Un modèle de souris orthotopique de cancer de la thyroïde anaplasique

L’objectif global de cette procédure est de démontrer le placement chirurgical de cellules anaplasiques humaines, d’un carcinome thyroïdien ou d’une cellule TC dans la thyroïde afin d’établir un modèle murin de xénogreffe orthotopique. Ceci est accompli en cultivant et en récoltant d’abord des cellules TC. Après avoir préparé la souris à la chirurgie, exposez la thyroïde par deux incisions longitudinales successives dans le cou et injectez lentement les cellules A TC dans la glande thyroïde droite.

La dernière étape consiste à fermer les incisions avec des sutures et à permettre à la souris de récupérer. En fin de compte, l’examen histologique d’échantillons de tissus réséqués est utilisé pour montrer la croissance et l’invasion tumorales dans diverses conditions. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la xénogreffe sous-cutanée est que la transplantation orthotopique place une cellule TC dans sa niche biologique et reproduit étroitement la progression de la maladie et la pathologie telles qu’elles se produisent chez l’homme.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés telles que la détermination des mécanismes biologiques de l’agressivité du cancer de la thyroïde. Commencez cette procédure en cultivant la lignée cellulaire humaine A TC TJ 11 T dans six plaques de culture Well en utilisant un milieu complet supplémenté en RPMI 1640 un jour avant la récolte des cellules, lorsque les cellules sont à 70 à 80 % de décongélation confluente, 0,01 millilitre de gel majeur à quatre degrés Celsius. Récoltez les cellules à l’aide de la trypsine une fois qu’elles sont devenues confluentes à 80 à 90 % une fois que les cellules ont été granulées, aspirez le milieu et remettez les cellules en suspension dans deux millilitres de milieu RPMI 1640 complété pour chaque plaque de six puits récoltée.

Ensuite, déterminez la densité cellulaire en mélangeant la suspension cellulaire une à une avec 0,4 % de colorant bleu Triam, déterminez la densité cellulaire à l’aide d’un compteur de cellules automatisé TC 10. Calculez le volume de suspension cellulaire nécessaire pour injecter 500 000 cellules par souris. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de cellules disponibles pour l’implantation en calculant le double du nombre d’implants prévus.

Transférez le volume requis de suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugeuse suivante à 200 Gs pendant quatre minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez le milieu et remettez en suspension les cellules à 100 millions de cellules par millilitre dans un milieu complet complété par RPMI 1640.

Ensuite, transférez les cellules dans un tube de 1,6 millilitre. Ajoutez un volume de matri gel et mélangez doucement en pipetant lentement vers l’intérieur et vers l’extérieur. Placez la suspension cellulaire sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire.

Tout d’abord, stérilisez la zone chirurgicale, qui comprend la lunette de dissection et la zone environnante, en essuyant toutes les surfaces avec de l’éthanol à 70 %. Préparez ensuite la zone de récupération en allumant les lampes chauffantes et en déposant des tampons stériles. Anesthésiez la souris et préparez-la à la chirurgie en rasant d’abord la région du cou de la souris de la mâchoire au haut du sternum et à chaque bras.

Ensuite, bousiller la zone chirurgicale trois fois en alternant des carrés de gau imbibés de chlorhexidine et d’éthanol. Puis une dernière fois avec de la gaze imbibée de bétadine. Appliquez également doucement une pommade pour les yeux pour éviter que les yeux ne se dessèchent.

À ce stade, vérifiez le réflexe de la pédale pour vous assurer que la souris est correctement sédative. Placez ensuite le gisant dorsal de la souris sur une barrière de champ stérile jetable. Sous la lunette de dissection, fixez la souris en place avec du ruban adhésif.

Ensuite, frottez soigneusement les mains et les ongles et mettez des gants chirurgicaux stériles de manière stérile, ouvrez l’emballage chirurgical et rangez les instruments. Enfin, placez un champ stérile sur la souris, en ne laissant que le site chirurgical exposé. Commencez par faire une incision longitudinale d’un à 1,5 centimètre le long de la ligne médiane de la gorge à l’aide d’un scalpel stérile jetable.

Ne vous écartez pas de la ligne médiane, car cela augmenterait le risque d’entailler ou de sectionner de grosses artères. Faites une deuxième incision dans les muscles de la sangle entourant la trachée. Tirez ensuite le côté droit du muscle incisé sur le côté, exposant la glande thyroïde droite.

Demandez à un assistant de remettre la seringue. Injectez-le lentement dans la glande thyroïde droite à l’aide d’une seringue à insuline de calibre 31. Ensuite, retirez délicatement la suture à l’aiguille et assemblez la couche musculaire avec un matériau de suture monofilament de nylon à six oh en utilisant un style de suture interrompu.

Enfin, cousez la peau de la même manière en postopératoire. Appliquez une couche de pommade antibiotique triple directement sur le site d’incision. Laissez la souris récupérer dorsale couchée sous une lampe.

Une fois que la souris peut atteindre la position couchée sternale sans aide, elle peut être replacée avec d’autres souris dans sa cage. Vérifiez le site d’incision et la santé globale de la souris tous les jours pendant une semaine après la chirurgie. Ensuite, vérifiez-le une fois par semaine.

Si, à tout moment, la souris présente des signes de déclin de sa santé, elle doit être euthanasiée et ses tissus prélevés. Une fois que les souris ont atteint un point temporel postopératoire prédéterminé, anesthésie avec de la kétamine et de la xylazine et perfuse l’animal tardivement avec un tampon, suivi d’un fixateur, puis récoltez les tissus et traitez-les pour l’histologie. La thyroïde et la trachée d’un animal témoin non injecté sont montrées ici avec des follicules de coloration à l’hématine et à l’éosine, présentent une association étroite mais lâche et ont une morphologie essentiellement ronde.

En revanche, les souris recevant une injection orthotopique de 500 000 cellules TC A présentent une infiltration significative de cellules cancéreuses dans la thyroïde quatre semaines après l’injection. La nature des cellules envahissantes présente des cellules fusiformes caractéristiques et des cellules de taille moyenne à géante avec un cytoplasme éosinophilique et de gros noyaux. En raison de la petite taille de la thyroïde et de l’utilisation d’une administration injectable, des résultats involontaires peuvent survenir, tels que le développement d’une masse tumorale à l’extérieur de la thyroïde, mais n’englobant pas celle-ci.

Cela est dû à la pénétration de l’aiguille à travers la thyroïde lorsque les cellules sont expulsées Parfois, des souris ne présentant aucune croissance tumorale, à la fois grossièrement et histologiquement, sont détectées comme indiqué ici. L’absence de développement tumoral détectable est causée par l’expulsion de la suspension cellulaire du site d’injection dans les tissus et les cavités voisins Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 minutes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer votre propre modèle orthotopique pour le carcinome anaplasique de la thyroïde.

En accédant chirurgicalement à la glande thyroïde et en injectant des cellules C en culture.