Name: Application clinique de Belle au Bois Dormant Et artificielle cellules présentatrices dantigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez la modification génétique de cellules T avec le système Sleeping Beauty pour exprimer des récepteurs antigéniques chimiériques CD19. Cette méthode utilise des cellules présentatrices d'antigènes artificielles pour propager des nombres cliniquement significatifs de cellules T CAR-positives destinées à l'immunothérapie anticancéreuse.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Carl Juin (Université de Pennsylvanie) pour la génération et la fourniture de l&#39;aide clone aAPC n ° 4 et le Dr Perry Hackett (Université du Minnesota) à l&#39;aide du système SB. Les subventions: Cancer Center de base Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411), Albert J Ward Fondation Burroughs Wellcome Fund; Gillson Longenbaugh Fondation de prévention du cancer Institut de recherche et du Texas; CLL Global Research Foundation, le ministère de la Défense; succession de Noelan L. Bibler, Harry T. Mangurian, Jr., Fonds pour l&#39;immunothérapie leucémie, l&#39;Institut de la thérapie du cancer personnalisé, Société de leucémie et lymphome; Lymphoma Research Foundation; MDACC Soeur Institution Réseau Fonds; Miller Foundation; M. Herb Simons, M. et Mme Joe H. Scales, M. Thomas Scott, Fondation nationale pour la recherche sur le cancer; Pediatric Cancer Research Foundation; Assistanc productione des thérapies cellulaires (PACT); William-Laurent et de la Fondation pour l&#39;enfance Blanche Hughes.

<html> Jour 0 ou Avant 1. Isolement de cellules mononucléaires (MNC) de PB et UCB <ol><li> PB diluer avec un volume égal, et UCB avec quatre volumes de PBS-EDTA. </li><li> Sang couche lentement dilué (25 ml) sur Ficoll (12 ml) dans un tube à centrifuger de 50 ml (s) et centrifuger à 400 xg pendant 30 - 40 min (sans frein). </li><li> Collecter et transférer la fraction de cellules mononucléaires (interface) en utilisant une pipette de transfert pour un nouveau tube de 50 ml centrifugeuse. </li><li> Montez le volume à 50 ml avec du PBS-EDTA et centrifuger à 450 xg pendant 10 min. </li><li> Aspirer le surnageant, resuspendre doucement la cellule (s) culot dans 50 ml de milieux de culture complet (CCM) et, centrifuger à 400 xg pendant 10 min. </li><li> Doucement remis en suspension et la piscine les culots cellulaires dans CCM et d&#39;effectuer un comptage des cellules en utilisant la méthode d&#39;exclusion au bleu trypan (Cellometer, le programme de PBMC). </li><li> MNC peut maintenant être utilisé pour l&#39;électroporation (nucléofection) ou cryoconservés pour une utilisation future. </li></ol>titre &quot;&gt; 2. Préparation des cellules T pour électroporation le jour 0 <ol><li> Si vous utilisez cryoconservé MNC, décongeler rapidement suffisamment de cellules pour une électroporation pleine échelle (2 x 10 8 en ajoutant environ 20% pour tenir compte de la perte de cellules pendant la centrifugation et une incubation de 2 h) à 37 ° C bain d&#39;eau. Si vous utilisez le fraîchement isolés MNC passez à l&#39;étape 2.3. </li><li> Doucement remis en suspension et le transfert de cellules dans un tube de centrifugation de taille appropriée (s) contenu préchauffé complet sans phénol culture RPMI (PF-RPMI) et centrifuger à 200 xg pendant 10 min (sans frein), le surnageant aspiré. </li><li> Remettre en suspension le RNM dans du milieu RPMI-PF, effectuer une numération cellulaire (Cellometer) et transférer les cellules à un récipient de culture de cellules de taille appropriée (s) à une concentration de 10 6 cellules / ml. </li><li> Incuber dans un 37 humidifié ° C / 5% de CO 2 incubateur pendant 2 h ± 30 min. </li><li> Transférer le MNC à tube à centrifuger stérile (s), tournent à 200 xg pendant 5 min (sans freins), aspirer le surnageant et doucement re-suspendre et combiner la cellule (s) en granulés PF-RPMI. </li><li> Effectuer un comptage des cellules (Cellometer) et calculer le volume de la suspension cellulaire requis (2 x 10 8 MNC). </li><li> Transférer le volume calculé pour un tube stérile de 50 ml centrifugeuse et centrifuger à 200 xg pendant 10 min (sans frein). </li><li> Aspirer le surnageant de sorte qu&#39;aucun média résiduelles demeure et doucement remis en suspension en appuyant sur le côté du tube. </li></ol> 3. Électroporation (nucléofection) du MNC (Processus de pleine échelle utilisant 10 Cuvettes) au jour 0 <ol><li> Préincuber une solution stérile à 12 puits avec plaque de 10 puits contenant 4 ml de RPMI chaud PF-en un 37 humidifié ° C / 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Préparer et préchauffer le Lonza Solution Nucleofector kit de cellules T humaines (reconstitué selon les instructions du fabricant, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) à température ambiante