Détection de la palmitoylation des protéines dans les neurones de l'hippocampe en culture par immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (ABE)

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de détecter les protéines neuronales liées aux poids à partir de neurones en culture à l’aide d’un test biochimique simple et adaptable. Ceci est accompli en extrayant et en immobilisant la protéine cible en présence d’éthyle ou de NEM pour assurer le blocage de tous les groupes thiols libres. La deuxième étape consiste à traiter la protéine cible immobilisée avec de l’hydroxyle moyen ou du jambon, afin de cliver la liaison thioester entre le résidu de cystéine palmé et la molécule de palmitate.

Cela libère le groupe de style cystine palmée et le rend disponible pour l’étiquetage dans la troisième étape. La protéine cible immobilisée est incubée avec de la biotine B-M-C-C-A molécule spécifique marquée avec de la biotine, cette biotine exalte et marque, le groupe Thile qui était à l’origine pyl. La dernière étape consiste à détecter le niveau de pation de la protéine cible par page SDS et western blot pour Strp Aden.

En fin de compte, le test IP A BE est utilisé pour montrer les niveaux de palmitate lipidique attaché de manière réversible à une protéine cible neuronale, et peut également détecter des changements subtils dans les protéines cibles. Niveaux de pation. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la détection des protéines, la mutilation de la paume à l’aide du marquage métabolique avec le caractère A palmate est que le test d’échange d’acyle-biotine est plus sensible et prend moins de temps.

Le test A BE permet également d’obtenir des estimations plus quantitatives de la mutilation de la paume de la main et est parfaitement adapté à la détection de petits changements dans les niveaux de mutilation de la paume. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l’identification des protéines palmées et des neurones hippocampiques en culture, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les cultures neuronales primaires d’autres régions du cerveau, les lignées cellulaires hétérologues et même les tissus primaires. Pour commencer l’extraction de la protéine cible à partir de neurones primaires de l’hippocampe en culture, préparez le tampon de lyse et la solution NEM comme décrit dans la procédure écrite accompagnant cette vidéo.

Ensuite, combinez le tampon de lyse et la solution NEM en ajoutant 0,5 millilitre de solution NEM à deux molaires dans un tube conique frais de 50 millilitres. Ajoutez 20 millilitres de tampon de lyse sur le dessus. Ajoutez toujours la solution d’éthanol NEM en premier et le tampon de lyse Deuxièmement, afin de bien mélanger les deux dans une pièce froide à quatre degrés Celsius, placez rapidement le mélange sur une plate-forme à bascule pour mélanger complètement pendant cinq minutes.

Retirez les neurones hippocampiques primaires de rat cultivés de l’incubateur : instructions sur la façon de cultiver. Les neurones peuvent être trouvés dans le texte après avoir placé les neurones cultivés sur de la glace. Retirez délicatement le support cellulaire.

Lavez doucement les neurones deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate froid. Ensuite, ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse et 50 millimolaires NEM au premier puits de neurones de l’hippocampe et grattez les cellules à l’aide d’un élévateur de cellules jetable. Collectez le lysat cellulaire, puis déchargez-le dans le puits suivant de ce groupe.

Grattez les cellules dans le deuxième puits à l’aide de l’élévateur de cellules. Recueillir et répéter à l’aide d’un troisième puits si nécessaire. Pour concentrer davantage le lysat, collectez le lysat cellulaire dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre pré-refroidi

Ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse plus 50 millimolaires de NEM dans le premier puits et répétez le processus de grattage de soudure pour recueillir tout lysat cellulaire restant. Passez le lysat cellulaire total dans une seringue de calibre 26 et demi cinq à six fois pour faciliter la lyse mécanique. Veillez à ne pas faire de bulles dans la solution.

Faites muter le lysat cellulaire pendant au moins 30 minutes à quatre degrés Celsius après la centrifugation. Prélevez le lysat cellulaire éliminé dans un nouveau tube de 1,5 millilitre pré-refroidi sur de la glace. Répétez le protocole de récolte démontré pour tous les groupes de cellules.

Mesurez la concentration en protéines dans tous les échantillons de lysat à l’aide du test BCA. Selon les instructions du fabricant. Normalisez le volume de tous les échantillons de lysat provenant de groupes de cellules pour avoir des protéines exactement égales avec un minimum recommandé de 500 microgrammes.

Complétez tous les échantillons avec un tampon de lyse plus un volume total de 50 millimolaires NEM à 500 microlitres. Ensuite, ajoutez un à cinq microgrammes d’anticorps primaires dirigés contre la protéine cible à chaque échantillon de lysat. Faites muter les échantillons mélangés de lysat d’anticorps pendant une nuit à quatre degrés Celsius avant de précipiter et d’immobiliser une protéine cible.

