Modèle murin Spinotrapezius pour évaluer l'impact de la ligature artériolaire sur la fonction microvasculaire et Rénovation

Nous démontrons un modèle de ligature artérielle roman dans le muscle spinotrapezius murin, y compris une procédure étape par étape et une description de l'instrumentation nécessaire. Nous décrivons la chirurgie et la mesure des résultats pertinents relatifs au remodelage du réseau vasculaire et une vasodilatation fonctionnelle en utilisant la microscopie confocale et intravitale.

Les maladies vasculaires périphériques touchent environ 12 à 14 % de la population et sont particulièrement fréquentes chez les fumeurs et les personnes atteintes de diabète, d’obésité, d’hypertension, de stade avancé ou d’athérosclérose. Le but de cette chirurgie est de produire un modèle d’ischémie des muscles squelettiques en ligaturant l’une des trois artères nourricières à la moitié dorlotée du muscle spino trapèze miroir. Cette animation représente l’emplacement général de ces artères et indique le site de ligature prévu en réponse à l’ischémie.

Le tissu vasculaire subira des modifications caractéristiques de l’agénésie artérielle en fonction de la souche de souris. Cela inclut la formation de collatéraux de pontage ou l’augmentation de la tortuosité du navire. Nous vous montrerons également comment effectuer une procédure de vasodilatation fonctionnelle sur le trapèze de la colonne vertébrale à l’aide de la microscopie intra-vitale.

Il s’agit d’exposer soigneusement le muscle, de placer les électrodes de stimulation avec leur source d’alimentation et leur contrôleur, puis de configurer l’appareil d’imagerie. Enfin, nous montrerons comment exciser le muscle et décrirons un processus de fixation adapté à la coloration immunochimique et à l’imagerie. Bonjour, je m’appelle Shane Pierce Kotler et je suis professeur agrégé au Département de génie biomédical de l’Université de Virginie à Charlottesville.

Bonjour, je m’appelle Kyle Martin. Je suis un étudiant diplômé dans le laboratoire de Shane et je vais jouer dans le modèle de ligature du trapèze spinal. Notre laboratoire étudie la croissance et le remodelage microvasculaires, en particulier dans les contextes de maladies ischémiques telles que les maladies cardiaques, les maladies artérielles périphériques et les accidents vasculaires cérébraux.

Nous avons développé ce modèle de ligature du trapèze spinal pour étudier comment l’obstruction localisée du flux sanguin artériel génère des adaptations structurelles dans les réseaux microvasculaires en aval. Nous considérons que ce modèle est complémentaire au modèle d’ischémie des membres postérieurs bien établi et largement utilisé en ce sens qu’il offre une vue de l’ensemble du réseau des FFA de l’artère, de la neurogenèse et de l’angiogenèse dans un muscle très mince qui ne nécessite pas de coupe histologique pour l’analyse. Parce que ce muscle est si mince et parce que la ligature crée une réduction reproductible du flux sanguin, nous pouvons visualiser les effets de la ligature artérielle sur l’ensemble du lit microvasculaire et avec un seul niveau de résolution cellulaire.

Après que Kyle nous ait expliqué étape par étape la procédure étape par étape pour réaliser le modèle de ligature du spino trapèze, nos collaborateurs de Cal Poly nous montreront comment ils utilisent ce modèle pour étudier la vasodilatation fonctionnelle. Une fois que nous aurons vu cela, nous vous ramènerons à l’Université de Virginie et récolterons le trapèze de la colonne vertébrale, ce qui doit être fait avant l’imagerie et la coloration. Bonjour, je m’appelle Trevor Cardinal.

Je suis professeur adjoint au département de génie biomédical de l’Université d’État de Cal Poly à San Luis Obispo, en Californie, et je m’appelle Josh Cutz. Je suis étudiant à la maîtrise en génie biomédical à Cal Poly à San Luis Obispo. L’intérêt principal de notre laboratoire de recherche est de comprendre l’impact de l’ischémie chronique telle qu’elle se produit avec la maladie périphérique sur les capacités fonctionnelles du système vasculaire de résistance.