dans une enceinte de sécurité biologique (BSC). </li><li> Préparer la solution Nucleofector / master mix ADN par adding 100 pl de solution Nucleofector complétée, 15 ug de transposon (ADN plasmidique surenroulé désigné comme CD19RCD28/pSBSO) et 5 ug de transposase (ADN plasmidique surenroulé désigné comme pCMV-SB11) par réaction / cuvette. </li><li> Disperse la cellule (de l&#39;étape 2.8) granulés en tapotant doucement le côté du tube de centrifugation et remettre en suspension dans le mélange maître nucléofection solution / ADN (concentration cellulaire finale: 2 x 10 7 cellules/100 ul). </li><li> Transférer avec précaution 100 ml de la suspension cellulaire (de l&#39;étape 3.4) à chacune des dix (10) cuvettes nucléofection Lonza, en prenant soin d&#39;éviter les bulles. </li><li> Appuyez sur la cuvette une fois, et électroporation en utilisant le programme U-014 (pour les cellules T non stimulées). </li><li> Transférez les cuvettes et la plaque de 12 puits (étape 3.1) à la CCB. </li><li> Récolter les cellules électroporées de chaque cuve à l&#39;aide d&#39;une pipette fine Amaxa transfert pointe, en ajoutant ~ 500 pl de milieu de culture préchauffé à partir du puits correspondant (12 puits plaque préparée à Step 3.1) et retourner la plaque pour un 37 humidifié ° C / 5% de CO 2 incubateur pendant 2 h ± 30 min. </li><li> Après la 2-h d&#39;incubation, la récolte et le transfert des cellules dans tous les puits dans un tube à centrifuger stérile. </li><li> Laver les cellules par centrifugation à 140 xg pendant 8 min, température ambiante, sans frein et aspirer et jeter le surnageant qu&#39;aucun fluide résiduel couvre le culot cellulaire. </li><li> Disperser le culot cellulaire en tapotant doucement le côté du tube de centrifugation et doucement remis en suspension dans le CCM pour obtenir une suspension cellulaire unique. </li><li> Effectuer le nombre de cellules et ajuster la concentration cellulaire à 10 6 cellules / ml dans le CCM. </li><li> Transfert suspension cellulaire flacon de culture cellulaire (s) et placer dans un incubateur pendant la nuit. </li><li> Les étapes du processus de 2,1 à 3,8 ont été répétées pour le contrôle: EGFP cellules transfectées (5 x 10 6 cellules / cuvette avec 5 ug Amaxa contrôle EGFP plasmide superenroulé, pmaxGFP). </li></ol> Jour 1 de 1 ère et la suiteCycles de stimulation 4. Analyse de l&#39;expression VOITURE par cytométrie en flux du Jour 1 <ol><li> Récolter les cellules électroporation et d&#39;effectuer un comptage des cellules en utilisant la méthode d&#39;exclusion au bleu trypan (hémocytomètre). </li><li> Cellules Stain (1 à 2 x 10 6) avec un anticorps spécifique pour CD3, CD4, CD8 et IgG humaine Fcy (comme une mesure de l&#39;expression RCA). </li><li> Acquérir des cellules sur FACS Calibur et d&#39;analyser les données à l&#39;aide de FCS express logiciel pour calculer l&#39;expression de la RCA. <ol><li> Calculer cellules + voiture dans la culture par la formule: (Nombre de cellules viables totales) x (CAR% + cellules) = Nombre de cellules CAR + </li></ol></li></ol> 5. Préparation de aAPC (clone n ° 4) au Jour 1. aAPC (clone n ° 4) ont été dérivées de cellules K562 (lignée parentale Obtenu à partir de American Type Culture Collection) Co-express désiré lymphocytes T co-stimulatrice Molecule <ol><li> Décongeler une aliquote de aAPC congelées 100 Gy irradié dans un 37 °, Bain-marie C. </li><li> Les cellules sont lavées deux fois par centrifugation à 400 xg, 10 min dans CCM et comptées à l&#39;aide Cellometer (exclusion du bleu trypan). </li><li> Calculer le nombre de aAPC viable nécessaire pour la stimulation: (N ° de la voiture + cellules) x 2 = Nombre de aAPC irradié nécessaire </li></ol> 6. aAPC médiée par la stimulation des cellules T CAR + du jour 1 au début de la 1 ère et cycles de stimulation ultérieures <ol><li> Mélanger les cellules exprimant l&#39;électroporation (CAR) et γ-irradiés VAMP (clone n ° 4) dans un récipient stérile dans un rapport de 1:2 (CAR + cellule: aAPC viable) dans le CCM. <ol><li> Noter le rapport est ajusté pour aAPC l&#39;expression de voiture basée sur la cytométrie de flux après électroporation. </li></ol></li><li> Ajouter IL-21 (30 ng / ml) à la suspension cellulaire. </li><li> Aliquote de T-75 cm 2 flacon (s) et / ou des sacs Culture Vue vie à une concentration de 10 6 cellules / ml et revenir à la Incubatou. </li></ol> Jours 3, 5 7. Culture continue de CAR + cellules T <ol><li> Effectuer un changement à mi-médias, de reconstituer l&#39;IL-21, et maintenir les cellules T à une concentration de 10 6 cellules / ml. </li></ol> Jour 7 8. Fin de premier cycle de stimulation médiée aAPC <ol><li> Cellules récolte, compter et coloration pour CD3, CD4, CD8 et Fcy (CAR) et passez à l&#39;étape 10.1. </li></ol> 9. L&#39;épuisement des cellules CD56 + (habituellement entre 7 et 