Application clinique de

Ce protocole modifie génétiquement les lymphocytes T pour introduire des récepteurs antigéniques chimériques spécifiques des antigènes tumoraux, puis propage un nombre cliniquement significatif sur des cellules présentatrices d’antigènes artificiels de concepteur. Commencer par l’électro transfert de la belle au bois dormant. Transposer et transposer des plasmides d’ADN A dans des cellules mononucléées quiescentes isolées à partir de sang de cordon périphérique ou ombilical.

Mesurez ensuite l’efficacité de la transfection à l’aide de la cytométrie en flux. Lors de la co-culture suivante, les lymphocytes T transfectés ont dérivé pendant sept jours des cellules présentatrices d’antigène artificiel dérivées de K 5 62 avec l’ajout de cytokines exogènes lors d’une stimulation de quatre semaines. Les cycles de prolifération procèdent à l’analyse, à la cryoconservation et à la libération des cellules T positives électroporées et propagées pour l’application humaine.

Le système de transposition sur transposition de la belle au bois dormant offre une alternative aux approches de transfert de gènes basées sur le virus pour introduire de manière stable un gène dans la cellule de son choix. L’un des avantages majeurs du système de la belle au bois dormant est qu’on peut intégrer des gènes à un coût vraiment réduit par rapport aux plasmides d’ADN qui s’intègrent par recombinaison illégitime non homologue. Ainsi, l’avantage est que le système de la belle au bois dormant peut être utilisé pour exprimer un gène à faible coût et à haute efficacité.

En général, les personnes novices dans cette méthode devront d’abord surmonter l’efficacité des électrocellules T dans la propagation sélective des cellules T car positives sur des cellules présentatrices d’antigènes artificielles. Les deux étapes sont difficiles à maîtriser en raison de la nécessité de co-culturer. Lymphocytes T génétiquement modifiés sur des cellules présentatrices d’antigènes artificielles.

Cette méthode est utile dans le domaine de l’immunothérapie adoptive, en particulier dans l’administration efficace de gènes et la fabrication d’un nombre cliniquement significatif de lymphocytes T. L’application plus large s’étend au traitement du cancer, car les lymphocytes T du système immunitaire peuvent être modifiés pour être spécifiques à la tumeur. Margaret Dawson et Matthew Fiola feront la démonstration de la procédure.

Les techniciens de mon laboratoire diluent d’abord le sang périphérique avec un volume égal de P-B-S-E-D-T-A et le sang de cordon ombilical avec quatre volumes de P-B-S-E-D-T-A superpose lentement 25 millilitres de sang dilué sur 12 millilitres de fial dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifuger le gradient de fial à 400 Gs pendant 30 à 40 minutes sans interruption. Transférez maintenant la fraction de cellule mononucléaire dans un tube à centrifuger neuf de 50 millilitres avec P-B-S-E-D-T-A.

Portez le volume à 50 millilitres et récoltez les cellules par centrifugation. Lavez délicatement les cellules une fois dans 50 millilitres de culture complète, milieu et centrifugez à 400 G pendant 10 minutes. Ensuite, regroupez les pastilles de cellules dans CCM pour effectuer un comptage des cellules.

Utilisation de la méthode d’exclusion triam blue. Les cellules mononucléées peuvent maintenant être utilisées pour l’électroporation ou cryoconservées pour une utilisation future. Si vous utilisez des MNC cryoconservés, décongelez rapidement deux fois 10 à la huitième cellule pour une électroporation à grande échelle, transférez doucement les cellules dans un tube à centrifuger de taille appropriée contenant du préchauffage.

Des milieux de culture RPMI complets sans phénol et des granulés les cellules par centrifugation, remettent en suspension les cellules mononucléées Dans P-F-R-P-M-I, effectuez un comptage cellulaire et transférez les cellules dans un récipient de culture cellulaire de taille appropriée à une concentration de 10 des six cellules par millilitre. Équilibrez les cellules dans un incubateur humidifié pendant deux heures. Récoltez la MNC par centrifugation, puis remettez doucement en suspension et combinez les pastilles de cellules dans P-F-R-P-M-I et énumérez les cellules Maintenant, transférez deux fois 10 à la huitième MNC dans un tube à centrifuger stérile de 50 millilitres et centrifugez à 200 Gs pendant 10 minutes sans pause.

Aspirez le surnageant de manière à ce qu’il ne reste aucun milieu résiduel autour de la pastille cellulaire. Préparez une plaque stérile à 12 puits avec 10 puits contenant quatre millilitres de P-F-R-P-M-I chaud et équilibrez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Reconstituez ensuite la solution effectrice Lonzo Nucleo à partir du kit de cellules T humaines selon les instructions du fabricant pour chaque réaction.

