Name: Ex Vivo globules rouges Assay Hémolyse pour lévaluation des pH-sensibles agents endosomolytique pour la livraison des médicaments cytosolique Biomacromolecular (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Découvrez un test d'hémolyse ex vivo pour évaluer l'activité endosomolytique des vecteurs de médicaments pH-sensibles. Cette méthode utilise les globules rouges comme modèle membranaire pour optimiser la livraison intracellulaire.

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Les auteurs remercient le financement par l&#39;intermédiaire du ministère de la Défense dirigé par le Congrès programmes de recherche médicale (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) et l&#39;American Heart Association (# 11SDG4890030).

1. Préparation et stérilisation des tampons et des agents de test <ol><li> NaCl 150 mM tampon: dissoudre 4,383 g de cristaux de NaCl dans 500 ml d&#39;eau nanopure. </li><li> Tampons pH: Préparation des tampons phosphate à pH 5,6, 6,2, 6,8, et 7,4 en mélangeant des quantités appropriées d&#39;monobasique et de phosphate de sodium dibasique. Si les échantillons doivent être testés à des valeurs de pH plus faibles (c.-à pH &lt;5,6), puis un tampon plus approprié, comme un tampon citrate, doit être utilisé. Recettes tampons sont facilement disponibles, et une référence par exemple a été fourni ici 12. </li><li> Stériliser tous les tampons indiquées ci-dessus à travers un appareil sur flacon vide filtration et re-vérifier tampon de pH. </li><li> 20% de Triton X-100 (contrôle positif): Mélanger 20 ml pur Triton X-100 dans 80 ml d&#39;eau nanopure. Vortex vigoureusement et sonication à se dissoudre. Laisser à température ambiante pendant une nuit avant de l&#39;utiliser. </li></ol> 2. Préparation des érythrocytes <ol><li> Obtenir 25 ml de sang from un donateur anonyme humaine, tirées directement dans des tubes Vacutainer K 2-EDTA recouvertes pour éviter la coagulation. </li></ol> REMARQUE: Toutes les procédures doivent être approuvés au préalable par le comité d&#39;examen institutionnel approprié (CISR) et ponction veineuse et de prélèvement sanguin doit être effectué par un préleveur formé afin de minimiser le risque pour le donneur. Les procédures standards de saignée ont été publiés ailleurs 13. <ol start="2"><li> Centrifuger le sang à 500 xg pendant 5 min, et les niveaux d&#39;hématocrite marque (rouge, couche inférieure) et le plasma (jaunâtre, couche supérieure) sur le tube. </li><li> Aspirer doucement le plasma par l&#39;intermédiaire d&#39;une micropipette, ajouter dans l&#39;eau de Javel, et jeter dans les déchets biologiques. </li><li> Remplir le tube à hématocrite ligne marquée (niveau initial du plasma) avec une solution de NaCl 150 mM. Cap et la retourner plusieurs fois pour mélanger doucement. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.3 à 2.4 pour laver les globules nouveau. Puis aspirer supernatfourmi et remplacez-le par du PBS à pH 7,4. Mélanger par inversion. </li><li> Fractionner le sang uniformément dans quatre tubes, chacun correspondant à un pH qui va être testée. Etiqueter les tubes en fonction de chaque pH à tester (5,6, 6,2, 6,8, 7,4). </li><li> Centrifuger les tubes de sang à 500 xg pendant 5 min. Marquer les niveaux sur les tubes, puis aspirer le surnageant. </li><li> Remplir chaque tube à la ligne marquée avec un tampon de pH approprié (comme indiqué au point 2.6). </li><li> Étiquette quatre tubes de 50 ml coniques (un par unité de pH à l&#39;essai), et une pipette 49 ml de PBS de pH approprié dans chaque tube conique. </li><li> Ajouter 1 ml d&#39;érythrocytes (même pH) dans le tube correspondant à une dilution de 1:50. Inspectez visuellement le sang dilué, ce qui devrait être trouble et se déposeront si on les laisse tranquille. Si aucun formulaire à