14 jours après l&#39;électroporation) <ol><li> Effectuer une déplétion CD56 en utilisant des billes paramagnétiques si CD56 + lymphocytes CD3 neg ≥ 10%. </li></ol> Cycles de stimulation # 2, # 3 et # 4, correspondant à Jours 8 → 14, Jours 15 → 21, 22 → Jours &amp; 28 10. Ajout récursive de aAPC pour propager des cellules T à chiffres cliniquement suffisantes <ol><li> Répétez l&#39;stimulatioProcédé n (4 fois), comme décrit dans les étapes 4.3 à 8.1. </li><li> Ajouter IL-2 (50U/ml) pour les cultures commencent les jours 7, 14 et 21, et puis à chaque changement de support (trois fois par semaine, selon un horaire lundi-mercredi-vendredi). </li><li> Cryoconservation (archive) un excès de cellules T en fonction des besoins. <ol><li> Les cellules T congelé à l&#39;aide congélateur vitesse contrôlée. </li></ol></li></ol> Jour 28 11. Fin du premier cycle de stimulation Dernière aAPC médiation: la récolte des cellules T <ol><li> Cryoconservation de cellules T pour les tests de libération et de la perfusion. </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Transposon et la transposase systèmes, tels que des piggyBac 12,19 et SB 18,20-22, sont non viraux approches de thérapie génique qui sont une alternative à la médiation virale transduction de la RCA de qualité clinique cellules T. Le SB a été choisi comme système de transfert génique basée sur son potentiel pour la thérapie génique humaine 1,6,23. Nous avons développé des technologies duales de transposition SB (à introduire un CAR) et l&#39;addition récursive de γ-irradiés aAPC (pour récupérer les cellules T génétiquement modifiés exprimant de façon stable un RCA) pour servir de plates-formes technologiques dans la fabrication de cellules T ANT spécifiques dans le respect avec cGMP pour la phase I / II des essais (figure 4). Au bout de 28 jours (quatre cycles de stimulation de 7 jours) de co-culture sur γ-irradiés aAPC, nous sommes généralement en mesure de générer au moins ~ 10 10 cellules génétiquement modifiées T conviennent à des applications humaines. Au besoin, les cycles de stimulation supplémentaires peuvent être entrepris to générer un plus grand nombre de lymphocytes T génétiquement modifiés. En outre, si moins CAR + cellules T sont nécessaires, l&#39;approche de l&#39;électroporation et de propagation peut être réduit en utilisant moins de cuvettes et de report juste un sous-ensemble de cellules T développées numériquement pour les rondes subséquentes de la prolifération des aAPC au début de chaque cycle de stimulation. La majorité de la électroporation et propagé les cellules T récoltées pour perfusion exprimer de manière stable la RCA. L&#39;excroissance de cellules CD4 + et CD8 + exprimant notre 2 ème génération CAR comprennent les cellules présentant un phénotype de mémoire / naïve et présentent trois caractéristiques de la re-dirigé spécificité. Tout d&#39;abord, les cellules T génétiquement modifiés spécifiquement lyser des cibles CD19 +, d&#39;autre part, de produire de l&#39;IFN-γ en réponse à CD19 + cellules stimulatrices et, troisièmement, prolifèrent en réponse à CD19 + cellules nourricières, tous d&#39;une manière dépendante de la RCA 13,18. Notre approche de l&#39;intégrmangé un transgène VOITURE par électro-transfert de plasmides d&#39;ADN non viraux du système SB peut être entrepris dans les cellules T quiescentes primaires dérivées de PB et UCB. Nous et d&#39;autres ont modifié génétiquement des cellules K562 pour servir aAPC d&#39;envoyer efficacement les numéros clinique suffisant de cellules T à diluer pour perfusion 24,25. Le aAPC et de l&#39;environnement de culture tissulaire (par exemple, l&#39;addition d&#39;IL-21) ont été ont été modifiés afin de générer le patient et le donneur dérivé CD19 des cellules T spécifiques pour perfusion après de cellules souches hématopoïétiques transplantation (tableau 1) 13,18. Nous pouvons produire CAR + cellules T PB simplement obtenu par ponction veineuse qui évite le coût, l&#39;inconfort et les inconvénients de l&#39;obtention MNC du PB par aphérèse. La capacité à tirer un grand nombre de CAR + cellules T de petits nombres de MNC est particulièrement attrayante pour injecter des cellules T allogéniques après la transplantation UCB. La petite taille et l&#39;anonymat du donneur néonatale empêche re-Accéder à cet individu à un moment plus tard et seulement un nombre limité d&#39;récolté MNC sont disponibles comme matière première pour la fabrication de cellules T pour éviter d&#39;interférer avec l&#39;hématopoïèse. De nouveaux progrès dans le processus de fabrication sont actuellement en cours afin d&#39;inclure un dispositif d&#39;électroporation à haut débit couplé à un bioréacteur WAVE complètement fermée à minimiser la manipulation. Dans l&#39;ensemble, le SB et aAPC font appel à générer des plates-formes CD19 spécifique CAR + cellules T qui peuvent être adaptées pour produire un grand nombre de lymphocytes T génétiquement modifiés qui peuvent reconnaître d&#39;autres cellules de surface TAA en conformité avec les normes cGMP.