Name: Préparation de la tumeur cellules dendritiques matures antigène chargées pour limmunothérapie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Apprenez la préparation de cellules dendritiques matures de qualité clinique chargées d'antigènes pour l'immunothérapie tumorale. Cette méthode utilise GM-CSF, IL-4 et poly ICLC pour différencier les monocytes.

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Les auteurs tiennent à remercier Andres Salazar (Oncovir, Inc.) pour le don de la Poly-ICLC.

1. L&#39;isolement et la cryoconservation des PBMC 4 <ol><li> Aseptiquement pointe l&#39;un des orifices d&#39;accès à la poche de cytaphérèse aide d&#39;un ensemble de transfert de plasma. En utilisant une seringue de 60 ml, transférer la cytaphérèse provenant de patients dans un flacon de 500 ml stérile. </li><li> Réglez le volume de la cytaphérèse 2x son volume initial en utilisant la température ambiante RPMI. Mélanger soigneusement. </li><li> Mélanger délicatement la bouteille de Ficoll-Paque PLUS. Ajouter 12 ml PLUS Ficoll-Paque dans le tube conique stérile de 50 ml. </li><li> Couche doucement 30 ml de produit de leucaphérèse dilué dans chaque tube conique stérile de 50 ml contenant de Ficoll. Veillez à ne pas perturber l&#39;interface entre le Ficoll et la suspension cellulaire. </li><li> Répétez les étapes 1.3 et 1.4 jusqu&#39;à ce que toute la cytaphérèse a été posé. </li><li> Centrifuger les tubes coniques de 50 ml à 1000 g pendant 20 min à température ambiante sans frein. </li><li> Récolter soigneusement la couche nuageuse de CMSP de chaque tube et transfer pour les nouveaux tubes stériles de 50 ml. </li><li> Ajouter dans chaque tube du RPMI pour obtenir un volume final de 50 ml. Mélanger doucement par inversion. </li><li> Centrifuger les cellules à 500 g pendant 10 min à 4 ° C avec plein frein. </li><li> Retirer le surnageant de chaque tube. Remettre en suspension les culots de cellules de chaque tube et ajouter RPMI à un volume final de 50 ml. Mélanger doucement par inversion. </li><li> Centrifuger les cellules à 500 g pendant 6 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant de chaque tube. Remettre en suspension et la piscine ensemble les suspensions de cellules dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Porter le volume des CMSP communs jusqu&#39;à 50 ml avec plus RPMI. Mélanger doucement par inversion. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 6 min à 4 ° C. </li><li> Eliminer le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 50 ml de RPMI. Mélanger doucement afin d&#39;assurer suspension cellulaire uniforme. </li><li> Compter le nombre de cellules et de déterminer la viabilité cellulaire. Calculer le nombre total de cellules viables. </li><li> Centrifuger les cellules à 300G pendant 6 min à 4 ° C. Préparer les milieux de congélation. Milieux de congélation se compose de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO; Miltenyi Biotec) dans le sérum humain AB (Vallée biomédicale). </li><li> Eliminer le surnageant. Remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 2 x 10 8 cellules / ml dans un milieu froid glacial. </li><li> Faire aliquotes de 1 ml dans 1,8 ml cryovials. </li><li> Transférer les tubes cryogéniques dans le congélateur à vitesse contrôlée et commencer la course congélation, programme 1. A la fin de la course, transférer les cryotubes congelés immédiatement dans la phase de vapeur de la congélation à l&#39;azote liquide. </li></ol> 2. Jour 0: La différenciation des cellules dendritiques à partir de monocytes <ol><li> Ajouter 30 ml de RPMI / 1% de plasma autologue dans un tube conique ml stérile 50. </li><li> aliquotes de dégel CMSP gelés par une légère agitation dans le 37 ° C au bain d&#39;eau. Quand il est complètement dégelé, transférer le contenu des flacons au tube conique stérile de 50 ml. Mélanger soigneusement. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 6 minà 500 × g à la température ambiante. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans un petit volume de RPMI / 1% de plasma autologue. Ensuite, ajouter de RPMI / 1% de plasma autologue à un volume final de 50 ml. Mélanger soigneusement. