Bacterial Detection & identification au moyen de capteurs électrochimiques

L’objectif général de l’expérience suivante est de détecter et d’identifier les bactéries à l’aide de capteurs électrochimiques. Ceci est réalisé en libérant d’abord l’ARN ribosomique de la bactérie pour permettre l’hybridation avec la sonde du détecteur fluoré, comme une deuxième étape, l’ARN ribosomique lié à la sonde du détecteur est ajouté à l’électrode de travail, ce qui permet l’hybridation avec la sonde de capture sur la surface du capteur. Ensuite, le conjugué anti-fluorescéine de raifort peroxydase est autorisé à se lier à la sonde du détecteur fluorée.

Enfin, dans le courant interférométrique, dont l’intensité est corrélée avec le nombre de sondes de capture ribosomal, on peut obtenir des complexes de sondes de détection d’ARN à la surface du capteur. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes basées sur la culture est que les bactéries peuvent être détectées et identifiées en 45 minutes environ, évitant ainsi le poids de la nuit. Pour qu’une bactérie forme une colonie visible sur une plaque EDGAR L’application de cette technique permettrait d’améliorer la gestion des maladies infectieuses.

La détection précoce des agents pathogènes bactériens est essentielle pour une antibiothérapie ciblée et l’amélioration des résultats cliniques. Bien que cette méthode soit utile pour le diagnostic des maladies infectieuses, elle peut également être appliquée à d’autres problèmes de diagnostic tels que l’immunodiagnostic. Commencez par incuber la sonde de capture dilatée avec de l’hexane di thiol pendant 10 minutes à température ambiante pour vous assurer que le groupe thiol sur la sonde de capture est réduit, ce qui permet d’obtenir des résultats plus cohérents.

Après l’incubation, appliquez un courant d’azote pour porter de l’or. 16 puces de réseau de capteurs pendant cinq secondes Pour éliminer toute humidité ou particules, de petits volumes de liquide doivent être soigneusement appliqués sur l’électrode de travail dans le réseau de capteurs. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle.

L’exécution correcte des techniques de pipetage, de lavage et de séchage réduit considérablement la variabilité d’une puce à l’autre. Ensuite, appliquez six microlitres du mélange de sonde de capture dilatée HDT sur l’électrode de travail des 16 capteurs du réseau de capteurs et stockez les puces de capteur dans une boîte de Pétri couverte à quatre degrés Celsius pendant la nuit suivante, lavez les puces de capteur avec de l’eau déminéralisée pendant deux à trois secondes, puis séchez les puces sous un jet d’azote pendant cinq secondes. Appliquez maintenant six microlitres de chlorhydrate d’attri, de chlorure de sodium, de solution d’EDTA MERCAPTOETHANOL sur l’électrode de travail des 16 capteurs, et incubez les capteurs pendant 50 minutes dans une boîte de Pétri à température ambiante.

Préparer les échantillons pour le dosage des capteurs électrochimiques. Transférez un millilitre de culture bactérienne en phase logarithmique de croissance dans un microtube à centrifuger, puis centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 16 000 g. Veuillez noter que les bactéries pathogènes doivent être manipulées dans une cagoule de biosécurité.

Après avoir retiré la rondelle, appliquez une pointe de pipette contenant 10 microlitres d’hydroxyde de sodium molaire au fond du tube de micro-centrifugeuse et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour remettre complètement la pastille en suspension. Après avoir incubé la suspension à température ambiante pendant cinq minutes, ajoutez 50 microlitres de PBS contenant de l’albumine sérique bovine ou BSA et une sonde détecteur modifiée à la fluorescéine pour neutraliser le lysat bactérien. Incuber ensuite le lysat neutralisé pendant 10 minutes à température ambiante.

Commencez cette étape en lavant la solution de mercaptoéthanol de l’une des puces de capteur préparées avec de l’eau déminéralisée pendant deux à trois secondes. Après avoir séché la puce comme nous venons de le démontrer, appliquez quatre microlitres de lysat de bactéries neutralisées sur les électrodes de travail. 14 des capteurs.

Appliquez ensuite quatre microlitres de l’oligonucléotide de pontage dans la sonde de détection modifiée PBS plus BSA plus fluorescéine sur les deux capteurs de contrôle positif. Ensuite, après avoir incubé les capteurs de lysat et de contrôle positif pendant 15 minutes, lavez puis séchez toute la puce du capteur comme précédemment. Appliquez maintenant quatre microlitres de peroxydase de raifort anti-fluorescéine ou HRP dans du PBS contenant de la caséine sur les électrodes de travail des 16 capteurs.

