Fabrication et utilisation de ferroutage Multibarrel Électrodes pour

Cette procédure vise à appliquer de manière iontophorétique des agents pharmacologiques à des microcircuits cérébraux tout en enregistrant simultanément l'activité neuronale. Tout d'abord, tirez une électrode en verre à barillet unique pour l'enregistrement unitaire et courbez-en la pointe. Ensuite, tirez une électrode en verre multibarillet et cassez sa pointe jusqu'au diamètre souhaité.

Procédez au montage des deux électrodes. L'électrode produite est finalement utilisée pour des enregistrements extracellulaires in vivo, permettant l'application sur demande d'agents pharmacologiques afin de manipuler les microcircuits neuronaux. Bonjour, je m'appelle le Dr. Achim Klu, et notre laboratoire va vous montrer aujourd'hui comment fabriquer des électrodes multi-barillets en configuration « piggyback ».

Ces électrodes peuvent être utilisées pour ionophoréser des agonistes et des antagonistes neuronaux dans le microenvironnement d'un neurone, et ainsi manipuler les circuits neuronaux d'un neurone in vivo. Bonjour, je suis le Dr. An Zillow. Je suis postdoctorant dans le laboratoire du Dr. Ah him Crow, et je vais démontrer la procédure aujourd'hui. Pour une électrode à barillet unique, utilisez un capillaire en verre à simple barillet avec filament, et étirez l'extrémité jusqu'à un diamètre d'environ un à deux micromètres, avec une longueur de tige de 10 à 12 millimètres.

Vérifiez de façon sporadique la résistance de l'électrode tirée en la remplissant avec du chlorure de sodium à trois molaire et en la testant avec un mètre O standard dans une solution saline à 0,9 %. Une fois l'électrode remplie de solution saline, celle-ci s'évapore rapidement, rendant l'électrode inutilisable. Par conséquent, effectuez uniquement ce test.

Utilisez des électrodes qui ne seront pas employées pour la production en piggyback. Pour créer une électrode multibarreaux complète, tirez le verre jusqu'à obtenir une pointe de pipette d'un diamètre total d'environ 10 micromètres ou moins. Une électrode dotée d'une pointe correctement tirée est essentielle pour réussir.

En plus d'être longue et fine, la pointe doit tout de même être rigide et se casser facilement jusqu'au diamètre souhaité. La pointe sera cassée au diamètre correct à l'étape suivante. Ainsi, la taille exacte de la pointe est moins critique pendant le processus de regroupement que la forme générale de la pointe de l'électrode, qui doit être longue et relativement fine.

Maintenant, tenez l'électrode à un canal à environ 45 degrés, la pointe orientée vers le bas, et faites-la passer rapidement dans la flamme. Visez pour que la flamme fonde le verre dans la zone de transition à environ 10 millimètres de l'extrémité de l'électrode afin de la courber d'environ 20 degrés. Placez l'électrode à plusieurs canaux dans un lit d'argile à modeler sur une lame de verre, puis insérez-la dans les supports du microscope.

Support de lame En utilisant les manipulateurs XY du porte-objectif du microscope, déplacez délicatement la pointe de l'électrode contre la pièce en plexiglas. Observez la rupture de la pointe à travers les oculaires du microscope. Le montage de l'ensemble de l'électrode est illustré ici.

L'électrode multibarreaux est maintenue sur une lame de verre placée sur la platine du microscope. L'électrode monobranchie, quant à elle, est tenue par un manipulateur manuel à plusieurs axes, ce qui permet à l'utilisateur d'abaisser la pipette monobranchie sur l'électrode multibarreaux avec une grande précision. Abaissez l'électrode monobranchie directement dans la rainure de l'électrode multibarreaux, formée par l'arrangement des cinq barreaux, de sorte que sa pointe dépasse celle de l'électrode multibarreaux d'environ cinq à dix micromètres.

Collez les tiges des deux électrodes ensemble à l’aide de cyanoacrylate. Commencez à l’extrémité la plus distale des pointes et déplacez lentement un cure-dent portant une goutte de colle le long des tiges des électrodes en direction des pointes. Appliquer de la colle trop près des pointes des électrodes obstruera ces dernières et rendra l’électrode au moins partiellement non fonctionnelle.

Préparer une petite quantité de ciment dentaire. Laisser sécher environ 15 minutes. Ensuite, retirer soigneusement l'électrode assemblée.

D'abord, retirez l'électrode du support du micromanipulateur, puis détachez-la de la lame de verre. Juste avant d'utiliser l'électrode, préparez-vous à remplir chaque canal avec le médicament correspondant. Remplissez les quatre canaux extérieurs de la configuration à cinq canaux avec quatre médicaments au choix, et le canal central avec du chlorure de sodium à trois molarités, servant de canal d'équilibrage.

Ensuite, remplissez l'électrode d'enregistrement à un seul barillet avec du chlorure de sodium à trois molaire. Allumez maintenant les modules de pompe d'ionophorèse et testez tous les barillets. La fonction de test d'électrode de chaque module de pompe permettra de déterminer si le barillet de l'électrode est fonctionnel pour les enregistrements cérébraux profonds.

Une électrode à cinq canaux terminée, assemblée avec une électrode d'enregistrement à un seul canal, possède une tige longue d'environ sept millimètres. Plusieurs agonistes et antagonistes synaptiques sont couramment utilisés en iontophorèse, bloquant l'inhibition glycinergique à l'aide de médicaments tels que les antagonistes des récepteurs de la glycine. Le chlorure de strychnine augmente généralement l'activité de décharge des neurones.

Ces données mesurent la fréquence de décharge d'un neurone auditif en fonction de l'intensité, et montrent les réponses à des stimuli sonores sinusoïdaux d'intensité croissante appliqués aux oreilles de l'animal. Des sons plus forts ont entraîné des fréquences d'impulsions plus élevées avant l'application du strict nine. La fonction fréquence-intensité du neurone montre des fréquences d'impulsions faibles.

L'application d'un courant d'iontophorèse initial de 15 nanoampères stimule une légère augmentation du courant d'éjection. Des courants d'éjection de plus en plus élevés bloquent progressivement un plus grand nombre de récepteurs de la glycine au niveau du neurone, entraînant des fréquences de décharge de plus en plus élevées. À un courant de 45 nanoampères, tous les récepteurs de la glycine de ce neurone semblent être bloqués par le chlorure de strychnine.

Toute augmentation supplémentaire du courant d'éjection et le relâchement d'une quantité encore plus importante de neuf strict n'ont pas entraîné de changement supplémentaire. Le niveau de la fréquence de décharge des neurones après la fin de l'iontophorèse retrouve sa valeur de base ; la récupération complète des réponses neuronales se produit environ 25 minutes après. Ce processus de récupération dépend du type et de la quantité de médicament éjecté.

Il est important de garder à l'esprit que le médicament ferre va diffuser dans le voisinage du site d'enregistrement et pourrait également bloquer les récepteurs des neurones voisins. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment combiner une électrode d'enregistrement avec une électrode multibarillet pour médicament afin d'obtenir des enregistrements cérébraux profonds à faible bruit, ainsi qu'une administration contrôlée dans le temps d'au plus quatre agents pharmacologiques.