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Vendeur </td><td> Numéro de catalogue </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> GFP exprimant l&#39;ADN plasmidique (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> APV-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Phénol libre RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone sérum de veau fœtal </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> IL-21 recombinante humaine </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 recombinante humaine (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de cellules T humaines (Solution Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> APV-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 réactif </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC conjugué à la souris mAb spécifique pour CD3 humain </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-souris conjugué à mAb spécifique pour le CD4 humain </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5 conjuguéà la souris mAb spécifique pour CD8 humain </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-conjugué F (ab &#39;) 2 d&#39;anticorps de chèvre Fcy humain spécifique pour </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> À usage unique </td></tr><tr><td> Plaque de 12 puits </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-flacon de 75 cm2 </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Sacs de culture </td><td> Vue vie </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> Tube de 50 ml centrifugeuse </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; Equipement </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Bioscience Nexcelom </td><td> Vision Cellometer </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse Sorvall Legend RT </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Congélateur vitesse contrôlée </td><td> Planer </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiateur </td><td> CIS bio international </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Expression des molécules (endogène et introduite) </td></tr><tr><td> Lignée cellulaire </td> &lt;td noms&gt; commune </td><td> Type de cellule </td><td> Exprimé molécules </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-exprimé avec la membrane liée IL-15 </td></tr></tbody></table> Milieux de culture complets (CCM) (conservés à 4 ° C pendant 30 jours) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 FBS 10% 1% Glutamax Tampon cytométrie en flux (conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 30 jours) PBS FBS 2% Azide de sodium 0,1% </td></tr></tbody></table>

application clinique de<em&gt; belle au bois dormant</em&gt; et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules t du sang de cordon ombilical et périphériques

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

La puissance des cellules T de qualité clinique peut être améliorée en combinant la thérapie génique avec une immunothérapie pour concevoir un produit biologique avec un potentiel de qualité supérieure (i) la reconnaissance des antigènes associés aux tumeurs (TAA), (ii) la persistance après la perfusion, (iii) possibilité de migration vers des sites tumoraux, et (iv) la capacité de recycler les fonctions effectrices dans le microenvironnement de la tumeur. La plupart des approches de la manipulation génétique de cellules T modifiées pour une application humaine ont utilisé des rétrovirus et des lentivirus pour l&#39;expression stable de la RCA 1-3. Cette approche, bien que conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF), peut être coûteuse car elle repose sur la fabrication et la libération de qualité clinique virus recombinant à partir d&#39;un nombre limité de sites de production. Le transfert de plasmides électro-non viraux est une alternative intéressante à la transduction depuis espèces d&#39;ADN peuvent être produites au grade clinique à environ 1/10 ème du coût de recombinant de qualité GMP virus. Pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;intégration, nous avons adapté Sleeping Beauty (SB) transposon et la transposase de l&#39;homme 4-8 application. Notre système SB utilise deux plasmides d&#39;ADN qui se composent d&#39;un transposon codant pour un gène d&#39;intérêt (par exemple génération nd 2 transgène CAR-CD19 spécifique, désigné CD19RCD28) et une transposase (par exemple SB11) qui insère le transgène dans dinucléotide TA répète 9-11 . Pour générer des nombres suffisants de cliniquement génétiquement modifiés cellules T K562 nous utilisons des cellules dérivées présentatrice d&#39;antigène