En utilisant l'ARN médiée par la stratégie d'alimentation interférences à l'écran pour des gènes impliqués dans le règlement de la taille du corps du nématode C. elegans

Cette vidéo montre une procédure d’identification des gènes qui régulent, voir la croissance et la taille du corps. En utilisant l’interférence ARN ou l’œil de l’ARN pour inactiver les gènes candidats, les premières plaques contenant des bactéries exprimant l’ARN double brin, qui ciblent les gènes d’intérêt, sont préparées. Les hermaphrodites du quatrième stade larvaire sont transférés vers les plaques ARNi.

Une fois qu’ils atteignent le stade de jeune adulte, ils sont transférés vers de nouvelles plaques d’ARNAI pour pondre des œufs. Après plusieurs heures, ils sont retirés, laissant des populations synchronisées d’embryons. Au stade de développement souhaité, la progéniture est recueillie et montée sur des lames.

Enfin, des images microscopiques des vers sont acquises. L’analyse de l’image montre des changements dans la taille du corps causés par l’inactivation des gènes. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour identifier les régulateurs de la voie de signalisation TGF bêta, elle peut également être appliquée à d’autres voies qui régulent le développement post-embryonnaire dans l’élégance marine, telles que la voie de signalisation de l’insuline.

Commencez cette procédure en clonant les séquences du gène cible dans le vecteur L 4 4 4 0 Un plasmide ARNi de ver couramment utilisé pour transformer le plasmide recombinant en souche bactérienne. HT un 15 DE trois culture. Les bactéries transformées sur des plaques de gélose LB avec 25 microgrammes par millilitre de carbonique et 12,5 microgrammes par millilitre de tétracycline, puis choisissent un seul clone pour une utilisation future.

Pendant ce temps, transformez le vecteur vide L 4 4 4 0 en souche bactérienne. HT un 15. À utiliser comme contrôle pour la culture expérimentale, les bactéries transformées dans un millilitre de bouillon LB avec 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

La tétracycline n’est pas ajoutée car elle diminue l’efficacité de l’ARN. Ajoutez encore cinq millilitres de bouillon LB avec 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline à la culture de nuit, puis incubez pendant quatre à six heures supplémentaires à 37 degrés Celsius. Une fois la culture prête, ensemencez 0,5 millilitre de bactéries expérimentales ou de contrôle sur les plaques de vers ARNi étiquetées avec le nom de clone approprié.

Au moins deux plaques doivent être préparées pour chaque condition. Incuber les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain.

Il devrait y avoir une pelouse de bactéries qui expriment l’ARNi avec ou sans la séquence du gène cible. Les animaux utiliseront la bactérie comme source de nourriture. Une fois que les plaques d’alimentation de l’ARNA sont prêtes, des flammes stérilisent l’extrémité d’un fil de platine.

Ensuite, utilisez le fil de platine pour transférer six à dix hermaphrodites du quatrième stade larvaire ou L quatre hermaphrodites elgan C dans chaque plaque ARNi. Laissez les hermaphrodites pousser à 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, les animaux seront de jeunes adultes.

Transférez-les dans une nouvelle plaque d’ARNAI correctement étiquetée et préparée. Incuber les plaques à 20 degrés Celsius pendant quatre à six heures pour permettre aux adultes de pondre des œufs. Après l’incubation, retirer tous les adultes de la plaque pour synchroniser la descendance.

Une fois les adultes retirés, commencez à compter le temps. C’est le temps zéro. Incuber les plaques à 20 degrés Celsius pour permettre aux animaux de grandir jusqu’au stade de développement d’intérêt.

Ici, de jeunes adultes seront choisis pour une analyse phénotypique. Pour les knockdowns qui se développent à un rythme normal, une incubation de 72 heures est nécessaire. Gardez à l’esprit que divers gènes affectent différemment le développement des animaux, de sorte que les temps d’incubation peuvent devoir être ajustés.

Si l’ARNi provoque la croissance des animaux à un rythme différent, les jeunes adultes peuvent être identifiés comme ceux qui n’ont pas plus de 24 heures après L quatre avec un développement VUL terminé et deux à six embryons dans l’utérus, comme illustré ici. Pour identifier d’autres stades de développement, l’investigateur doit utiliser le développement des gonades et des VUL comme guide. Une fois que les animaux ont atteint le stade approprié, préparez-vous à noter les phénotypes de taille corporelle des vers traités à l’ARNi.

Ensuite, placez deux couches de ruban adhésif d’étiquette coloré sur une lame d’échantillon en verre d’un millimètre d’épaisseur, comme illustré ici. Fabriquez deux de ces lames de verre. Placez ensuite une nouvelle lame de verre entre les deux lames avec le ruban adhésif et appliquez une goutte de 2 %Agros fondu dans l’eau.