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 6 min à 500 g à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 50 ml de RPMI / 1% de plasma autologue. Mélanger soigneusement. </li><li> Compter le nombre de cellules et de déterminer la viabilité cellulaire. Calculer le nombre total de cellules viables. </li><li> Plaque 1,40 x 10 8 cellules dans 40 ml de RPMI / 1% de plasma autologue sur 225 cm 2 EasyFlask. Répétez jusqu&#39;à ce que toutes les cellules ont été étalées. </li><li> Incuber les EasyFlasks plat sur ​​le côté pour 1 - 2 heures à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO 2 pour permettre les monocytes adhèrent au ballon. </li><li> Lorsque l&#39;incubation est terminée, retirez le EasyFlask de l&#39;incubateur et laver deux fois pour éliminer les cellules non-adhérentes using 30 ml de RPMI préchauffé. </li><li> Après le second lavage, ajouter 40 ml de RPMI / 1% de plasma autologue avec 400-1000 UI / ml d&#39;IL-4 et 100-1000 UI / ml de GM-CSF 5-8. Pour ce protocole, nous utilisons 400 UI / ml d&#39;IL-4 et 100 UI / ml de GM-CSF. </li><li> Incuber les EasyFlasks pendant 2 jours à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO 2. </li></ol> 3. Jour 2: Nourrir des cellules dendritiques avec IL-4 et GM-CSF <ol><li> Ajouter 4 ml de RPMI / 1% de plasma autologue avec 400-1000 UI / ml d&#39;IL-4 et 100-1000 UI / ml de GM-CSF à chaque EasyFlask. Mélanger en agitant et en faisant tourner sur le côté. </li><li> Incuber les EasyFlasks pour 3 jours (jusqu&#39;au 5ème jour) à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO 2. </li></ol> 4. Jour 5: La récolte des cellules dendritiques immatures <ol><li> Récolter les cultures en agitant vigoureusement les flacons et par pipetage de haut en bas pour remettre en suspension les cellules non adhérentes et peu adhérente. Transférer lecellules récoltées à de nouveaux tubes 50 ml fond conique. </li><li> Centrifuger les tubes à 500 g pendant 6 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 50 ml de RPMI / 1% de plasma autologue. Mélanger soigneusement. </li><li> Compter le nombre de cellules et de déterminer la viabilité cellulaire. Calculer le nombre total de cellules viables. </li><li> Centrifuger les tubes à 500 g pendant 6 min à température ambiante. Plate 1-2 x 10 6 cellules par puits dans 3 ml de RPMI / 1% de plasma autologue avec 400 UI / ml d&#39;IL-4 et 100 UI / ml de GM-CSF dans des plaques de culture tissulaire à 6 puits. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO 2 pendant la nuit. </li></ol> 5. Jour 6: Maturation et Antigen Chargement des cellules dendritiques <ol><li> Ajouter 10 pg / ml KLH à 1/3 des puits dans des plaques de culture à 6 puits. Swirl les plaques pour bien mélanger. KLH est seulement ajouté à 1/3 du puits, car KLH est utilisé uniquement pour le premier vaccin de courant continu. Après DC vaccins conmaintenir seulement les peptides antigéniques tumoraux. </li><li> PED peut être stimulée à mûrir en utilisant différents stimuli. Les stimuli de maturation plus courants qui ont été utilisés dans les études cliniques a été un cocktail de cytokines (IL-1 β, TNF et IL-6) et de prostaglandine E2 (PGE2) 9,10. Plus récemment, l&#39;utilisation d&#39;agonistes des récepteurs Toll-like (TLR) ont gagné en popularité 11,12. Dans ce protocole, ajouter 2 mg / ml POLYINOSINIQUE-polycytidylique Carboxymethylcellulose acide poly-L-lysine (Poly-ICLC) dans les puits et bien mélanger. Poly-ICLC est la formulation de qualité clinique du Poly-IC qui est stabilisé avec de la poly-L-lysine-* et de la carboxyméthylcellulose (fabriqué par Oncovir, Inc.). </li><li> Ajouter 100 g / antigènes peptidiques longs ml (NY-ESO-1 et / ou Melan-A/MART-1) à leurs puits désignés, chaque puits recevant une seule peptide d&#39;éviter compétition croisée 13. </li><li> Incuber les boîtes à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture tissulaire contenant 5% de CO &lt;sub&gt; 2 O / N. </li></ol> 6. Jour 7: La cryoconservation des cellules dendritiques <ol><li> Préparer la solution de congélation DC en utilisant du plasma autologue et 