Expérimentale transport pneumocoque humaines

Le but de cette procédure est d’établir un portage expérimental du pneumocoque humain. Pour ce faire, il faut d’abord diluer et quantifier les bactéries présentes dans l’inoculum. Dans la deuxième étape, le volontaire est inoculé par voie intranasale avec streptococcus pneumoniae.

Ensuite, le volontaire subit un lavage nasal les jours deux, sept et 14 après l’inoculation. Enfin, la microbiologie classique est utilisée pour déterminer si le volontaire est porteur de l’occus inoculé. En fin de compte, un portage pneumococcique humain expérimental peut être obtenu en utilisant cette méthode sûre et reproductible.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux modèles de portage murin existants est qu’elle offre un modèle de portage chez l’hôte naturel du pneumocoque, l’homme. De plus, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du pneumocoque, telles que quels sont les corrélats immunologiques de la protection ? Quel est l’effet immunisant du portage et quel est l’effet de la pression de l’hôte sur l’agent pathogène dans la niche nasopharyngée ?

Les applications de cette technique comprennent son utilisation comme méthode pour sélectionner de nouveaux vaccins antipneumococciques. Nous prévoyons d’utiliser la prévention du portage comme substitut de l’immunité induite par le vaccin. La démonstration de la technique clinique sera assurée par la sœur Angie Wright et l’infirmier responsable David Shaw.

30 minutes avant le rendez-vous prévu pour l’inoculation des volontaires, un tube de stock d’inoculum prélevé dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, faites tourner l’inoculum tho dans une micro-centrifugeuse pendant trois minutes à 17 000 fois. G, pendant que le tube tourne, réchauffez des plaques de gélose au sang dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Retirez ensuite le bouillon de l’inoculum de la centrifugeuse et lavez la pastille dans un millilitre de solution saline. Répétez l’étape de centrifugation et de lavage. Effectuez un ensemble de dilution pour la concentration d’inoculum souhaitée, puis quantifiez la quantité de bactéries dans l’inoculum par une méthode semblable à celle des kilomètres et du misra.

Les colonies développées deviendront visibles le lendemain. Apportez l’inoculum au volontaire qui doit être assis confortablement en position semi-allongée. Puis à l’aide d’un perpe P 200 et d’embouts filtrants stériles.

Prélevez 100 microlitres d’inoculum dans l’embout perpe et insérez l’embout juste à l’intérieur de la cavité nasale. Expulsez lentement l’inoculum sur la muqueuse nasale en effectuant un mouvement circulaire. Ne placez pas l’embout de la pipette trop en arrière, sinon l’inoculum coulera dans la gorge.

Répétez l’inoculation pour les autres narines afin d’éviter que les bactéries ne pénètrent dans la circulation sanguine. Attention à ne pas perturber la muqueuse avec la pipette. Ensuite, demandez au volontaire de rester en position semi-allongée pendant 10 minutes pour permettre aux bactéries de se disperser sur la muqueuse.

Après avoir administré l’inoculum aux volontaires, répétez la quantification bactérienne au laboratoire. Étiquetez ensuite le tube avec la date et la dose d’inoculum, et conservez l’inoculum à moins 80 degrés Celsius. Avant de commencer le lavage nasal, demandez au volontaire de s’asseoir confortablement, la tête inclinée vers l’arrière à 30 degrés par rapport à la verticale.

Ensuite, demandez au bénévole de prendre et de retenir une profonde respiration tout en poussant la langue vers le haut et vers l’arrière contre le toit de la bouche. Demandez au bénévole de signaler lorsque cette position est atteinte. Maintenant, lavez la cavité nasale quatre fois avec 20 millilitres de solution saline, en déchargeant cinq millilitres de solution saline à la fois dans l’espace nasal antérieur.

Demandez au volontaire de se pencher immédiatement en avant et d’expirer rapidement par le nez dans un bol en aluminium pour expulser le liquide après chaque rinçage salin de cinq millilitres. Après avoir lavé la cavité nasale avec les quatre 20 millilitres, rassemblez tous les échantillons collectés dans un tube à centrifuger. Maintenant, centrifugez les échantillons volontaires de lavage nasal pendant 10 minutes à 3 345 fois G. Retirez le supinate et stockez-le sous forme d’aliquotes d’un millilitre dans des tubes einor étiquetés à moins 80 degrés Celsius.

Ajoutez 100 microlitres de milieu STGG à la pastille et mélangez soigneusement, puis déterminez le volume total dans le tube. Plaque suivante, une goutte de 20 microlitres de la pastille remise en suspension sur une plaque de gélose au sang contenant de la gentamycine et striez toute la plaque. Si le lavage nasal est post-inoculation, utilisez 10 microlitres de STGG contenant la pastille remise en suspension.

Pour la quantification bactérienne par la méthode des miles et Misra, ajoutez 800 microlitres supplémentaires de STGG dans le tube de lavage nasal et mélangez soigneusement. Ensuite, versez 25 microlitres de la solution de cellules bactériennes STGG sur une autre plaque de gélose au sang et 25 microlitres sur une plaque de gélose au chocolat, en striant l’intégralité des deux plaques. Congelez ensuite les bactéries restantes dans deux flacons cryogéniques à moins 80 degrés Celsius.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, examinez les plaques à la recherche de pneumocoques et d’autres agents pathogènes respiratoires potentiels. Les plaques de gélose au sang, inoculées avec des lavages nasaux, peuvent être difficiles à lire.

Cette image montre un exemple de plaque facile à lire avec les pneumocoques clairement visibles. Cependant, cette plaque contient de nombreuses flores co-colonisatrices, ce qui rend plus difficile de déterminer si des pneumocoques sont présents à chaque rendez-vous. On a demandé aux volontaires de décrire tout symptôme des voies respiratoires supérieures s’il était présent, et la comparaison entre les porteurs et les non-porteurs a été mise en évidence.

Sur les 145 personnes récemment inoculées avec le pneumocoque, 28 se sont plaintes de symptômes, comme le résume ce tableau. Huit de ces volontaires étaient des porteurs, 20 ne l’étaient pas. Toutes les plaintes ont été examinées par le comité de sécurité externe et ont fait l’objet d’enquêtes approfondies.

Aucun symptôme n’a été attribué à une pneumococcie. Les symptômes les plus courants étaient le mal de gorge, le nez bouché et la grippe. Lors de cette procédure, il est important d’avoir un plan de sécurité très complet en place, qui couvre chaque étape de la méthode, en particulier pour la sécurité des volontaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir un portage pneumococcique humain expérimental et de détecter le portage à l’aide d’un lavage nasal.