La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

L'objectif général de cette procédure est de structurer directement les cellules dans des environnements entièrement aqueux. Cela est réalisé en dissolvant d'abord des polymères à longue chaîne, tels que le polyéthylène glycol et la dextrine, dans des tubes séparés contenant du milieu de culture cellulaire. La deuxième étape consiste à trypsiner, récolter le culot et resuspendre les cellules à la densité d'ensemencement souhaitée dans l'une ou l'autre des solutions polymériques.

Ensuite, les solutions polymériques sont déposées sur une boîte de culture cellulaire. L'incompatibilité des deux polymères permet un façonnage spatial des deux liquides entièrement aqueux. Des cellules peuvent être incluses dans l'une ou l'autre solution polymérique, ou dans les deux solutions polymériques, afin de produire une variété de motifs.

La dernière étape consiste à éliminer les solutions polymériques une fois que les cellules ont été laissées à adhérer pendant quatre heures ou plus, puis à les remplacer par un milieu de culture. Enfin, une microscopie en champ clair ou en fluorescence peut être utilisée pour confirmer le dessin des cellules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'impression par microcontact, est que les cellules sont dessinées dans un environnement entièrement aqueux à l'aide d'outils simples comme des motifs de microcanaux.

Cette méthode peut être utilisée en ingénierie tissulaire pour évaluer la migration cellulaire et étudier la signalisation paracrine et autocrine entre cellules, illustrant que les procédures seront réalisées par Abraham, un étudiant de premier cycle, et Joshua White, un étudiant diplômé du laboratoire Takayama. Commencez par dissoudre les deux polymères différents dans le milieu spécifique qui sera utilisé pour vos expériences. Dans cet exemple, le polyéthylène glycol, également connu sous le nom de PEG, et la dextrine, également appelée Dex, ont des masses moléculaires respectives de 35 kilodaltons et 500 kilodaltons.

Préparez 16 échantillons de deux millilitres dans des tubes coniques de 15 millilitres, chacun contenant des concentrations différentes de PEG et de dex, similaires au tableau présenté ici. Pour ce faire, pesez les quantités appropriées de PEG et de dex selon le tableau et mélangez-les dans le milieu en les agitant doucement jusqu'à ce que les deux polymères soient complètement dissous. Cela peut prendre plusieurs heures après que les polymères soient entièrement dissous.

La solution doit être trouble. Confirmer la séparation des phases en centrifugeant les échantillons à 1000 G pendant cinq minutes. La phase inférieure, plus dense, sera riche en dextrane.

La phase supérieure sera riche en PEG. Ensuite, ajoutez lentement 0,1 millilitre de milieu supplémentaire dans les tubes et vortexez les échantillons pendant 20 secondes. Puis, centrifugez à nouveau les échantillons pour vérifier la séparation des phases.

La solution est claire après l'ajout de volumes supplémentaires de milieu ; répétez cette étape en ajoutant encore 0,1 millilitre de milieu, en mélangeant et en centrifugeant les échantillons jusqu'à ce que la solution devienne claire et cesse de se séparer en phases. Cela indique que le seuil du point critique a été atteint pour ce mélange spécifique. Notez le poids final de chaque tube à ce stade.

Enfin, déterminez le pourcentage pondéral des deux polymères au point de séparation de phase. Tracez la courbe nodale bin, en portant le pourcentage pondéral des pics sur l'axe des ordonnées et le pourcentage pondéral des plateaux sur l'axe des abscisses. Cette courbe représente les concentrations seuils de séparation de phase entre le PEG et le dex dans ce milieu.

Pour commencer le façonnage par exclusion des cellules, préparez des solutions séparées de PEG et de dextran à deux fois leurs valeurs de point critique déterminées par le seuil binodal. Pour ces expériences, 5 % en poids de PEG et 12,8 % en poids de dextran sont ajoutés au DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % d'antibiotiques. Les tubes sont placés sur un agitateur rotatif afin de permettre une dissolution complète.

Ensuite, récoltez les cellules destinées à être utilisées pour le motif d'exclusion dans cette expérience ; les cellules HeLa à 80 % de confluence sont traitées à la trypsine 0,5 % pendant trois minutes. Une fois récoltées, comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre, puis centrifugez et resuspendez les cellules à une concentration de 375 000 cellules par millilitre dans un milieu contenant 5 % de PEG ajouté. Cette concentration permettra d’obtenir des échantillons qui deviendront confluentes après une journée de culture.