granulés, les cellules ont lysées. </li></ol> 3. Essai de lyse 96 Réglages Plate bien et quantification <ol><li> Préparer les solutions mères de tous les agents d&#39;administration de médicaments expérimentaux, à 20x la concentration finale désirée à tester (testaura 10 ul d&#39;agent de l&#39;administration de médicaments + 190 pl dilué globules rouges, conduisant à une dilution de 1/20 de l&#39;agent de l&#39;administration de médicaments d&#39;origine dans le mélange d&#39;essai final). Stocks de 20, 100 et 800 pg / ml sont proposés, ce qui entraîne des concentrations d&#39;essai finales de 1, 5 et 40 ng / ml, respectivement. </li><li> Pipeter 10 ul de chaque solution mère dans V-bottom plaques à 96 puits. Pour des résultats optimaux, chargez chaque échantillon en triple ou quadruple. </li></ol> REMARQUE: Pour plus de facilité, il est recommandé qu&#39;un séparée plaque de 96 puits doit être préparé pour chaque pH à tester, à chaque échantillon (pour chaque concentration) chargé à n = 3-4 par plaque. <ol start="3"><li> Pour les puits de contrôle positif, ajouter 10 ul de Triton 20% X-100. </li><li> Pour les puits de contrôle négatif, ajouter 10 ul de tampon phosphate. Utiliser un tampon au même pH à tester. </li><li> Pipeter 190 pi d&#39;érythrocytes dilué (voir 2.10) à chaque puits, en s&#39;assurant que la solution mère cellule restehomogène au cours du transfert. Astuce: Utilisez pipette multi-canaux pour simplifier cette tâche. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C pendant une heure (en option: Utiliser un agitateur orbital ou à bascule). </li><li> Centrifuger les plaques pendant 5 min à 500 xg à granulés érythrocytes intacts. Remarque: lorsque vous retirez la plaque de la centrifugeuse et le transporter à l&#39;étape suivante, à manipuler avec précaution et être certain de ne pas perturber le culot cellulaire. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, transférer 100 ul de surnageant de chaque puits dans un cadre clair, à fond plat de 96 puits. Remarque: si le culot cellulaire est agité accidentellement pour n&#39;importe quel échantillon (s), on peut re-centrifuger la plaque, puis procéder au transfert de surnageant. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance des surnageants avec un lecteur de plaques. Notez que toute une gamme de longueurs d&#39;onde peuvent être utilisés (400 - 541 nm). </li></ol> REMARQUE: les lecteurs de plaques différentes peuvent avoir des points de saturation et des sensibilités différentes, de sorte que le choix d&#39;une longueur d&#39;onde pour moiasurements dépend de si oui ou non les données hémolyse des échantillons expérimentaux peuvent être normalisés de manière fiable l&#39;hémolyse maximale induite par traitement avec un détergent. Cela nécessite une mesure précise des valeurs d&#39;absorbance des échantillons témoins positifs. <ol start="10"><li> Utilisation de Microsoft Excel ou un logiciel similaire des données d&#39;analyse, trouver le moyen de les lectures d&#39;absorbance de fond portant sur les échantillons témoins négatifs mis en place pour chaque pH (étape 3.4). Soustraire cette valeur d&#39;absorbance de fond de tous les autres échantillons qui ont été mesurés à ce pH. </li><li> Après soustraction de fond, trouver l&#39;absorbance moyenne du contrôle positif de détergent échantillons traités (étape 3.3). Puis normaliser tous les points de données expérimentales à cette valeur moyenne de l&#39;absorbance, ce qui devrait représenter 100% d&#39;hémolyse. Enfin, il faut multiplier chaque valeur et de 100% pour calculer% d&#39;hémolyse qui s&#39;est produite dans chaque puits par rapport au témoin détergent. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 4th, Garland Science. (2002).</li>
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</ol>