artificielle (VAMP) (clone n ° 4) modifiée pour exprimer un TAA (par exemple CD19), ainsi que des molécules co-stimulatrices des cellules T CD86, CD137L, un membranaire version de l&#39;interleukine (IL) -15 (peptide fusionné à jour IgG4 région Fc) et CD64 (Fc-γ du récepteur 1) pour le chargement des anticorps monoclonaux (AcM) 12. Dans ce rapport, nous démontrons les procédures qui peuvent être mises en compliance avec cGMP pour générer CD19 spécifique CAR + cellules T appropriées pour une application humaine. Ceci a été réalisé par le synchrone électro-transfert de deux plasmides d&#39;ADN, un transposon SB (CD19RCD28) et une transposase SB (SB11), suivie par la récupération des intégrants stables par les ajouts tous les-7-jours (cycle de stimulation) de γ-irradiés aAPC (clone n ° 4), en présence d&#39;IL-2 soluble humaine recombinante et de l&#39;IL-21 13. Typiquement 4 cycles (28 jours de culture en continu) sont entrepris pour générer des nombres cliniquement intéressantes de cellules T qui expriment de manière stable la RCA. Cette méthode de fabrication de qualité clinique CD19 des cellules T spécifiques peuvent être appliquées à des cellules T dérivées du sang périphérique (PB) ou de sang de cordon ombilical (UCB). En outre, cette approche peut être mise à profit pour générer des cellules T à divers types de tumeurs en jumelant la spécificité de la RCA a présenté à l&#39;expression de l&#39;ANT, reconnu par la République centrafricaine, le aAPC.

Nous signalons que l&#39;électro-transfert de plasmides d&#39;ADN et de la propagation des cellules T γ-irradié sur aAPC peut être utilisé pour générer des nombres cliniquement intéressantes de cellules T dérivés de PB et UCB à des applications humaines. Ces cellules génétiquement modifiées T expriment une voiture qui reconnaît introduit le TAA CD19, indépendamment du complexe majeur d&#39;histocompatibilité. Les plasmides d&#39;ADN SB-dérivées pour exprimer le transposon (i), une voiture de 2 ème génération (CD19RCD28) que les signaux à travers CD28 et CD3-ε 14, et (ii) transposase, SB11 15, ont été décrits précédemment 13, 16,17 . Les plasmides utilisés dans cette étude ont été produites commercialement par le Fonds Waisman bioproduction clinique (Madison, WI). Le aAPC (clone n ° 4), dérivée de cellules K562 (lignée parentale obtenu à partir de American Type Culture Collection), co-express désirés cellules T molécules de co-stimulation (chaque molécule introduite à 3 90% sur la surface de la cellule de aAPC),comme décrit précédemment 12. Nous montrons ici que CD19 des cellules T spécifiques pourraient être générés à partir de cellules mononucléaires (MNC) provenant de PB ou SB UCB en utilisant la transposition d&#39;introduire la RCA suivie de l&#39;addition de aAPC à développer numériquement les cellules T d&#39;une manière CAR-dépendante (figures 1 , 4) 13,18. Dix cuves (2x10 7 MNC / cuvette) sont soumis à une électroporation pour chaque destinataire en utilisant 15 ug d&#39;ADN plasmidique (CD19RCD28/pSBSO) codant pour transposon (CAR) et 5 ug d&#39;ADN plasmidique (pCMV-SB11) codant pour la transposase (SB11). Le nombre de cuvettes peuvent être réduits si MNC limitent ou réduites pour les travaux de laboratoire. Le jour de l&#39;électroporation est défini comme «0 jour» du cycle de stimulation N ° 1. En tant que témoins de cytométrie en flux et des conditions de culture, les cellules T autologues sont maquette électroporation (sans ADN plasmidique) et numériquement élargi le γ-irradiés aAPC (clone n ° 4) qui avait été pré-chargé avec OKT3 pour réticuler CD3 pour soutenir des lymphocytes T prolifération. Nous routinely évaluer l&#39;efficacité de l&#39;électrotransfert et la viabilité des cellules T de la journée après électroporation (figure 2B). L&#39;expression de l&#39;EGFP de contrôle de l&#39;ADN plasmidique (désigné pmaxGFP) et de la RCA à cet instant initial reflète l&#39;expression des protéines à partir du plasmide intégré et épisomique. En règle générale, le jour après l&#39;électroporation, nous mesurons expression de l&#39;EGFP à ~ 60% et l&#39;expression CAR à ~ 40% (figure 2A) avec la viabilité des cellules T entre 40-50%. Additions récursives de γ-irradié aAPC en présence d&#39;IL-2 soluble recombinant humain IL-21 et de récupérer des cellules T exprimant de manière stable CAR (CD19RCD28). CD3 neg CD56 + cellules NK sont dépourvues de la culture en utilisant des billes paramagnétiques CD56 spécifiques si le pourcentage de ces cellules NK est ≥ 10%, en particulier si le pourcentage de la RCA exprimé sur les lymphocytes T est faible. Cet appauvrissement empêche la prolifération rapide des cellules NK qui interfère avec la capacité de aAPC pour soutenir la proliferation de CAR + cellules T. À l&#39;occasion, la déplétion des cellules NK du CAR + cellules T est entrepris au