Au centre de la nouvelle lame de verre, appuyez sur une deuxième lame de verre sur le dessus pour former un mince tampon agros. Une fois que l’agros s’est solidifié, retirez le verre supérieur. Faites glisser le toboggan avec le tampon agros est prêt à charger les vers.

Étiquetez la diapositive avec le nom du clone. Ajoutez 10 microlitres d’azoture de sodium de 25 millimolaires dans le tampon aros. Ensuite, à l’aide d’un fil de platine comme précédemment, transférez 30 à 40 animaux dans la solution d’azi de sodium.

Pour les immobiliser, placez une lamelle sur le dessus. Faites-le pour les animaux recombinants et vides L 4 4 4 0 porteurs d’ARNi. Ensuite, placez la lame du micromètre sous le microscope de dissection avec une lentille d’objectif 2,5x.

À l’aide de Q Capture ou d’un logiciel similaire, capturez une image de la règle micrométrique et enregistrez-la. Placez ensuite les vers sous la lunette et capturez des images. Pour mesurer d’abord la longueur du corps, ouvrez l’image de la règle micrométrique dans le logiciel Image Pro.

Cliquez ensuite sur mesurer et choisissez l’étalonnage. Choisissez ensuite l’assistant de calibrage spatial avec l’option Calibrer l’image active sélectionnée. Cliquez sur suivant.

Entrez le nom de l’étalonnage et assurez-vous que les unités de référence spatiale sont définies sur le micron. Cochez ensuite le bouton Créer un étalonnage de référence et cliquez sur Suivant. Cliquez sur dessiner la ligne de référence.

Une barre d’échelle de référence apparaîtra. Repositionnez la barre d’échelle pour qu’elle corresponde aux extrémités du micromètre. Indiquez ensuite que la référence indique 1000 unités.

Cliquez sur OK. Suivant et terminez. Une fois le logiciel calibré, ouvrez une image de ver.

Ensuite, dans le menu de mesure, sélectionnez étalonnage, puis cliquez sur sélectionner spatial. Dans le menu déroulant, sélectionnez le nom de fichier créé pour l’étalonnage du micromètre. Ensuite, dans le menu des mesures, sélectionnez les mesures dans la fenêtre qui s’ouvre.

Sélectionnez l’outil de dessin gratuit et, à l’aide de la souris de l’ordinateur, tracez une ligne au centre du corps de l’animal, de la tête à la queue. La durée sera indiquée dans la fenêtre. Répétez ce processus pour tous les animaux sur le terrain.

Exportez les mesures de longueur dans un fichier Microsoft Excel ou un autre logiciel statistique approprié. Analysez les données en calculant la moyenne et l’écart-type de chaque échantillon. Comparez ensuite les résultats de chaque groupe à l’aide du test T d’un élève.

Le facteur de croissance transformant bêta ou la protéine DBL de la SUPERFAMILLE du facteur de croissance bêta du TGF est nécessaire à l’activation de la voie bêta du TGF. En réponse à l’activation du signal, les transducteurs de signal smad intracellulaires se déplacent vers le noyau et initient la transcription des gènes. Voir l’élégance dans laquelle la voie bêta du TGF est perturbée ont une taille corporelle plus petite, y compris une longueur de corps plus courte que les animaux de type sauvage.

Ainsi, les écrans pour l’élégance de la mer. Les mutants de taille corporelle sont capables d’identifier les composants et les modificateurs de signalisation bêta du TGF pour tester l’efficacité de l’ARNi en se nourrissant pour l’identification des mutants de taille corporelle. L’ARNi a été utilisé pour renverser DBL un composants de la voie, SMA trois à SMA six, en quatre souches différentes d’élégance marine.

Les souches C elegance testées comprenaient deux souches qui sont RN AI hypersensible A un, Lin 15 B et RF trois, ainsi que la souche standard de type sauvage N deux et la souche LIN 36, dont la sensibilité à l’ARNi est similaire à N deux, comme indiqué ici. Lorsque l’expression de la SMA 3 ou 6 a été perturbée, les animaux présentaient une taille corporelle significativement plus courte que les animaux témoins, à l’exception de l’ARNi 6 de la SMA 36. Contexte dans RF trois.

La longueur du corps des jeunes adultes après traitement par ARNi était de 84 à 95 % du vecteur seul. Dans A un Lin 15 B, la longueur du corps des jeunes adultes après ARNi était de 68 à 86 % des animaux témoins. Cependant, la souche A one lin 15 B produit une descendance visible.

Cela les rend inadaptés au criblage à grande échelle. Par conséquent, l’utilisation de la souche RF trois est suggérée pour ces techniques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les gènes qui régulent la croissance et la taille du corps à l’aide de la technique d’interférence RNI.