Approbation de l&#39;IRB: Les procédures impliquant des sujets humains ont été approuvés par le Conseil Vanderbilt University Institutional Review (CISR; Protocole n ° 111251). Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

pH-sensible polymères ou d&#39;autres agents conçus pour fonction endosomolytique peut être rapidement et efficacement sélectionnés en fonction de lyse des globules rouges à des valeurs de pH rencontrées dans l&#39;endosome (figure 1; pH 6,8 - endosome précoce, pH 6,2 - endosome tardif, pH 5,6 - lysosome). 14-17 dépendante du pH hémolyse a été utilisé pour cribler la capacité des transporteurs à la médiation de libération de médicaments endosomal biomacromolecular (peptides, par exemple,<...

Bien qu&#39;il existe de nombreux potentiels à fort impact cibles thérapeutiques à l&#39;intérieur de la cellule, la délivrance intracellulaire d&#39;agents pose un défi de taille. Souvent, les médicaments, les produits biologiques, en particulier sont internalisés par les cellules et la traite dans des vésicules qui soit conduire à une dégradation de leur contenu par la voie endo-lysosomal, ou la navette de retour hors de la cellule par exocytose. 1 Dans ce dernier procédé, le pH interne des vésicules est acidifiée à environ 5-6, qui est le pH optimal pour l&#39;activité des enzymes qui agissent dans ce compartiment, tel que le lysozyme. 2 Récemment, un certain nombre de matériaux ont été spécialement conçues pour tirer parti de l&#39;acidification des endosomes pour faciliter la distribution cytosolique de leur cargaison. Un exemple de cette approche utilise des nanoparticules de polymères synthétiques, des micelles dont l&#39;activité principale est zwitterionique et charge neutre au pH physiologique (c. 7.4). Cependant, à pH 6,0- 6,5, les polymères deviennent protonés et acquérir une charge positive nette qui déstabilise le noyau des micelles, et les segments de polymère exposées interagir avec et désorganiser la membrane de l&#39;endosome. Cette activité a été montré pour favoriser l&#39;évasion endosomal des peptides et des acides nucléiques thérapeutiques à base leur permettant d&#39;accéder à leurs cibles cytosoliques. 3,4 D&#39;autres exemples de méthodes élaborées pour servir de médiateur évasion endosomal qui perturbent la barrière de la membrane comprennent fusogènes &#39;«peptides ou protéines qui peuvent médier la fusion membranaire ou transitoire formation de pores dans la bicouche phospholipidique. 5 Homopolymères de anioniques acides acryliques d&#39;alkyle tels que le poly (acide propylacrylique) sont une autre approche bien étudiée, et dans ces polymères, l&#39;état de protonation de l&#39;acide carboxylique pendant dicte transition dans un hydrophobe, membrane interruption de l&#39;État dans des gammes de pH endo-lysosomal. 6,7 Un système modèle utile pour le criblage comportement endosomolytique est l&#39;ex dépendante du pH in vivo hémolyse dosage. 8 Dans ce système modèle, la membrane érythrocytaire sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Ce modèle généralisable a été utilisé par d&#39;autres pour évaluer le comportement endosomolytique des peptides de pénétration cellulaire et d&#39;autres polymères de systèmes de transfert de gènes. 8-11 Dans cette expérience, les globules rouges humains et matériels de test sont co-incubées dans des tampons à des pH définis qui imitent extracellulaires (7,4), au début des endosomes (6,8), et la fin de l&#39;endo-lysosomal (&lt;6,8) environnements. La quantité d&#39;hémoglobine libérée au cours de la période d&#39;incubation est quantifié comme une mesure de la lyse des globules rouges, qui est normalisée à la quantité d&#39;hémoglobine libérée dans les échantillons témoins positifs lysées avec un détergent. De criblage d&#39;une petite bibliothèque de matériaux d&#39;essais potentiellement endosomolytiques, on peut en déduire que les échantillons qui produisent aucune hémolyse à pH 7,4, mais l&#39;ourlet significativement élevéolysis à pH &lt;6,5, seront les candidats les plus efficaces et cytocompatible pour l&#39;administration de médicaments cytosolique. Les matériaux qui répondent à ces critères on peut s&#39;attendre à rester inerte et non pas aveuglément détruire membranes bicouches lipidiques (c. qui pourrait provoquer une cytotoxicité) avant d&#39;être exposé à une baisse du pH local après internalisation dans l&#39;endo-lysosomal compartiments. Dans ce protocole, les érythrocytes sont isolés à partir d&#39;un donneur humain et co-incubée à pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 avec expérimentales endosomolytiques agents de délivrance de médicaments. Érythrocytes intacts sont culottées, et les surnageants (contenant de l&#39;hémoglobine libérée des érythrocytes lysés) sont analysés pour l&#39;absorbance caractéristique de l&#39;hémoglobine par l&#39;intermédiaire d&#39;un lecteur de plaque (figure 1).