Préparez une boue à 50 % de vitesses SRO enrobées de protéines A ou G comme décrit dans le protocole écrit. Comme dernière étape, ajoutez un volume égal de 50 % de suspension à chaque échantillon de lysat d’anticorps et mutez pendant au moins une heure à quatre degrés Celsius. Lors de l’exécution de l’ael, le pH et la température appropriés de tous les tampons et réactifs ainsi que leur fraîcheur sont essentiels.

Pour assurer le succès de l’expérience. Commencez le clivage du jambon par la préparation d’un certain nombre de tubes avec un tampon de lyse de différents phs. Le pH est très important pour ces étapes et doit toujours être ajusté.

À l’aide d’un pH-mètre par échantillon, préparer deux millilitres de tampon de lyse pH 7,2 et 0,5 millilitre de tampon rigoureux préparé dans le tampon de lyse. Préparez également 0,5 millilitre de tampon de lyse plus 10 millimolaires NEM par échantillon. AJOUTER des comprimés de PMSF et d’inhibiteur de protéase à tous les tampons de lyse.

Le moyen hydroxyle ou jambon est utilisé pour cliver la liaison thioester entre la cystéine palmée et l’acide gras palmitate. Ceci est essentiel pour libérer le groupe de style cystéine palmée et le rendre disponible pour l’étiquetage avec de la biotine. L’omission du clivage du jambon peut donc servir de contrôle négatif utile.

Préparez des tubes supplémentaires de 1,5 millilitre sur de la glace étiquetés comme témoin de jambon négatif pour chaque échantillon après l’incubation de l’anticorps avec le lysat cellulaire. Ensuite, avec les billes, centrifugez doucement toutes les billes d’échantillon à 0,5 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius avec les tubes sur de la glace. Retirez le surnageant et suspendez les billes dans 600 microlitres de tampon de lyse plus 10 millimolaires NEM.

Une fois que Resus a suspendu toutes les billes d’échantillon, collectez immédiatement 200 microlitres de boue de billes de lysat et déchargez-les dans le tube de jambon négatif de cet échantillon sur de la glace, laissant 400 microlitres de boue de billes de lysat de chaque échantillon dans le tube pour l’échantillon de jambon plus. Il s’agit de tenir compte de la dégradation limitée de la protéine cible causée par le traitement au jambon. Un tiers des perles est utilisé pour le traitement moins jambon et les deux tiers restants sont utilisés pour le traitement plus jambon.

Ajoutez 300 microlitres supplémentaires de tampon de lyse plus 10 millimolaires NEM à l’échantillon de jambon négatif. Pipetez 100 microlitres supplémentaires à l’échantillon de jambon plus pour un total de 500 microlitres dans chaque échantillon. Incuber les tubes pendant 10 minutes sur de la glace, puis procéder au lavage des échantillons de jambon négatif et de jambon positif comme décrit dans la procédure écrite après le lavage de l’échantillon à 0,5 millilitre par échantillon de tampon de lyse pH 7,2 pour tous les échantillons de jambon négatif.

Ajouter 0,5 millilitre par échantillon de tampon de jambon à tous les échantillons de jambon. Faites ensuite muter tous les échantillons pendant une heure à température ambiante. Ne pas dépasser une heure après le traitement au jambon.

Effectuer l’échange de biotine acyle par marquage BMCC de biotine comme indiqué dans la procédure écrite. Une fois l’étiquetage BMCC à la biotine terminé, lavez délicatement les échantillons comme décrit dans le texte. Retirez le surnageant du lavage final, en laissant les billes granulées dans une boue avec le tampon restant au fond du tube.

Trempez une pipette avec une pointe de petit diamètre dans le fond du tube à travers la boue et récupérez rapidement tout tampon restant. Veillez à ne pas prendre de perles. Ajoutez 40 à 50 microlitres de deux tampons d’échantillon plus cinq millimolaires DTT à chaque échantillon.

si besoin est. Vortex les billes pour qu’elles se mélangent complètement au tampon d’échantillon et centrifugez-les immédiatement à grande vitesse pour collecter toutes les billes dans une pastille immergée dans le tampon d’échantillon. Après avoir fait bouillir les échantillons et les avoir centrifugés à nouveau, ajoutez le volume complet de protéines éludées dans le surnageant de chaque échantillon à une seule voie dans un gel de polyacrylamide adapté au western blot.

À l’aide de la page SDS, organisez tous les échantillons de manière à ce que le contrôle moins ham elu et le plus ham elu pour un seul échantillon soient exécutés immédiatement à côté l’un de l’autre. Au cours des pages de FDS les unes après les autres transférées sur la membrane A-P-V-D-F ou NITROCELLULOSE, commencer le western blot avec lavage et blocage comme décrit dans la procédure écrite, préparer une solution d’anticorps de TBST plus 0,3 % BSA, ajouter l’anticorps HRP de streptavidine, qui a été reconstitué à raison d’un milligramme par millilitre dans de l’eau distillée. Lavez la membrane une fois dans du TBST pendant 10 minutes.