cours des deux derniers cycles de stimulation, mais cela introduit une perte de cellules désirées en raison de co-expression de CD56 sur certains CAR + cellules T. Les cellules T ont été cultivés en système fonctionnellement clos utiliser des sacs Vue de la culture de la vie passée Jour 14. Un sous-ensemble de cellules génétiquement modifiées et propagé T sont généralement cryopréservées au jour 14 ou Jour 21 (fin des cycles de stimulation n ° 2 ou n ° 3) de la co-culture sur aAPC pour servir de source de matériel archivé pour de futures analyses et d&#39;être décongelé si des problèmes imprévus surviennent par la suite au cours du processus de fabrication. Les cellules T sont généralement récolté le ou vers le jour 28 de culture (figure 3) qui ont l&#39;habitude expresse VOITURE&gt; 90% et sont&gt; 80% viable (figure 2C, D). Nous avons précédemment montré que, après quatre semaines de co-culture sur aAPC la moyenne rabattable expansion des cellules T CD3 + 19.800 ± 11.313 est avec CA<html> R + expression étant de 90% ± 7,5 13. Ces cellules T sont cryoconservés et subissent en cours de fabrication et les tests de libération qui informe sur la sécurité et le potentiel thérapeutique du produit fabriqué. Essais de libération est effectuée en conformité avec Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) pour générer un certificat d&#39;analyse avant la perfusion chez des receveurs sur les essais cliniques. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figure 1. Étapes décrivant le processus d&#39;électroporation et de propager CAR + cellules T de PB et UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Caractérisation des lymphocytes T génétiquement modifiés de PB. (A) Expression de l&#39;EGFP au jour 0 du premier cycle de stimulation afin d&#39;évaluer l&#39;efficacité du transfert de gène. L&#39;expression de CD19 spécifique RCA (CD19RCD28) évaluée par cytométrie en flux sur le CD3 +, CD8 + et cellules T CD4 + à (B) environ 24 heures après l&#39;électroporation et (C) 28 jours après co-culture sur aAPC. Expression similaire de la RCA a été observée avec des cellules T UCB dérivés. (D) Cinétique d&#39;expression RCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figure 3. Propagation de PB dérivé VOITURE+ T cellules. Taux d&#39;expansion numérique des CD3 + et CAR + des cellules T dérivées de PB par co-culture répétée sur γ-irradié en présence d&#39;aAPC soluble recombinant humain IL-2 et IL-21. Flèches vers le haut indiquent les ajouts de γ-irradiés aAPC qui marquent le début de chaque cycle de stimulation. UCB dérivé CAR + cellules T présentent des taux similaires d&#39;expansion numérique. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figure 4. Schéma du procédé de fabrication utilisant SB et systèmes VAMP à modifier génétiquement et se propagent CAR + cellules T provenant de PB et UCB. CD19 spécifique CAR + cellules T ont été générées par électro-transfert de SB-dérivés des plasmides d&#39;ADN surenroulés et ultérieures de co-culture le dérivé aAPC K562 (clone n ° 4) dans le o présencef IL-2 recombinante humaine soluble et de l&#39;IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> Source de lymphocytes T </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> Injection de cellules T </td><td width="1"> CISR # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autologue (dérivé du patient) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Après autologue de cellules souches hématopoïétiques transplantation </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Allogénique (donneur-dérivée) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Après allogénique de cellules souches hématopoïétiques transplantation </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Allogénique (donneur-dérivée) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Après la transplantation allogénique de sang ombilical cordon </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tableau 1. Les essais cliniques sous les auspices de la FDA à MDACC d&#39;insuffler CD19 spécifique des cellules T CAR + propagé sur aAPC. Les cellules T sont rendus spécifiques pour CD19 à travers l&#39;expression forcée de SB transposon codant pour une VOITURE 2 ème génération, CD19RCD28 désigné, que les signaux à travers CD28 et CD3-ε. ** De première instance décrit dans la référence 5.

Lymphocytes T exprimant un récepteur CD19 chimérique antigène spécifique (RCA) sont infusés comme traitement expérimental des cellules B malignes dans nos first-in-humains essais de thérapie génique. Nous décrivons la modification génétique des cellules T en utilisant le<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; (SB) Système d&#39;introduire CD19 spécifique CAR et la propagation sélective au designer CD19 + cellules présentant l&#39;antigène artificielles.