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - Tubes Vacutainer EDTA K2 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Pour la collecte de sang </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Aiguilles de prélèvement sanguin, 20,5 calibre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Pour la collecte de sang </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Tube Holder / aiguille adaptateur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Pour la collecte de sang </td></tr><tr><td> Marque BD Tampons d&#39;alcool isopropylique </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Pour la collecte de sang </td></tr><tr><td> BD Vacutainer sans latex Tourniquet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Pour la collecte de sang </td&gt; </tr><tr><td> L&#39;acide chlorhydrique (conc.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> Pour le réglage du pH de D-PBS. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Contrôle positif </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Bouteille à usage unique stérile MF75-Haut Unité de filtration avec membrane SFCA </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09 à 740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD plaques à 96 puits, à fond plat, en polystyrène, de culture de tissu traité </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 à 772-2C </td><td> Pour plaque de lecture à la fin de l&#39;essai. </td></tr><tr><td> BD plaques à 96 puits, polystyrène à fond rond, de culture de tissu traité </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> L&#39;incubation de globules rouges avec des agents expérimentaux. </td></tr></table&gt;

ex vivo globules rouges assay hémolyse pour l&#39;évaluation des ph-sensibles agents endosomolytique pour la livraison des médicaments cytosolique biomacromolecular

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Bicouches de phospholipides qui constituent endo-lysosomal vésicules peuvent constituer un obstacle à la livraison de médicaments biologiques à des cibles intracellulaires. Pour surmonter cet obstacle, un certain nombre de transporteurs de drogues synthétiques ont été conçus pour une perturbation active de la membrane de l&#39;endosome et livrer de la marchandise dans le cytoplasme. Ici, nous décrivons le test d&#39;hémolyse, qui peut être utilisé aussi rapide et à haut débit pour l&#39;écran et l&#39;activité cytocompatibilité endosomolytique des systèmes de délivrance de médicaments intracellulaires. Dans l&#39;essai d&#39;hémolyse, des globules rouges humains et des matériaux de test sont co-incubés dans des tampons à des pH définies, qui imitent extracellulaires début endosomes, et la fin de l&#39;endo-lysosomiaux environnements. Après une étape de centrifugation à granulés de globules rouges intacts, la quantité d&#39;hémoglobine libérée dans le milieu est mesurée par spectrophotométrie (405 nm pour la gamme plus dynamique). La perturbation pour cent des globules rouges est ensuite quantifié par rapport au contrôle positif sampLes lysées avec un détergent. Dans ce système, le modèle de la membrane du globule rouge sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Le résultat souhaité est l&#39;hémolyse négligeable à pH physiologique (7,4) et une hémolyse robuste dans la gamme de pH endo-lysosomal d&#39;environ 5 à 6,8 pH.