Ensuite, incubez la membrane dans une solution d’anticorps STREPTAVIDIN sur une plate-forme à bascule pendant une heure à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez la membrane trois fois au TBST pendant 10 minutes sur une plate-forme basculante. Afin de détecter le signal de pation, exposez la luminescence de la HRP à l’aide d’un kit de substrat chimiluminescent afin de normaliser les niveaux de pation à la quantité de la protéine d’intérêt qui a été immunoprécipitée.

Décaper la membrane à l’aide d’un tampon de décapage Western Blott pendant cinq à 10 minutes sur une plate-forme à bascule à température ambiante. Répéter les étapes de western blot en utilisant l’anticorps primaire contre la protéine d’intérêt qui a été utilisé à l’origine pour l’immunoprécipitation. Quantifier la pation de la protéine d’intérêt à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images et normaliser les niveaux de pation à la quantité de protéine immunoprécipitée.

Le test I-P-A-B-E détecte spécifiquement la cytose des résidus de cystine le long des protéines du substrat et peut être utilisé pour détecter la présence de protéines neuronales immunoprécipitées. Traitement de la protéine neuronale immunoprécipitée avec des clivages de jambon, la liaison thioester entre le palmitate et le groupe Sixtine Thal permettant une incorporation spécifique de la biotine BMCC dans le groupe de fichiers nouvellement disponible, qui peut ensuite être détecté par western blot. L’omission du clivage du jambon empêche l’incorporation de la biotine BMCC et fonctionne comme un contrôle négatif pour l’exaltation spécifique de la biotine de la poïde de l’échantillon de jambon plus.

Par conséquent, le contrôle du jambon négatif doit toujours être exécuté à côté de l’échantillon de jambon positif pour le transfert occidental par la page SDS. Dans une expérience optimisée, le signal de pation de la protéine neuronale delta caténine peut être facilement détecté par transfert pour la biotine BMCC à une concentration d’une micromolaire à l’aide de streptavidine conjuguée à la HRP contre des échantillons de jambon parallèles moins et plus. Le signal de pation spécifique pour delta Kain n’apparaît à sa taille prédite de 160 kilodaltons que dans l’échantillon de main positive.

La spécificité de ce signal a été confirmée par une nouvelle sonde pour la delta CATÉNINE avec l’anticorps spécifique initialement utilisé pour immunoprécipiter, ce qui a entraîné un signal dans les deux traitements de jambon à la même taille prédite. L’optimisation du dosage I-P-A-B-E permettra d’obtenir un profil de transfert western d’un échantillon de jambon négatif qui se distingue facilement de l’échantillon de jambon positif et qui présente un signal de pation minimal ou nul. La concentration de biotine BMCC utilisée pour marquer les CYSTINES PALMÉES nécessite une optimisation minutieuse et si une concentration super saturante de biotine BMCC est utilisée pendant les étapes chimiques A BE, un bruit de fond excessif et des signaux non spécifiques seront visibles.

Les profils de blob avides de l’Ouest parmi les échantillons de jambon négatif et plus pour la delta catine et la mutilation de la paume semblent similaires lorsqu’ils sont traités avec quatre micromolaires de biotine BMCC avec des signaux de fond supplémentaires à différentes tailles, ce qui indique qu’une biotine inappropriée s’est produite. Étant donné que l’hydroxylamine est un puissant agent réducteur qui entraîne une dégradation limitée de la protéine cible, il est nécessaire de normaliser la quantité de protéines immunoprécipitées utilisée pour les échantillons de jambon négatif et supérieur. La normalisation nécessite l’utilisation du double de la quantité de protéine cible immobilisée dans l’échantillon de jambon positif par rapport à l’échantillon de jambon négatif, ce qui entraîne des profils de transfert Western indiscernables pour la protéine cible, comme le montre la caténine delta.

Cependant, si la quantité de protéine cible immobilisée n’est pas normalisée entre les échantillons de jambon moins et plus, le signal de transfert Western résultant pour la protéine cible dans l’échantillon de jambon plus peut être perdu, comme on le voit pour la deltacaténine lorsque des quantités égales de protéines ont été utilisées dans les deux traitements de jambon. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire la protéine neuronale que vous avez choisie à partir de neurones de l’hippocampe en culture. Utiliser une chimie BE pour détecter s’il s’agit d’un substrat pour la mutilation de la paume de la main en un minimum de temps et être capable d’adapter ce protocole pour une utilisation dans d’autres lignées cellulaires et tissus.