10% de DMSO. Centrifuger la solution de congélation DC à 2.000 g pendant 20 min à 4 ° C pour éliminer toute matière particulaire. Transférer le surnageant dans un nouveau tube avec étiquette conique de 15 ml. Conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Lorsque la nuit d&#39;incubation est terminée, la récolte et la piscine tous les puits contenant les PED puisées avec les peptides en tubes coniques de 50 ml. </li><li> Centrifuger les tubes à 500 g pendant 6 min. Retirer le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 5 ml de RPMI / 1% de plasma autologue. Porter le volume total à 50 ml avec du RPMI / 1% de plasma autologue. Mélanger soigneusement. </li><li> Compter le nombre de cellules et de déterminer la viabilité cellulaire. Calculer le nombre total de cellules viables. </li><li> Centrifuger les tubes à 500 g pendant 6 min à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 5 ml Sterile NaCl à 0,9%, USP et le transfert de nouvelles 15 ml tubes coniques. Apportez chaque suspension cellulaire à 14 ml de NaCl plus stérile à 0,9%, USP. Cap et mélanger par inversion. </li><li> Répétez l&#39;étape précédente deux fois. Après la dernière centrifugation, éliminer le surnageant, se rapprochant le plus possible de les culots cellulaires sans perturber les pastilles. </li><li> Remettre en suspension les culots cellulaires dans la solution de congélation DC à 4 - 20 x 10 6 cellules / ml et aliquote de 1 ml dans chaque flacon de CryoTube 1,8 ml. </li><li> Utilisez le congélateur à vitesse contrôlée, programme 1, de geler le bas les portions de vaccins DC et transférer immédiatement dans la phase vapeur d&#39;un congélateur à azote liquide pour le stockage à long terme. </li></ol> 7. Lot essais de libération <ol><li> Chaque lot de vaccin DC doit être évalué et répondent à des critères de libération des lots spécifiques (tableau 1) avant qu&#39;il soit libéré pour injection à des patients dans l&#39;étude, typiquement 5 à 6 semaines après la préparation du vaccin. </li><li> Viabilité:Évaluer la viabilité du vaccin DC en utilisant un compteur de cellules automatisé. Les spécifications minimales de viabilité acceptable est&gt; 70%. </li><li> Identité: Évaluer l&#39;identité du CD matures (CD11c + CD14-CD83 +) par cytométrie de flux. Le pourcentage de cellules + CD11c doit être&gt; 50%. Le pourcentage de CD11c + et CD14 + des cellules doit être &lt;30% et le pourcentage de CD11c +, CD14-, CD83 + et les cellules doivent être&gt; 50%. </li><li> La stérilité: Test du vaccin à courant continu pour la présence de bactéries et de champignons anaérobies et aérobies par culture directe et les taches de Gram. Évaluer la présence de mycoplasmes en utilisant un système de culture directe et ADN fluorochrome essai de coloration avec indicateur lignée cellulaire. Pour ces tests, l&#39;ensemble des spécifications minimum est qu&#39;aucune croissance est observée à partir de toutes les cultures. </li><li> Endotoxine: Évaluer la quantité d&#39;endotoxine en utilisant l&#39;énergie cinétique test LAL chromogénique cinétique QCL et il doit être &lt;50 EU / ml pour répondre aux critères minimaux. </li><li&gt; Fonction: évaluer la fonction continu dans une réaction lymphocytaire mixte par incubation avec des cellules T allogéniques. La présence de prolifération par rapport aux PED non stimulées est signalé (Figure 3). </li></ol>

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Les auteurs ont reçu un soutien financier de ce qui suit: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 et AI084578 K08 (Miller)), la Fondation Bill et Melinda Gates, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, l&#39;Alliance pour Lupus Research, et le Emerald Fondation. Nina Bhardwaj est un co-inventeur de brevets relatives à l&#39;élaboration et à l&#39;utilisation des cellules dendritiques pour manipuler l&#39;immunité. Les auteurs n&#39;ont pas d&#39;autres affiliations pertinentes ou la participation financière de toute organisation ou entité ayant un intérêt financier ou conflit financier avec l&#39;objet ou de matériaux discuté dans le manuscrit en dehors de ceux décrits.