Ainsi, après la chirurgie de ligature de l’artère nourricière du trapèze spinal, Josh fera une démonstration de la procédure de vasodilatation fonctionnelle utilisée dans notre laboratoire. Dans notre laboratoire, nous utilisons la procédure de vasodilatation fonctionnelle pour examiner l’effet de l’occlusion artérielle sur la réactivité vasculaire et les instruments de contrôle du flux sanguin. Pour se préparer à l’avance, incluez une suture à 10 nœuds, une suture de fermeture, un porte-aiguille, des ciseaux à iris, une pince standard, des ciseaux à ressort et une micro-sonde courbée.

Après avoir préparé les instruments chirurgicaux anesthésie la souris, nous utilisons ici la formule d’affichage et le dosage. Confirmez l’anesthésie par l’orteil, le test de réflexe de pincement, puis appliquez l’IGEL protecteur à l’aide d’un rasoir électrique, une grande tache de fourrure du dos de l’animal. Bien que la ligature du trapèze rachidien ne nécessite qu’une petite zone à dégager près de l’omoplate, le prélèvement de tissu du trapèze rachidien à effectuer en quelques jours nécessitera une surface dégagée beaucoup plus grande.

Éliminez l’excès de poils, puis appliquez une crème dépilatoire en suivant les instructions du fabricant. Lavez le dos avec une éponge humide. Appliquez ensuite trois séries de lingettes alcoolisées alternées à la bétadine, en terminant par la bétadine odine.

Dans de bonnes conditions d’éclairage, le meilleur site d’incision peut être trouvé par l’identification transdermique du coussinet adipeux dorsal. Étant donné que l’artère nourricière traverse finalement le muscle trapèze de la colonne vertébrale brusquement, le coussinet adipeux de la coddle borde la peau à cet endroit et amène les ciseaux de l’iris directement d’en haut, perpendiculairement à la dorsale de l’animal et coupe pour faire une incision linéaire de trois à cinq millimètres. Si l’éclairage ou la pigmentation de la peau ne permettent pas l’identification transdermique.

Placez l’incision de cinq millimètres pour la proéminence osseuse de l’omoplate, étendez l’incision à travers les couches de peau et élargissez-la latéralement si nécessaire pour trouver le trapèze de la colonne vertébrale. Disséquez le fascia sus-jacent pour accéder au site de ligature. Si un vaisseau de surface est endommagé et qu’il y a des hémorragies comme dans ce cas, laissez le temps de saignée s’arrêter et appliquez une pression si nécessaire, utilisez une solution saline pour éviter la dessiccation.

L’artère indiquée se trouve le long de la face dorsale du trapèze spinal, puis traverse le muscle et pénètre dans le coussinet adipeux ventral. Trouvez le bord latéral du trapèze de la colonne vertébrale et réfléchissez-le, en le soulevant de manière à ce qu’il soit presque inversé. Cela révèle sa face ventrale et le site transversal de l’artère dissèque le coussinet adipeux ventral qui obscurcit le vaisseau.

Soyez prudent avec la pression des pinces pour éviter les blessures par écrasement. Ici, le chirurgien indique l’artère spina-trapèze à ligaturer. Notez la présence de paires de veines vasodilatatrices telles que l’adénosine à action plus courte ou la papine à action plus longue peuvent être appliquées.

Dans ce cas, l’artère se trouve entre deux autres vaisseaux comme indiqué par les flèches. L’un est de taille similaire à l’artère et serait vu comme se trouvant plus latéralement si le muscle n’était pas réfléchi, tandis que l’autre est beaucoup plus grand et se trouverait plus immédiatement. Les deux sites de ligature sont marqués par l’IA.

La première ligature est placée dans le sens aval par rapport à la seconde. Cela permet de s’assurer que le vaisseau est toujours rempli de sang et visible lors de la mise en place de la deuxième ligature. A indique la région à transecter.

Remarquez l’emplacement B, où l’artère et sa veine appariée sont entrées dans le coussinet adipeux ventral délimité par C.Cela nous permet de savoir que le deuxième vaisseau plus petit est une veine. Notez également l’art de la colonne vertébrale : le muscle trapèze lui-même décrit par D.Quelques conseils pour distinguer l’artère de la veine sont fournis dans le protocole de texte d’accompagnement. Mais brièvement, notre méthode préférée consiste à obstruer la circulation sanguine en appliquant une pression avec une micro-sonde.

S’il s’agit d’un vaisseau artériel, le flux sera obstrué en aval vers le muscle réfléchi qui s’applique. La technique ici exclut le plus grand vaisseau. Si nécessaire, utilisez la microsonde courbée à 80 degrés pour séparer l’artère des autres vaisseaux.