<html> Typiquement, les agents qui présentent idéal dépendante du pH comportement hémolytique ont le plus grand potentiel pour la livraison de médicaments cytosolique, des acides nucléiques ou d&#39;autres molécules bioactives. Ceci est illustré par l&#39;agent n ° 1 comme représenté à la figure 2, qui présente une hémolyse minimale à un pH de 7,4, mais une forte augmentation des comportements à hémolytique gammes de pH des endosomes (&lt;6,5). Certains agents peuvent présenter des niveaux significatifs ...

Un essai d&#39;hémolyse ne peut être utilisée comme rapide, à haut débit écran de cytocompatibilité systèmes d&#39;administration de médicaments et de l&#39;activité de la livraison des marchandises endosomolytique intracellulaire. Le test mesure la perturbation des membranes des érythrocytes en fonction du pH de l&#39;environnement.

Ex Vivo globules rouges Assay Hémolyse pour l&#39;évaluation des pH-sensibles agents endosomolytique pour la livraison des médicaments cytosolique Biomacromolecular

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

L'objectif général de cette expérience est d'évaluer de manière quantitative le potentiel de perturbation membranaire de vecteurs de délivrance de médicaments pour la délivrance intracellulaire de produits biologiques, les globules rouges servant de modèle biologique de la membrane endosomiale. Cette vidéo a été produite par le laboratoire de thérapeutiques avancées de l'université Vanderbilt. Toutes les procédures impliquant des sujets humains ont été approuvées par le comité d'éthique institutionnel de Vanderbilt.Tout d'abord, une brève introduction à l'endocytose, à l'hémolyse et à l'hémolyse. Les porteurs de produits biologiques sont internalisés par la cellule au sein de vésicules endosomales par endocytose non spécifique ou médiée par récepteur. Après l'endocytose.La cargaison est soit dégradée dans les lysosomes, soit acheminée vers l'extérieur par exocytose dans l'espace extracellulaire. Comme indiqué, la diminution du pH dans un endosome peut être exploitée à l'aide de transporteurs de médicaments sensibles au pH, qui, en raison de l'environnement acide, deviennent perturbateurs de membrane, créant physiquement des pores et/ou déstabilisant la membrane endosomiale. Une fois la membrane endosomiale rompue, la cargaison médicamenteuse peut être libérée dans le cytoplasme et diffuser vers les sites cibles situés dans le cytoplasme, les mitochondries ou le noyau. Dans cet essai, des globules rouges sont utilisés comme modèle de membrane endosomiale à pH physiologique.Les vecteurs de livraison idéaux resteront stables et n'altéreront pas la membrane des globules rouges. Toutefois, lorsque le pH diminue, le vecteur de livraison deviendra instable, entraînant des interactions hydrophobes qui détruisent la membrane des globules rouges, libérant ainsi l'hémoglobine. L'hémoglobine peut ensuite être isolée à partir des globules rouges et quantifiée par spectrophotométrie par mesure de l'absorbance à 405, 450 ou 541 nanomètres.Des valeurs d'absorbance plus élevées correspondront à un comportement endom lytique plus puissant. Cela peut être visualisé par microscopie en accéléré à pH physiologique. Les globules rouges restent stables en présence du vecteur thérapeutique.Cependant, à un pH plus faible, caractéristique de la voie endosomale, les vecteurs de livraison perturbent et détruisent rapidement les membranes des globules rouges. Les matériaux nécessaires à cette étude comprennent du chlorure de sodium à 150 millimolaire, préparé avec 500 millilitres d'eau déionisée et 4,383 gramme de chlorure de sodium, stérilisé par filtration sous vide à l'aide d'un système de filtration sous flacon. Des solutions tamponnées au phosphate à pH 7,4, 6,8, 6,2 et 5,6 ont ensuite été préparées en mélangeant les quantités appropriées de tampons monosodique et disodique de phosphate et stérilisées par filtration sous vide