Après une incubation de 15 minutes, lavez et séchez la puce du capteur. Ensuite, appliquez un autocollant de puits de film sur la surface de la puce du capteur et chargez la puce dans la pipette de support de puce de capteur de 50 microlitres de substrat TMB sur les 16 capteurs et fermez le support de puce de capteur. Enfin, utilisez un lecteur de puce Helios pour obtenir des mesures de pyrométrie et de télémétrie cyclique pour l’ensemble des 16 capteurs.

L’hybridation de l’ARN avec des sondes de capture et de détection est développée par une réaction redox catalysée par HRP conjuguée à des fragments d’anticorps anti-fluorescéine qui se lient à la liaison fluorescéine de pin sur la sonde détecteur. Un élément important de la sensibilité du dosage est la chimie de surface de l’électrode d’or. L’électrode en or est recouverte de mercaptoéthanol et d’huile et est fonctionnalisée par l’ajout de sondes de capture dilatées.

L’hybridation en sandwich de l’ARN ribosomique cible avec la sonde de capture et la sonde du détecteur marquée à la fluorescéine donne un complexe qui est détecté par l’ajout du conjugué anti-fluorescéine de raifort peroxydase et du substrat TMB. Le courant paramétrique M est généré par le cycle redox qui résulte de l’oxydation du TMB par la peroxydase de raifort et de la réduction du TMB par les électrons de l’électrode. Les tests présentés ici utilisent une puce de réseau de 16 capteurs gene fluidique.

Chacun des capteurs du réseau contient trois électrodes, de référence fonctionnelle et auxiliaire, qui ont des points de contact sur le bord de la puce. Le lecteur de puce a des broches pogo qui se connectent à chacun des points de contact. Le lecteur de puce sert d’interface pour le réseau de capteurs avec un potentiomètre contrôlé par un algorithme informatique.

Ici, des exemples de flux de courant de capteur électrochimique sont présentés. Le flux de courant dans les capteurs est artificiellement élevé dans les capteurs pendant les premières secondes après le début des mesures paramétriques. En raison de l’accumulation de substrat oxydé entre l’application de TMB sur la surface du capteur et le lancement de l’algorithme de lecture, le flux de courant atteint rapidement un état stable et des lectures précises du capteur peuvent être obtenues de manière fiable en 60 secondes.

La variabilité d’un capteur à l’autre est relativement constante, il est donc possible d’effectuer 16 tests de capteur différents en parallèle sur le gène fluidique 16 puces de capteurs, les contrôles positifs et négatifs sont essentiels en tant que contrôle positif. Un oligonucléotide d’ADN de pontage synthétique qui s’hybride à la fois avec les sondes de capture et de détection et sert de cible synthétique de concentration connue est utilisé de cette manière. Les résultats obtenus en utilisant la fonction d’oligonucléotide de pontage comme contrôle d’étalonnage interne pour minimiser la variation d’une puce à l’autre.

Plus le courant négatif de l’électrode est important, plus le signal est élevé. Lors du test des sondes de capture et de détection. La limite de détection doit être déterminée par la dilution en série d’un échantillon de concentration connue, comme le montre cette figure, il existe une corrélation logarithmique linéaire entre la concentration de l’échantillon et la sortie du signal sur la plage dynamique de l’essai.

Dans ces graphiques à barres, les résultats représentatifs pour les échantillons contenant de l’esia coli et du klebseal et de l’ammoniac, qui sont fréquemment trouvés dans l’urine des patients atteints d’une infection des voies urinaires, montrent que les signaux pour la plupart des capteurs seront faibles et similaires, et ces résultats négatifs peuvent être regroupés car la réactivité du signal de fond avec la paire de sondes KE distingue le canon de l’e coli. L’oligonucléotide de pontage sert de contrôle positif et d’étalon d’étalonnage interne. Cette technique peut être appliquée à la détection de bactéries résistantes aux antibiotiques dans des échantillons cliniques en mesurant la réponse phénotypique des bactéries aux antibiotiques.

Cette technique peut être utilisée pour déterminer le traitement optimal pour un patient individuel. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter et d’identifier les bactéries en comparant les courants attriques dans les différents capteurs spécifiques à l’espèce de la puce.