Cela se fait en perçant le tissu conjonctif sous le vaisseau et en effectuant de courts mouvements latéraux pour élargir un espace. Jusqu’à ce que la sonde puisse être facilement passée à travers la suture, l’aiguille peut maintenant être plus facilement enfilée sous l’artère. Dans ce cas, une petite veine a été entaillée, provoquant une hémorragie mineure.

Ce vaisseau se trouve suffisamment loin de la zone ischémique pour qu’il ait un impact minimal. Lors de la procédure, faites un seul nœud de chirurgien et préparez la suture suivante. Encore une fois, en passant par l’espace pré-fait et en faisant le nœud d’un autre chirurgien à quelques millimètres en amont de la ligature précédente.

Gardez à l’esprit que le muscle est réfléchi et que la direction du flux peut être opposée à celle attendue. Une fois les deux ligatures placées, recherchez des signes d’obstruction de la colonne de globules rouges. Si le flux n’a pas été arrêté, une autre ligature est nécessaire.

Sinon, transectez le vaisseau entre les ligatures, en notant que si un saignement se produit, dans ce cas, la ligature a réussi et aucune hémorragie artérielle n’est observée. Une autre méthode consiste à utiliser une seule ligature et une transsection dans le sens aval. Voir la documentation d’accompagnement pour savoir quand cette méthode est préférée.

Rétablissez l’orientation initiale du muscle, repositionnez le tissu adipeux et le fascia déplacés et fermez-le avec une suture non résorbable. Enfin, placez la souris dans une cage de récupération chauffée sous observation et analgésique pour la microscopie intra vitale spino trapèze. La souris est d’abord anesthésiée avec du fluor dans une chambre d’induction, puis connectée à un flux continu de fluor à travers un cône nasal.

Insérez la sonde de température rectale et réglez le contrôleur thermique à 35 degrés C Les instruments à préparer à l’avance comprennent des ciseaux à iris, des pinces standard, des ciseaux à ressort et un écouvillon PBS humidifié. Faites une incision cutanée à l’extrémité du dorlotage du trapèze rachidien à l’aide de ciseaux à iris et d’une pince brevetée standard. Étendez l’incision crânienne au coussinet adipeux, créant une incision en fer à cheval et couvrez le rabat de peau avec un emballage plastique pour éviter la dessiccation contondante, disséquez le tissu conjonctif sous-cutané avec des pinces fines pour maximiser la visibilité.

Placez les électrodes de stimulation, en les gardant aussi rapprochées que possible pour minimiser la taille du champ de courant, positionnez-les à l’extrémité du dorlotement du muscle exposé juste latéralement à la colonne vertébrale. Ancrez avec de l’argile. Effectuez un test de stimulation pour confirmer le placement de l’électrode à l’aide d’un système d’acquisition de données de laboratoire d’alimentation, d’un stimulus, d’un isolateur et d’un logiciel de graphique de laboratoire réglés sur des ondes carrées d’une durée de 200 microsecondes, d’une amplitude de deux milliampères et délivrées à un hertz.

Couvrez à nouveau le muscle exposé d’une pellicule plastique. Pour éviter la dessiccation, prévoyez 30 minutes par diamètre de récipient pour équilibrer, puis capturez votre image ou votre vidéo. Placez le microscope intravital sur le muscle trapèze de la colonne vertébrale pour observer l’architecture vasculaire.

Si vous utilisez une lentille d’immersion, placez une goutte de PBS entre l’objectif et la pellicule plastique en commençant au-dessus de l’artère principale, qui est le plus grand vaisseau visible. Manipulez la platine dans le plan XY pour localiser le vaisseau qui vous intéresse. Stimulez le muscle avec des ondes carrées de la durée et de l’amplitude précédentes, mais délivrées à huit hertz et pendant 90 secondes immédiatement après la stimulation.

Imagez le récipient et continuez à le faire toutes les minutes jusqu’à ce qu’il ait retrouvé son diamètre au repos. L’analyse des données peut être effectuée en temps réel avec des pieds à coulisse vidéo ou hors ligne avec un logiciel d’analyse d’images. Répétez la procédure depuis l’incision initiale jusqu’à l’imagerie à l’aide du muscle controlatéral.

Une fois terminé. Euthanasier la souris selon le protocole standard A CUC pour le prélèvement de tissu de spina trapèze. Nous aurons besoin de ciseaux à iris, de pinces standard et de ciseaux à ressort.

