Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

L’objectif global de l’expérience suivante est de visualiser les récepteurs neuronaux tels qu’ils sont insérés dans la membrane plasmique dans des neurones primaires de souris en culture. Pour ce faire, des GL de souris sont obtenus à partir du cortex cérébral de souris embryonnaires ou néonatales et cultivés sur des inserts de culture enrobés de collagène semi-perméables. Les cultures gliales sont suspendues au-dessus des neurones embryonnaires primaires de l’hippocampe sur des lamelles.

Puis, après sept jours de conditionnement, les neurones sont transfectés avec un récepteur de dopamine D deux marqué au fluor super écliptique. Le récepteur marqué se localise dans les vésicules intracellulaires, mais reste non fluorescent dans l’environnement acide des vésicules. Cependant, lorsque la vésicule fusionne avec la membrane plasmique, le Florin est exposé au pH neutre de l’environnement extracellulaire et émet une fluorescence brillante, ce qui permet une détection par microscopie à fluorescence à réflexion interne totale.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du trafic de protéines membranaires, nous permettant de visualiser le trafic de toutes les protéines membranaires qui peuvent être marquées avec du fluor, telles que les récepteurs du glutamate et les récepteurs couplés au gpro. La démonstration de la procédure avec moi aujourd’hui sera l’élevage à sec et, et nous, deux autres membres de notre groupe de recherche La veille de la procédure de dissection, des flacons T 75 avec une solution de collagène, placez les flacons à la verticale et laissez-les sécher pendant la nuit. Le jour de la culture gliale, réchauffez le milieu glial pendant au moins 30 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius après l’euthanasie, disséquez les cortex cérébraux de souris embryonnaires ou néonatales au microscope de dissection.

Placez les cortex retirés dans un tube conique de 15 millilitres rempli de glace, de froid, de liquide céphalo-rachidien artificiel ou de LCR A. Ensuite, retirez tous les millilitres sauf deux millilitres de LCR A et ajoutez 100 microlitres de solution de pepane et 20 microlitres de 1 % d’ADN. Placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et laissez le tissu digérer pendant 20 minutes.

Après la digestion, lavez soigneusement les tissus cérébraux en retirant soigneusement la solution de propane et en ajoutant 10 millilitres de milieu glial préchauffé. Ensuite, en prenant soin de ne pas perturber les tissus. Retirez autant de milieu glial que possible.

Ajoutez deux millilitres de milieu glial frais et, à l’aide d’un verre poli au feu, passez la pipette à trois vitesses jusqu’à ce que le tissu ne soit plus visible. Évitez de former des bulles une fois que le tissu est complètement dissocié. Ajoutez huit millilitres supplémentaires de milieu glial frais et pipetez la suspension à travers une crépine à cellules de 70 microns.

Recueillir le débit dans un tube conique de 50 millilitres. Transférez les cellules dissociées de deux à trois embryons dans un flacon T 75 enrobé de collagène et cultivez à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire pendant la nuit du lendemain, aspirez le milieu. Rincez les cellules une fois avec 10 millilitres de PBS.

Ajoutez ensuite 10 à 15 millilitres de milieu glial frais dans chaque flacon. Incuber les cultures pendant 10 à 12 jours, en changeant de milieu tous les trois à quatre jours. Une fois confluentes, rincez les cellules gliales avec du PBS.

Ajoutez ensuite cinq millimètres de 0,05 % dans le ballon et laissez les cellules se détacher pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après la courte incubation, ajouter le milieu glial et la pipette pour détacher le GL du fond du flacon. Divisez les cellules en deux nouveaux flacons T 75 enrobés de collagène.

Une fois que ceux-ci atteignent la confluence, les essais, anisent comme précédemment et ensemencent le contenu de chaque fiole dans six plaques de puits contenant des inserts de culture enrobés de collagène. Placé sur deux millilitres de culture de milieu glial, les cellules pendant un à sept jours. Ces inserts de culture gliale seront utilisés pour conditionner les cultures neuronales.

Ajoutez quatre millilitres de milieu de placage dans chaque puits d’une plaque à six puits contenant des lamelles de recouvrement recouvertes de polylysine nettoyée et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Cette étape augmente la probabilité de survie neuronale, très probablement en supprimant la polylysine résiduelle le lendemain. Retirez le milieu de placage et remplacez-le par deux millilitres de placage frais.

Milieu contenant 2 % du milieu. Supplément B 27 pour la culture de neurones de l’hippocampe Sous un microscope à dissection, disséquez l’hippocampe à partir du tissu cérébral de quatre souris embryonnaires E 15 à 18. Placez les hippopotames dans un tube conique de 15 millilitres avec un tampon de dissection glacé.

Ensuite, disséquez le striatum du tissu cérébral de trois souris embryonnaires E 15 à 18 et placez-les dans un tube conique séparé de 15 millilitres avec un tampon de dissection glacé. Digérez le tissu avec du pepane comme précédemment. Puis à l’aide d’un hémocytomètre.

