bovine ou de NPM plus BSA.Ensuite, comptez les cellules comme précédemment, puis répartissez 1 million de cellules pour chaque condition d'immunomarquage dans un tube polypropylène de cinq millilitres. Veillez à inclure tous les contrôles appropriés afin de confirmer la spécificité de chaque réactif immunitaire. Pour réaliser l'immunomarquage, les cellules sont d'abord incubées avec des anticorps dirigés contre les protéines de surface A deux B 5, 0 4 et gal C. Les cellules sont ensuite lavées pour éliminer les anticorps primaires non liés, puis incubées avec les anticorps secondaires marqués au fluorochrome approprié.Les cellules sont ensuite lavées à nouveau pour éliminer les anticorps secondaires. Fixées avec du paraldéhyde à 2 % et perméabilisées avec de l'éthanol froid à 70 %, les cellules sont ensuite lavées puis incubées avec des anticorps dirigés contre la nestine, la protéine acide fibrillaire gliale, la tubuline bêta de classe III et la protéine basique de la myéline. Après élimination par lavage des anticorps primaires non liés.Les cellules sont incubées avec les anticorps secondaires marqués par le fluorochrome approprié. Enfin, afin de discriminer entre les cellules intactes et les débris subcellulaires lors de l'analyse par cytométrie en flux, les cellules sont traitées avec quatre six DIA medino. Deux phénols Lind dihydrochlorure ou dappy permettent d'effectuer la cytométrie en flux sur un appareil équipé de trois lasers, fournissant des longueurs d'onde d'excitation réglées à 488 nanomètres, 647 nanomètres et une lumière UV large. En prévision de la microscopie en immunofluorescence, préparez six couches de poly-D-lysine revêtues.Plaques de 6 puits contenant 250 000 cellules d'oligodendrocytes dérivés de progéniteurs par puits. Deux plaques sont nécessaires pour chaque point temporel. L'une est cultivée avec des facteurs de croissance et l'autre sans, lorsque les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 %.Aspirez le milieu contenant les facteurs de croissance à partir de la plaque. Rincez une fois avec du PBS, puis ajoutez 12 millilitres de milieu sans facteurs de croissance. Réalisez la coloration immunohistochimique cinq et neuf jours après le retrait des facteurs de croissance comme suit : fixez d'abord les cellules avec du PFA à 2 % pendant 10 minutes à température ambiante.Ensuite, éliminer le PFA et laver les cellules trois fois avec du PBS, cinq minutes à chaque fois. Puis traiter les cellules avec 0,25 % de Triton, puis bloquer les cellules avec 2 % de sérum de cheval et 10 % de sérum de chèvre afin d'éviter la liaison non spécifique. Après le blocage, incuber les cellules avec des anticorps dirigés contre la béta-tubuline trois, la G-F-A-P-M-V-P oh quatre et la galactocérébroside C. Laver ensuite les anticorps non liés à partir des cellules et incuber les cellules avec les anticorps secondaires marqués au fluorochrome approprié.Lavez les anticorps secondaires non liés provenant des cellules, puis évitez le photoblanchiment et la décoloration. Montez les noyaux. Placez le coverslip en utilisant 10 microlitres de prolongé gold avec dpi.Visualisez les cellules marquées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé du jeu de filtres approprié afin de déterminer si les cellules progénitrices neuronales primaires humaines peuvent se différencier en oligodendrocytes. Les cellules progénitrices neuronales multipotentes ont été cultivées comme décrit dans cette vidéo. Les changements phénotypiques ont ensuite été suivis par cytométrie en flux et microscopie en immunofluorescence.Comme on peut le voir ici, la majorité des progéniteurs neuronaux expriment le marqueur des cellules souches neuroépithéliales nesting, tandis que seules de petites sous-populations expriment des marqueurs restrictifs de lignage tels que le marqueur des astrocytes, GFAP, le marqueur neuronal, la bêta-tubuline de classe trois, ou le marqueur des oligodendrocytes, oh four. Lorsque le milieu de culture a été remplacé par un milieu oligo supplémenté en facteurs de croissance et que les cellules ont été cultivées pendant une semaine, une diminution de l'expression de nesting et une augmentation de l'expression de A two B five ont été observées après deux semaines.L'expression de Nestine a été encore davantage réduite, et l'expression du marqueur de précurseur neuroglial A deux B cinq a augmenté ; l'expression d'un autre marqueur d'oligodendrocyte, oh quatre, a également augmenté deux jours après le retrait du facteur de croissance. L'expression d'oh quatre et celle de GAL C, un marqueur tardif d'oligodendrocyte, ont augmenté six jours après le retrait du facteur de croissance. La co-expression d'oh quatre et de gal C a augmenté et était comparable à la co-expression de gal C et de MBP.La coloration immuno à épitopes multiples révèle que 72 % des cellules en culture exprimaient la MBP. Des preuves supplémentaires de la différenciation des oligodendrocytes issues de progéniteurs ont été obtenues à l’aide d’un dosage par immunofluorescence. Deux jours après le retrait des facteurs de croissance, l’expression de la MVP, visualisée en vert, a été détectée.Cela a été augmenté au jour cinq et davantage augmenté au jour neuf. La localisation de la MVP dans les oligodendrocytes différenciés est évidente. Dans leur ensemble, ces données indiquent que les cultures de cellules souches neurales fœtales humaines utilisant la méthode décrite sont capables de proliférer in vitro tout en conservant la capacité de se différencier à travers les stades de la lignée des oligodendrocytes.Après le développement de ce protocole, la technique permet effectivement aux chercheurs dans les domaines de la biologie du développement, de la neurosciences et de la virologie d'étudier la biologie du cerveau humain et les maladies qui affectent le cerveau humain, en particulier celles qui entraînent des maladies de la substance blanche.

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