Anesthésie la souris comme indiqué précédemment. Commencez par faire une incision de quelques millimètres crânienne à l’omoplate de la souris. Élargissez l’incision latéralement, puis allongez-la des deux côtés.

L’objectif est d’exposer le muscle trapèze de la colonne vertébrale, qui s’étend de T trois à L quatre après avoir fait l’incision. La peau peut être séparée du dos par une traction douce ou une coupe soigneuse du tissu conjonctif, le maintenant en place, super fusionné avec une solution saline pour prévenir la dessiccation et faciliter la manipulation des tissus. Utilisez la dissection émoussée pour enlever le tissu adipeux dorsal et exposer le muscle trapèze de la colonne vertébrale.

De même, retirez le tissu adipeux ventral. Après avoir réfléchi le muscle, le trapèze de la colonne vertébrale droite de l’animal est identifié ici. Ensuite, retirez autant de fascia sus-jacent que possible.

Cette partie de la procédure peut être fastidieuse, mais tout aussi importante afin d’éviter les artefacts lors de la microscopie. Une fois le tissu conjonctif retiré, excisez le tissu comme indiqué en coupant d’abord le bord latéral à peu près parallèlement au dos et en le déplaçant dans une direction crânienne à dorloter. Ensuite, coupez transversalement sur l’étendue la plus crânienne et enfin le long du bord médial, le plus proche de la colonne vertébrale pour recueillir le muscle controlatéral.

Suivez la même procédure. D’abord en enlevant le tissu adipeux dorsal, puis le tissu adipeux ventral, et enfin le fascia suscitant lors de la coupe. Vous trouverez peut-être plus facile de changer d’instrument pour la main la moins dominante.

Les tissus excisés peuvent être fixés et lavés en suivant la procédure décrite ici après l’euthanasie de l’animal. Selon un protocole A CUC amélioré. Voir la littérature d’accompagnement pour plus de détails sur une procédure alternative de fixation par perfusion.

Ici, nous montrons un schéma étiqueté du muscle spini trapèze réfléchi. Après avoir exposé l’artère d’alimentation, les lettres indiquent les régions comme précédemment. Gardez à l’esprit que chaque animal a une anatomie unique.

Cette souris particulière est considérée comme plutôt difficile pour cette procédure en raison de la proximité des deux autres vaisseaux. Un animal plus typique est montré ici. Notez la séparation relativement importante de l’artère indiquée de la veine para juste au-dessus et l’absence d’un troisième vaisseau.

Ici, nous voyons un montage au microscope confocal d’un muscle trapèze spinal droit ligaturé qui a été coloré pour le muscle lisse alpha actine. Dans des conditions ischémiques, il y a eu un remodelage dans la région indiquée en aval du site de ligature. Ces changements peuvent être quantifiés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, que nous utilisons ici pour mesurer la tortuosité en tant que rapport entre la longueur du trajet de l’artère et la distance centrale.

Certaines données d’échantillon présentées ici indiquent un résultat statistiquement significatif pour une augmentation de la tortuosité vasculaire par rapport au contrôle controlatéral. Nous démontrons également des mesures fonctionnelles de la réactivité des vaisseaux à l’aide du logiciel médical MicroVision a VA sur un microscope à fond noir hors ligne. Les diamètres des vaisseaux vidéo sont mesurés avant et après la stimulation, puis comparés les uns aux autres en pourcentage de changement.

Les données d’échantillon présentées ici indiquent un résultat statistiquement significatif pour l’augmentation du diamètre des vaisseaux pour les artères terminales après stimulation. Bonjour, je m’appelle Alexander Ell et je suis l’étudiant de premier cycle du laboratoire de Pierce Scholer qui a monté cette vidéo. Ensemble, nous venons de vous montrer comment créer un modèle d’ischémie musculaire squelettique dans le muscle trapèze de spin miroir.

Ensuite, nous avons démontré une procédure de vasodilatation fonctionnelle adaptée à la mesure de la réactivité vasculaire et au contrôle du flux sanguin. Enfin, nous avons montré comment exciser le muscle pour se préparer à une fixation adaptée à la coloration immunochimique et à l’imagerie. Au nom de mes collaborateurs à San Luis Obispo et ici à Charlottesville, je tiens à vous remercier de m’avoir regardé et je vous souhaite au revoir et bonne chance dans vos efforts de recherche.