Phase I et II des essais cliniques de DC dérivées de monocytes ont montré qu&#39;ils induisent des réponses immunitaires chez les patients mais le succès clinique a été limitée 1. Cela peut être dû en partie à l&#39;absence de consensus sur la façon de générer les PED optimale pour une utilisation immunothérapie des tumeurs. Bien qu&#39;il existe de nombreuses façons de générer des contrôleurs de qualité clinique, ces méthodes varient en fonction de l&#39;utilisation de cytokines utilisées pour différencier l...

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 milieu avec L-glutamine</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES sérum physiologique tamponné</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate salin tamponné (PBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Albumine humaine, solution à 25 % USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Sérum AB humain</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline stérile USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Leukine GM-CSF, 0,5 mg/ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 cm² EasyFlasks</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Plaques de culture tissulaire à 6 puits</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1,8 ml CryoTube flacons</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur à débit contrôlé</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de la tumeur cellules dendritiques matures antigène chargées pour l&#39;immunothérapie

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Bien que des études cliniques ont établi que les vaccins DC antigène chargées sont sûrs et thérapie prometteuse pour les tumeurs 1, leur efficacité clinique reste à établir. La méthode décrite ci-dessous, préparé conformément aux bonnes processus de fabrication (BPF) des lignes directrices, est une optimisation de la méthode de préparation ex vivo la plus courante pour générer un grand nombre de pays en développement pour les essais cliniques 2. Notre méthode utilise le TLR synthétique 3 agoniste POLYINOSINIQUE-polycytidylique Carboxymethylcellulose acide poly-L-lysine (Poly-ICLC) afin de stimuler les PED. Notre précédente étude a établi que Poly-ICLC est le stimulus de maturation individuelle la plus puissante pour les PED humains telle qu&#39;elle est évaluée par une régulation positive de CD83 et CD86, l&#39;induction de l&#39;interleukine-12 (IL-12), le facteur de nécrose tumorale (TNF), l&#39;interféron gamma induite Protéines 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), et interférons de type I (IFN) et l&#39;interleukine minimal 10 (IL-10) de production. </p&gt; PED sont différenciées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP surgelés) obtenues par cytaphérèse. PBMC sont isolées par gradient de Ficoll centrifugation et congelées en portions. Le Jour 1, CMSP sont décongelés et étalées sur des flacons de culture de tissus à choisir pour les monocytes qui adhèrent à la surface du plastique après 1-2 heures d&#39;incubation à 37 ° C dans l&#39;incubateur de culture tissulaire. Après incubation, les lymphocytes sont lavés et les monocytes adhérents sont cultivées pendant 5 jours en présence d&#39;interleukine 4 (IL-4) et granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) se différencier pour les CD immatures. Au jour 6, DC immatures sont puisées avec la patelle protéines trou de serrure (KLH), qui sert de contrôle pour la qualité du vaccin et peut stimuler l&#39;immunogénicité du vaccin 3. Les pays en développement sont encouragés à mûrir, chargées avec des antigènes peptidiques, et incubées pendant la nuit. Au jour 7, les cellules sont lavées, et congelés dans aliquotes de 1 ml contenant4 - 20 x 10 6 cellules en utilisant un congélateur à vitesse contrôlée. essai de libération du lot pour les lots des PED est effectuée et doit respecter les spécifications minimales avant d&#39;être injectés dans patients.

Entre 10 - 20% des CMSP départ se différencient en DC à la fin de la période de culture. CD matures sont CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, et CCR7 + (Figure 1). Ils expriment des niveaux élevés de molécules CMH de classe II et I et les molécules de co-stimulation CD80 et CD86. Poly-ICLC a également induit des niveaux inférieurs de PDL-1 par rapport à d&#39;autres agonistes TLR 14. En outre, ces Poly-IC-mûri PED sécrètent de grandes quantités d&#39;IL-12 (Figure 2 et 15,16)...