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Ce protocole modifie génétiquement les lymphocytes T pour introduire des récepteurs antigéniques chimériques spécifiques des antigènes tumoraux, puis propage un nombre cliniquement significatif sur des cellules présentatrices d’antigènes artificiels de concepteur. Commencer par l’électro transfert de la belle au bois dormant. Transposer et transposer des plasmides d’ADN A dans des cellules mononucléées quiescentes isolées à partir de sang de cordon périphérique ou ombilical.Mesurez ensuite l’efficacité de la transfection à l’aide de la cytométrie en flux. Lors de la co-culture suivante, les lymphocytes T transfectés ont dérivé pendant sept jours des cellules présentatrices d’antigène artificiel dérivées de K 5 62 avec l’ajout de cytokines exogènes lors d’une stimulation de quatre semaines. Les cycles de prolifération procèdent à l’analyse, à la cryoconservation et à la libération des cellules T positives électroporées et propagées pour l’application humaine.Le système de transposition sur transposition de la belle au bois dormant offre une alternative aux approches de transfert de gènes basées sur le virus pour introduire de manière stable un gène dans la cellule de son choix. L’un des avantages majeurs du système de la belle au bois dormant est qu’on peut intégrer des gènes à un coût vraiment réduit par rapport aux plasmides d’ADN qui s’intègrent par recombinaison illégitime non homologue. Ainsi, l’avantage est que le système de la belle au bois dormant peut être utilisé pour exprimer un gène à faible coût et à haute efficacité.En général, les personnes novices dans cette méthode devront d’abord surmonter l’efficacité des électrocellules T dans la propagation sélective des cellules T car positives sur des cellules présentatrices d’antigènes artificielles. Les deux étapes sont difficiles à maîtriser en raison de la nécessité de co-culturer. Lymphocytes T génétiquement modifiés sur des cellules présentatrices d’antigènes artificielles.Cette méthode est utile dans le domaine de l’immunothérapie adoptive, en particulier dans l’administration efficace de gènes et la fabrication d’un nombre cliniquement significatif de lymphocytes T. L’application plus large s’étend au traitement du cancer, car les lymphocytes T du système immunitaire peuvent être modifiés pour être spécifiques à la tumeur. Margaret Dawson et Matthew Fiola feront la démonstration de la procédure.Les techniciens de mon laboratoire diluent d’abord le sang périphérique avec un volume égal de P-B-S-E-D-T-A et le sang de cordon ombilical avec quatre volumes de P-B-S-E-D-T-A superpose lentement 25 millilitres de sang dilué sur 12 millilitres de fial dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifuger le gradient de fial à 400 Gs pendant 30 à 40 minutes sans interruption. Transférez maintenant la fraction de cellule mononucléaire dans un tube à centrifuger neuf de 50 millilitres avec P-B-S-E-D-T-A.Portez le volume à 50 millilitres et récoltez les cellules par centrifugation. Lavez délicatement les cellules une fois dans 50 millilitres de culture complète, milieu et centrifugez à 400 G pendant 10 minutes. Ensuite, regroupez les pastilles de cellules dans CCM pour effectuer un comptage des cellules.Utilisation de la méthode d’exclusion triam blue. Les cellules mononucléées peuvent maintenant être utilisées pour l’électroporation ou cryoconservées pour une utilisation future. Si vous utilisez des MNC cryoconservés, décongelez rapidement deux fois 10 à la huitième cellule pour une électroporation à grande échelle, transférez doucement les cellules dans un tube à centrifuger de taille appropriée contenant du préchauffage.Des milieux de culture RPMI complets sans phénol et des granulés les cellules par centrifugation, remettent en suspension les cellules mononucléées Dans P-F-R-P-M-I, effectuez un comptage cellulaire et transférez les cellules dans un récipient de culture cellulaire de taille appropriée à une concentration de 10 des six cellules par millilitre. Équilibrez les cellules dans un incubateur humidifié pendant deux heures. Récoltez la MNC par centrifugation, puis remettez doucement en suspension et combinez les pastilles de cellules dans P-F-R-P-M-I et énumérez les cellules Maintenant, transférez deux fois 10 à la huitième MNC dans un tube à centrifuger stérile de 50 millilitres et centrifugez à 200 Gs pendant 10 minutes sans pause.Aspirez le surnageant de manière à ce qu’il ne reste aucun milieu résiduel autour de la pastille cellulaire. Préparez une plaque stérile à 12 puits avec 10 puits contenant quatre millilitres de P-F-R-P-M-I chaud et équilibrez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Reconstituez ensuite la solution effectrice Lonzo Nucleo à partir du kit de cellules T humaines selon les instructions du fabricant pour chaque réaction.Q Vet prépare 100 microlitres de mélange maître d’ADN contenant une solution effectrice nucléaire NU supplémentée. 