Q Vet prépare 100 microlitres de mélange maître d’ADN contenant une solution effectrice nucléaire NU supplémentée. 15 microgrammes de la transposée sur le plasmide et cinq microgrammes du plasmide de transposition. Ensuite, dispersez la pastille de cellules T et remettez en suspension un mélange maître d’ADN de solution d’affection nucléaire NU à une concentration cellulaire finale de deux fois 10e des septièmes cellules par 100 microlitres.

Transférez avec précaution 100 microlitres de suspension cellulaire dans chacune des 10 cuvettes d’affection du nucléo lonza, en prenant soin d’éviter les bulles. Maintenant, appuyez une fois sur le qve et électro à l’aide du programme U 0 1 4 pour les cellules T non stimulées. Transférez les cuvettes et la plaque d’équilibrage à 12 puits dans la hotte de culture à l’aide d’un amox de pipette de transfert à pointe fine à 500 microlitres du milieu de culture préchauffé du puits correspondant à chaque vétérinaire.

Transférez les cellules électroporées sur la plaque et laissez les cellules se rétablir dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux heures. Ensuite, transférez les cellules de tous les puits dans un tube de centrifugation stérile et granulez les cellules après un lavage, dispersez doucement la pastille cellulaire et suspendez-la dans le CCM pour obtenir une suspension de cellule unique. Après avoir effectué un comptage cellulaire, ajustez la concentration cellulaire pour tendre vers les six cellules par millilitre dans la CCM.

Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un flacon de culture et placez-la dans l’incubateur pendant la nuit pour générer des cellules transfectées EGFP. Répétez le protocole d’électroporation en utilisant cinq fois 10 des six cellules par vétérinaire avec cinq microgrammes de plasmide EGFP de contrôle amox. Récoltez les cellules électroporées, puis effectuez un comptage des cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trien.

Ensuite, colorez une à deux fois 10 des six cellules avec un anticorps spécifique pour le CD trois, le CD quatre, le CD huit et l’IgG FC gamma humain comme mesure de l’expression de la voiture. Acquérez les cellules sur le calibre de télécopie. Analysez les données à l’aide du logiciel FCS express pour déterminer l’expression de la voiture.

Calculez ensuite les cellules positives pour la voiture en culture. Le clone A PC numéro quatre dériverait de K 5 62 cellules pour co-exprimer les molécules co-stimulatrices de cellules T souhaitées décongeler une aliquote de congelé irradié, A A PC dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules et le CCM, énumérez les cellules viables par exclusion de trip blue et calculez le nombre de A A PC viables nécessaires à la stimulation.

Mélangez les cellules électroporées exprimant la voiture et l’A A PC irradié aux rayons gamma dans un récipient stérile dans un rapport de un à deux. Ajustez le rapport A PC pour l’expression de car sur la base de la cytométrie en flux le lendemain de l’électroporation Ajoutez 30 nanogrammes par millilitre d’IL 21 à la suspension cellulaire. Ensuite, Eloqua s’est occupé des six cellules par millilitre dans des flacons T 75 ou des sacs de culture de vie et de retour à l’incubateur de culture, de l’électrotransfert de plasmides d’ADN et de la propagation des lymphocytes T irradiés aux rayons gamma.

Un PC peut être utilisé pour générer un nombre cliniquement attrayant de lymphocytes T dérivés du sang périphérique et du sang de cordon ombilical pour des applications humaines. Dans cette caractérisation des lymphocytes T génétiquement modifiés à partir de l’expression du sang périphérique de l’EGFP au jour zéro du premier cycle de stimulation, l’efficacité du transfert de gènes de l’expression de la voiture spécifique du CD 19 est évaluée par cytométrie en flux sur les lymphocytes T CD trois positifs, CD huit positifs et CD quatre positifs environ 24 heures après l’électroporation. Et puis 28 jours après la co-culture sur un PC A, cinétique, de l’expression de la voiture sur des lymphocytes T cultivés dans un système fonctionnellement fermé.

La propagation des lymphocytes T positifs dérivés du sang périphérique au fil du temps peut générer un nombre cliniquement attrayant de lymphocytes T qui expriment la voiture de manière stable. Après quatre semaines de co-culture sur un PC A, l’expansion moyenne du pli des lymphocytes T positifs pour CD trois est d’environ 19 800 avec une expression de 90 %. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’élire la parade et de propager les lymphocytes T qui expriment une voiture souhaitée.

N’oubliez pas de surveiller la prolifération des cellules NK. L’électroporation et la propagation des lymphocytes T sont généralement réalisées sur quatre cycles de stimulation de sept jours. D’autres investigations, telles que la libération de cytokines et les tests de cytotoxicité, peuvent être effectuées pour évaluer la spécificité redirigée des lymphocytes T génétiquement modifiés dans le domaine de l’immunothérapie adoptive.

Cette technique nous aide à comprendre le potentiel thérapeutique des lymphocytes T qui sont infusés chez l’homme.