La méthode la plus couramment utilisée pour générer un grand nombre de cellules dendritiques autologues (CD) pour l&#39;utilisation dans l&#39;immunothérapie tumorale est décrite. La méthode utilise IL-4 et GM-CSF pour différencier les PED à partir de monocytes. Les DC immatures sont stimulées à maturité, puis chargé avec des antigènes avant qu&#39;ils ne soient réinjectées au patient.

Préparation de la tumeur cellules dendritiques matures antigène chargées pour l&#39;immunothérapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer la préparation de cellules dendritiques de qualité clinique pour l'immunothérapie. Cela est réalisé en congelant d'abord des cellules mononucléées du sang périphérique isolées par leucaphérèse. Dans la deuxième étape, les aliquots congelés de pbmc sont décongelés et les monocytes sont différenciés en cellules dendritiques en présence de G-M-C-S-F et d'IL-4 pendant cinq jours.Ensuite, les cellules dendritiques sont récoltées, stimulées avec des peptides et maturées toute la nuit avec l'agoniste du TLR3 poly ICLC. Lors de l'étape finale, les cellules dendritiques matures sont récoltées et congelées en aliquots. Ces aliquots congelés de cellules dendritiques matures peuvent être décongelés, transférés dans des seringues et réinjectés aux patients dans le cadre de leur immunothérapie.La procédure sera démontrée par Merited Sedia et Farra Hassan, deux techniciennes de recherche de mon laboratoire. À l’aide d’un ensemble de transfert de plasma, commencez par piquer aseptiquement l’un des ports d’accès du sac de leucaphérèse. Ensuite, utilisez une seringue de 60 millilitres pour transférer la leucaphérèse dans une bouteille stérile de 500 millilitres. Puis, à l’aide de RPMI à température ambiante, ajustez le volume de la leucaphérèse à deux fois son volume initial et mélangez soigneusement. Après avoir doucement mélangé un flacon de Ficoll, ajoutez 12 millilitres de cette solution dans des tubes coniques stériles de 50 millilitres, puis superposez délicatement 30 millilitres du produit de leucaphérèse dilué dans chaque tube contenant le Ficoll.Veillez à ne pas perturber l'interface entre l'appel FI et la suspension cellulaire. Faites centrifuger les tubes pendant 20 minutes à 1000 ×g et à température ambiante sans frein. Ensuite, récupérez soigneusement la couche trouble de pbmc de chaque tube et transférez-la dans de nouveaux tubes stériles de 50 millilitres.Ensuite, ajoutez du RPMI à chaque tube jusqu'à un volume final de 50 millilitres, puis mélangez délicatement les suspensions cellulaires par retournement. Après avoir centrifugé les cellules pendant 10 minutes à 500 G et à 4 degrés Celsius, retirez les surnageants de chaque tube et resuspendez les culots cellulaires de chaque tube dans du RPMI jusqu'à un volume final de 50 millilitres. Après avoir mélangé délicatement les tubes par retournement, déterminez le nombre et la viabilité des cellules.Ensuite, centrifuger les cellules et resuspendre le culot dans un milieu de congélation fraîchement préparé à une concentration finale de deux fois 10 à la puissance huit cellules par millilitre. Transférer un millilitre d'Eloqua de la solution cellulaire dans des fioles cryogéniques de 1,8 millilitre. Puis transférer les fioles cryogéniques dans un congélateur à débit contrôlé et démarrer le programme de congélation. À la fin du programme, transférer immédiatement les fioles cryogéniques congelées dans la phase vapeur d'un congélateur à azote liquide.Le lendemain, décongelez les aliquotes de pBMC congelées dans un bain à 37 degrés Celsius par agitation douce. Une fois complètement décongelées, transférez le contenu des flacons dans des tubes coniques stériles de 50 millilitres contenant 30 millilitres de RPMI et de plasma autologue, puis centrifugez. Resuspendez soigneusement le culot cellulaire dans un petit volume de RPMI additionné de plasma autologue.Ensuite, ajouter davantage de RPMI ainsi que du plasma autologue pour obtenir un volume final de 50 millilitres. Après avoir bien mélangé les suspensions, déposer 1,4 fois 10 à la puissance 8 cellules dans 40 millilitres de RPMI additionné de plasma autologue dans un flacon Easy de 225 centimètres carrés. Incuber le flacon Easy à plat sur le côté pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture tissulaire contenant 