à l'aide d'un système de filtration sous flacon.Le pH a été surveillé à l’aide d’un pH-mètre et/ou de bandelettes pH, utilisés selon plusieurs méthodes afin de garantir la précision des mesures. Le Triton X 20 % a été préparé en dissolvant 20 millilitres de Triton X-102 dans 80 millilitres d’eau nano-pure, en agitant vigoureusement puis en soumettant à une sonication pour favoriser la dissolution, après approbation par le comité d’éthique institutionnel. Demandez à votre infirmier(ère) chargé(e) de l’étude ou à votre préleveur(trice) de prélever 25 millilitres de sang total auprès d’un donneur anonyme dans des tubes sous vide revêtus d’EDTA potassium afin d’empêcher la coagulation.Dans cette vidéo, une aiguille de prélèvement de calibre 20,5 reliée à un adaptateur vacutainer est utilisée. Le sang prélevé est centrifugé à 500 fois la gravité pendant cinq minutes. Après la centrifugation, la couche de plasma et la couche de globules rouges doivent être visibles.Veillez à ne pas perturber les couches en agitant. Marquez les niveaux du plasma, puis aspirez délicatement à l’aide d’une micropipette ou d’un aspirateur sous vide et jetez dans de l’eau de javel. Remplacez le plasma par du chlorure de sodium 150 millimolaire en remplissant jusqu’à la ligne marquée.Fermez le flacon et retournez-le plusieurs fois pour mélanger délicatement. Centrifugez une deuxième fois à 500 ×g pendant cinq minutes, puis aspirez le surnageant. Remplacez le surnageant jusqu’à la graduation marquée par du chlorure de sodium à 150 millimolaire et retournez le flacon plusieurs fois pour mélanger délicatement. Centrifugez une troisième fois à 500 ×g pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et remplacez-le jusqu’à la ligne marquée par du PBS de pH 7,4.Répartir uniformément le prélèvement sanguin dans quatre tubes. Un tube pour chaque pH à tester, y compris le pH physiologique de 7,4, le pH endosomal précoce de 6,8, le pH endosomal tardif de 6,2 et le pH de l'endosome tardif ou lysosomal de 5,8. Répéter la centrifugation pour la quatrième et dernière fois à 500 G pendant cinq minutes.Marquez les niveaux du surnageant et aspirez doucement en éliminant le surnageant dans de l'eau de Javel. Remplacez le surnageant par du PBS de pH approprié. Les stocks finaux de globules rouges sont préparés en diluant les solutions mères 50 fois dans un tampon de pH approprié.Dans ce cas, un millilitre de globules rouges concentrés a été ajouté à 49 millilitres de PBS ; retourner délicatement le flacon plusieurs fois pour mélanger les globules rouges avant la préparation du sang. Préparer des solutions mères de véhicules de livraison à une concentration 20 fois supérieure. Pour les polymères, nous proposons 2100 et 800 microgrammes par millilitre comme concentrations initiales de test ; une fois diluées, la concentration finale sera de 105 et 40 microgrammes par millilitre pour l'incubation. Utiliser des plaques coniques ou à fond rond afin que les globules rouges intacts puissent être éliminés par centrifugation. Prélever 10 microlitres de la solution de polymère 20 fois concentrée dans chaque puits.Nous recommandons d'analyser les échantillons en au moins triplicata ou quadruplicata afin d'optimiser les résultats. Le Triton X lyse toutes les cellules et peut être utilisé comme contrôle positif à une concentration finale de 1 %. Le PBS à pH 7,4 peut être utilisé comme contrôle négatif. Pipeter 190 microlitres de globules rouges dilués dans chaque puits. Veiller à ce que la solution de globules rouges reste homogène, ce qui peut nécessiter un léger agitation ou mélange pour maintenir leur suspension.Notez que, une fois les globules rouges ajoutés, vous pouvez déjà observer le début de la lyse pour les composés extrêmement hémolytiques. Incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre la lyse après une heure. Retirez les plaques pour la centrifugation ; centrifugez les plaques à 500 ×g