Déterminez le nombre de cellules dans chaque suspension neuronale et graine. Chaque lamelle avec 0,4 fois 10 à la sixième cellule et cultivez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour préparer les inserts de culture gliale pour conditionner les cultures neuronales, aspirez le milieu des inserts de culture gliale et de la plaque, et remplacez-les par deux millilitres de placage frais.

Moyennement le lendemain, placez les lamelles de couverture avec les neurones dans chaque puits de la boîte sous les inserts de culture gliale. Continuez à incuber à 37 degrés Celsius tous les trois à quatre jours. Remplacez la moitié du milieu par une alimentation fraîche préchauffée, contenant du B 27 jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour les expériences de transfection et d’imagerie.

Les neurones seront transfectés au septième jour et imagés au huitième jour de la culture. Une culture neuronale cohérente est la clé du succès des expériences d’imagerie en direct. Cette figure montre des neurones de l’hippocampe de souris cultivés à l’aide de ce protocole de 11 jours in vitro à 18 jours in vitro.

Il est clair d’après les images que les neurones ont développé des processus étendus et que les processus dendritiques sont densément recouverts d’épines dendritiques. Indications que ces neurones sont sains en culture pour chaque culture neuronale. Combiné deux microlitres de lipectomie en 2001 microgramme d’ADN et codant le récepteur de la dopamine D deux marqués avec du Florin super écliptique.

Mélangez et incubez pendant 20 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, retirer et transférer un millilitre de milieu par le dessous et un millilitre de l’intérieur de chaque insert de culture gliale dans le même tube conique. Ajoutez ensuite le même volume de milieu d’alimentation avec du B 27 au milieu économisé et incubez à 37 degrés Celsius.

Ce milieu sera utilisé pour la culture neuronale après la transfection après l’effet de lèvre de 20 minutes pour une incubation momentanée de l’ADN. Retirez les inserts de culture gliale des six plaques de puits. Ajoutez le mélange d’ADN de lipectomie de 200 microlitres dans chaque lamelle avec des neurones.

Évitez de générer des bulles sous la membrane de la culture. Remplacez les inserts de culture gliale et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures. Après l’incubation, retirez à nouveau les inserts gliaux et aspirez la solution de transfection de chaque puits, puis ajoutez les deux millilitres de milieu précédemment conservés dans les neurones et remplacez les inserts de culture gliale.

Enfin, retirez le milieu glial de chaque insert et ajoutez deux millilitres du milieu conservé à chaque culture. Les cellules pendant 24 à 72 heures supplémentaires pour permettre l’expression de la CD NA transfectée. Le système d’imagerie TIRF utilisé dans cette vidéo est une configuration personnalisée avec un laser cyan de 100 milliwatts pour l’excitation et une caméra à dispositif couplé à la charge multiplicatrice d’électrons pour un détecteur 30 minutes avant le début de l’imagerie, un LCR chaud à 37 degrés Celsius dans un bain d’eau. Allumez également le laser, la caméra et l’insert chauffant et placez l’insert chauffant sur la platine du microscope.

Placez une lamelle avec des neurones transfectés dans une chambre d’imagerie en direct et ajoutez rapidement un LCR A préchauffé. Placez la chambre sur l’insert chauffant sur la platine du microscope en mode d’imagerie épi-fluorescente, identifiez les neurones transfectés. Ensuite, en mode d’imagerie TIRF, photoblanchissez les neurones pendant une minute pour éliminer toute fluorescence préexistante sur la membrane plasmique.

Ensuite, réglez le réglage de gain du multiplicateur d’électrons sur la caméra E-M-C-C-D au maximum et commencez à prendre des images pendant une minute à 10 hertz. Chaque enregistrement contiendra 600 images une fois que toute l’imagerie sera terminée. Analysez les données à l’aide de l’Image J pour déterminer l’insertion membranaire du récepteur de la dopamine D deux.

Un neurone épineux moyen de souris a été transfecté avec super écliptique. Florin a marqué la dopamine D, deux récepteurs PDR D, deux TIRF en direct, une imagerie a ensuite été réalisée, au cours de laquelle 600 images ont été prises à raison d’une image toutes les 100 millisecondes. Cette image montre la projection d’intensité maximale de l’enregistrement en accéléré : la pointe de flèche blanche indique où les vésicules individuelles contenant un pH JJ deux ont fusionné avec la membrane plasmique.

Cette image montre la projection d’intensité maximale YT dans laquelle la pile XYT est pivotée de 90 degrés autour de l’axe Y, et le pixel maximum sur chaque ligne de l’axe X est projeté sur un seul pixel de l’axe Y. Pour donner des informations sur la chronologie de l’insertion, ces données démontrent que cette méthode peut être utilisée avec succès pour examiner la régulation de l’insertion de récepteurs dans la membrane plasmique dans les neurones de souris en culture après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du trafic des récepteurs neuronaux pour explorer les régulations d’autres récepteurs, canaux et transporteurs de la membrane plasmique neuronale.