5 % de dioxyde de carbone, afin de permettre l’adhérence des monocytes au flacon. Une fois l’incubation terminée, rincer le flacon Easy deux fois avec 30 millilitres de RPMI préchauffé pour éliminer les cellules non adhérentes.Après le deuxième lavage, ajoutez 40 millilitres de RPMI supplémenté de plasma autologue avec IL-4 et G-M-CSF aux cellules, puis incubez le flacon EASI pendant deux jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Cinq jours plus tard, agitez vigoureusement les flacons et pipetez plusieurs fois de haut en bas pour resuspendre. Transférez les cellules non adhérentes et faiblement adhérentes vers de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres.Après centrifugation des cellules, on suspend les culots cellulaires dans 50 millilitres de RPMI supplémenté de plasma autologue. Après homogénéisation et lavage des cellules, on plante à nouveau une à deux fois 10 puissance six cellules par puits dans trois millilitres de RPMI contenant du plasma autologue, de l'IL-4 et du G-M-CSF, dans des plaques de culture tissulaire à six puits. Incuber ensuite les plaques à 37 °C dans une étuve à culture tissulaire contenant 5 % de dioxyde de carbone, pendant toute la nuit. Le jour suivant, ajouter 10 microgrammes par millilitre de KLH à un tiers des puits des plaques de culture à six puits, puis homogénéiser les plaques par agitation circulaire.Ensuite, ajouter deux microgrammes par millilitre de poly ICLC dans les puits et mélanger soigneusement. Puis, ajouter 100 microgrammes par millilitre d'antigènes peptidiques longs dans les puits désignés, chaque puit recevant un seul peptide afin d'éviter toute compétition croisée. Incuber ensuite les plaques toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire contenant 5 % de dioxyde de carbone, puis au jour sept, récolter et regrouper tous les puits contenant les cellules dendritiques.Incuber avec les peptides au jour six dans de nouveaux tubes coniques de 50 millilitres. Après avoir centrifugé les cellules, resuspendre les culots cellulaires aspirés dans cinq millilitres de RPMI additionné de plasma autologue, puis compléter le volume total à 50 millilitres avec du RPMI additionné de plasma autologue, et mélanger soigneusement les suspensions cellulaires. Après avoir calculé le nombre total de cellules viables, centrifuger les tubes, resuspendre chaque culot dans cinq millilitres de chlorure de sodium stérile, puis laver chaque suspension cellulaire deux fois supplémentaires dans 14 millilitres de chlorure de sodium stérile.Après chaque lavage, mélanger les tubes après le deuxième lavage. Resuspendre les culots cellulaires dans une solution de congélation pour cellules dendritiques à une concentration de quatre à vingt fois dix puissance six cellules par millilitre et aliquoter un millilitre de chaque suspension cellulaire dans des tubes cryogéniques de 1,8 millilitre. Enfin, à l’aide d’un congélateur à débit contrôlé, congeler les aliquots de vaccins cellulaires dendritiques, puis transférer immédiatement les aliquots dans la phase vapeur d’un congélateur à azote liquide pour une conservation à long terme.Entre 10 à 20 % des pBMC initiales se différencient en cellules dendritiques à la fin de la période de culture. La maturation des cellules dendritiques en réponse au poly ICLC, représentée par les lignes en gras, a été évaluée en fonction de l'expression de CD83, CD40 et CCR7, puis comparée à celle des cellules dendritiques non stimulées, représentées par les teintes grises. Comme le montrent ces histogrammes, les cellules dendritiques matures induites par le poly ICLC, différenciées à partir de trois donneurs sains dans cette expérience, sécrètent de grandes quantités d'IL-6, d'IL-8, d'IL-12 et de TNF-alpha. Ces cellules matures au poly ICLC induisent également une prolifération des lymphocytes T allogéniques, comme en témoigne l'expression de CFSE, ainsi que la production d'interféron gamma après leur développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie pour explorer l'utilisation des cellules dendritiques en immunothérapie contre le cancer et les maladies infectieuses.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Préparation de la tumeur cellules dendritiques matures antigène chargées pour l'immunothérapie

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