pour former un culot de globules rouges.Ensuite, transférez soigneusement 100 microlitres du surnageant dans une plaque 96 puits à fond plat. Il est essentiel de ne pas perturber le culot d'hématies, veillez donc à manipuler avec précaution. Mesurez l'absorbance de chaque puit à l'aide d'un lecteur de plaques à 450 nanomètres.Si l'hémoglobine est trop concentrée et que des lectures de DENSITÉ OPTIQUE élevées sont obtenues, les plaques peuvent également être lues à 541 nanomètres. Alternativement, si l'hémoglobine est trop diluée et que des lectures de densité optique faibles sont obtenues, les plaques peuvent être lues à 405 nanomètres afin de maximiser la densité optique. Pour analyser les données, le pourcentage d'hémolyse peut être calculé en supposant que le PBS ne lysera aucune des hématies et que le Triton X lyséra 100 % des hématies.L'équation indiquée permettra d'obtenir le pourcentage d'homolyse pour chaque échantillon. Des logiciels tels que Microsoft Excel peuvent être utilisés pour analyser rapidement des expériences provenant de centaines de puits. Voici des résultats représentatifs à plusieurs concentrations, dans les plages de pH mentionnées.Cette formulation présente une réponse idéale au pH et ne montre aucune activité hémolytique au pH physiologique, mais elle adopte un comportement de commutation à pH endosomal, entraînant une perturbation membranaire importante, comme indiqué par la flèche rouge. Vous venez de visionner la vidéo de notre laboratoire décrivant le test d'hémolyse des globules rouges dépendant du pH. Il s'agit d'un test relativement peu coûteux, facile à utiliser et à haut débit, qui peut être utilisé pour cribler des bibliothèques combinatoires ou des séries de polymères conçus pour la délivrance endolytique de médicaments biologiques.Nous avons constaté que cet essai permettait de prédire avec une grande fiabilité la délivrance cytosolique et l'activité biologique d'une large gamme de produits biologiques, notamment des protéines, des peptides et des acides nucléiques. Toutefois, il convient de mentionner que cet essai présente certaines limites potentielles. Il est considéré comme un bon outil prédictif pour les polymères ou les peptides qui perturbent effectivement la membrane endosomiale par un mécanisme physique.Cependant, ce n'est pas un bon outil prédictif à utiliser pour les polymères ou d'autres systèmes agissant selon un mécanisme basé sur l'éponge à protons. En outre, il faut tenir compte du fait que la composition de la bicouche lipidique des globules rouges ne reproduit pas exactement celle des membranes endosomales ou lysosomales. En ce qui concerne la composition lipidique et la teneur en cholestérol, il convient toujours de prévoir un suivi.Tout résultat d'hémolyse des globules rouges doit être complété par des techniques et dosages complémentaires. Par exemple, la microscopie fluorescente utilisée conjointement avec des colorants endosomaux ou lysosomaux peut être employée dans des études de colocalisation afin de visualiser l'échappement des médicaments biologiques des voies endo-lysosomales. En outre, la mesure de l'activité biologique ou des effets en aval du médicament ou biomédicament délivré doit toujours constituer la dernière étape.Enfin, n'oubliez jamais de manipuler et d'éliminer les déchets biologiques dangereux conformément aux directives de votre établissement. C'est la fin de notre vidéo. Nous vous souhaitons bonne chance dans vos expériences.

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Ex Vivo globules rouges Assay Hémolyse pour lévaluation des pH-sensibles agents endosomolytique pour la livraison des médicaments cytosolique Biomacromolecular (Vidéo) | JoVE Journal

Ex Vivo globules rouges Assay Hémolyse pour l'évaluation des pH-sensibles agents endosomolytique pour la livraison des médicaments cytosolique Biomacromolecular

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