15 microgrammes de la transposée sur le plasmide et cinq microgrammes du plasmide de transposition. Ensuite, dispersez la pastille de cellules T et remettez en suspension un mélange maître d’ADN de solution d’affection nucléaire NU à une concentration cellulaire finale de deux fois 10e des septièmes cellules par 100 microlitres.Transférez avec précaution 100 microlitres de suspension cellulaire dans chacune des 10 cuvettes d’affection du nucléo lonza, en prenant soin d’éviter les bulles. Maintenant, appuyez une fois sur le qve et électro à l’aide du programme U 0 1 4 pour les cellules T non stimulées. Transférez les cuvettes et la plaque d’équilibrage à 12 puits dans la hotte de culture à l’aide d’un amox de pipette de transfert à pointe fine à 500 microlitres du milieu de culture préchauffé du puits correspondant à chaque vétérinaire.Transférez les cellules électroporées sur la plaque et laissez les cellules se rétablir dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux heures. Ensuite, transférez les cellules de tous les puits dans un tube de centrifugation stérile et granulez les cellules après un lavage, dispersez doucement la pastille cellulaire et suspendez-la dans le CCM pour obtenir une suspension de cellule unique. Après avoir effectué un comptage cellulaire, ajustez la concentration cellulaire pour tendre vers les six cellules par millilitre dans la CCM.Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un flacon de culture et placez-la dans l’incubateur pendant la nuit pour générer des cellules transfectées EGFP. Répétez le protocole d’électroporation en utilisant cinq fois 10 des six cellules par vétérinaire avec cinq microgrammes de plasmide EGFP de contrôle amox. Récoltez les cellules électroporées, puis effectuez un comptage des cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trien.Ensuite, colorez une à deux fois 10 des six cellules avec un anticorps spécifique pour le CD trois, le CD quatre, le CD huit et l’IgG FC gamma humain comme mesure de l’expression de la voiture. Acquérez les cellules sur le calibre de télécopie. Analysez les données à l’aide du logiciel FCS express pour déterminer l’expression de la voiture.Calculez ensuite les cellules positives pour la voiture en culture. Le clone A PC numéro quatre dériverait de K 5 62 cellules pour co-exprimer les molécules co-stimulatrices de cellules T souhaitées décongeler une aliquote de congelé irradié, A A PC dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules et le CCM, énumérez les cellules viables par exclusion de trip blue et calculez le nombre de A A PC viables nécessaires à la stimulation.Mélangez les cellules électroporées exprimant la voiture et l’A A PC irradié aux rayons gamma dans un récipient stérile dans un rapport de un à deux. Ajustez le rapport A PC pour l’expression de car sur la base de la cytométrie en flux le lendemain de l’électroporation Ajoutez 30 nanogrammes par millilitre d’IL 21 à la suspension cellulaire. Ensuite, Eloqua s’est occupé des six cellules par millilitre dans des flacons T 75 ou des sacs de culture de vie et de retour à l’incubateur de culture, de l’électrotransfert de plasmides d’ADN et de la propagation des lymphocytes T irradiés aux rayons gamma.Un PC peut être utilisé pour générer un nombre cliniquement attrayant de lymphocytes T dérivés du sang périphérique et du sang de cordon ombilical pour des applications humaines. Dans cette caractérisation des lymphocytes T génétiquement modifiés à partir de l’expression du sang périphérique de l’EGFP au jour zéro du premier cycle de stimulation, l’efficacité du transfert de gènes de l’expression de la voiture spécifique du CD 19 est évaluée par cytométrie en flux sur les lymphocytes T CD trois positifs, CD huit positifs et CD quatre positifs environ 24 heures après l’électroporation. Et puis 28 jours après la co-culture sur un PC A, cinétique, de l’expression de la voiture sur des lymphocytes T cultivés dans un système fonctionnellement fermé.La propagation des lymphocytes T positifs dérivés du sang périphérique au fil du temps peut générer un nombre cliniquement attrayant de lymphocytes T qui expriment la voiture de manière stable. Après quatre semaines de co-culture sur un PC A, l’expansion moyenne du pli des lymphocytes T positifs pour CD trois est d’environ 19 800 avec une expression de 90 %. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’élire la parade et de propager les lymphocytes T qui expriment une voiture souhaitée.N’oubliez pas de surveiller la prolifération des cellules NK. L’électroporation et la propagation des lymphocytes T sont généralement réalisées sur quatre cycles de stimulation de sept jours. D’autres investigations, telles que la libération de cytokines et les tests de cytotoxicité, peuvent être effectuées pour évaluer la spécificité redirigée des lymphocytes T génétiquement modifiés dans le domaine de l’immunothérapie adoptive.Cette technique nous aide à comprendre le potentiel thérapeutique des lymphocytes T qui sont infusés chez l’homme.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Application clinique de Belle au Bois Dormant Et artificielle cellules présentatrices dantigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques (Vidéo) | JoVE Journal

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