Ensuite, à l’aide d’une micropipette, déposez des gouttelettes de 0,5 microlitre de la solution de 12,8 % de deck sur une plaque 96 puits sèche pour un motif d’exclusion. Les gouttelettes de dex peuvent être laissées à sécher dans des conditions stériles pour une utilisation ultérieure. Puis, ajoutez lentement 200 microlitres de suspension de cellules Hela PEG dans le puits.

Pour recouvrir les gouttelettes D, il est important de commencer par recouvrir la gouttelette D avec la solution de PEG avant de remplir les zones environnantes, car cela empêche la perturbation de la gouttelette lorsque la solution s'étend sur le puits. Une fois que tous les puits ont été dessinés et ensemencés avec soin, placer la plaque de culture cellulaire dans un incubateur humidifié. Veiller à ce que la boîte ne soit pas inclinée lors de la manipulation et qu'elle soit posée sur une étagère d'incubateur de niveau afin d'éviter de perturber les motifs après que les cellules ont eu 12 heures pour s'adhérer.

Éliminer la solution de PEG et laver trois fois avec 200 microlitres de milieu de culture afin d'éliminer tout polymère résiduel. Ensuite, ajouter 200 microlitres de milieu de culture frais et replacer la plaque dans l'incubateur. Surveiller périodiquement les cultures afin d'observer la prolifération cellulaire et la migration vers les zones d'exclusion pour commencer le dessin des îlots.

Préparez des solutions de 5 % poids par poids de PEG et de 12,8 % poids par poids de decks dans le milieu de culture cellulaire. Récoltez également les cellules HeLa destinées à la création de motifs d'îlots et déterminez à nouveau le nombre total de cellules disponibles à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, centrifugez pour former un culot et resuspendez.

Faire centrifuger les cellules à une concentration de 5 millions de cellules par millilitre dans le milieu. En présence de 12,8 % de dex, une concentration plus élevée de cellules peut être nécessaire pour atteindre la confluence en 24 heures si les cellules n'adhèrent pas aussi bien que les cellules HeLa. Ensuite, prélever à la pipette 200 microlitres de solution de PEG et les ajouter dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.

Ensuite, ajoutez lentement une goutte de 0,5 µL de suspension de cellules d'ensemencement dans chaque puits contenant la solution de PEG. Les gouttes couleront au fond et entreront en contact avec la surface de culture. Puis transférez délicatement la plaque dans l'incubateur, en prenant soin de ne pas incliner la boîte à aucun moment, ce qui pourrait perturber les motifs après 12 heures.

Éliminer la solution de PEG et laver trois fois avec 200 microlitres de milieu de culture. Ensuite, ajouter 200 microlitres de milieu de culture frais et replacer la plaque dans l’incubateur. Surveiller périodiquement les cultures afin d’observer la prolifération cellulaire et la migration à partir des îlots.

Commencez la mise en place du co-culture en préparant des solutions de PEG à 5 % en poids et de decks à 12,8 % en poids dans du DMEM contenant 10 % de FPS et 1 % d'antibiotiques. Parallèlement, faites croître les deux types cellulaires destinés à être utilisés dans le modèle d'exclusion et d'îlots afin qu'ils soient proches de la confluence. Ici, nous utiliserons des îlots d'hépatocytes Hep G2C3 entourés de fibroblastes NIH 3T3. Ensuite, récoltez les deux types cellulaires et comptez-les séparément à l’aide d’un hémocytomètre.

Ces deux types cellulaires peuvent être facilement distingués en utilisant la microscopie en champ clair. Le culot des hépatocytes Hep G2 C3A est utilisé pour le dessin d'îlots et la resuspension dans 12,8 % de dextrane. Ensuite, le culot de fibroblastes est préparé pour l'exclusion, le dessin de motifs et la resuspension dans 5 % de PEG. Puis, déposez des gouttelettes de 0,5 microlitre de suspension de cellules D dans une plaque 96 puits sèche et recouvrez délicatement les gouttelettes de dextrane avec 200 microlitres de suspension de cellules PEG.

Ensuite, transférez la plaque dans un incubateur après 12 heures. Éliminez le milieu et rincez trois fois avec 200 microlitres de milieu de culture. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de culture frais et remettez la plaque dans l'incubateur.

Enfin, l'intensité de la coloration de l'albumine dans les co-cultures peut être utilisée pour évaluer les effets bénéfiques de la co-culture avec les fibroblastes. Les concentrations de polymères nécessaires pour former divers systèmes aqueux diphasiques sont décrites ici par les courbes binodales : au-dessus de la courbe binodale, le système forme deux phases, tandis qu'il est monophasique en dessous de cette courbe.

La solution est un système biphase monophasique transparent d'au moins deux fois. Les concentrations de celles situées sur la courbe binaire sont suffisantes pour être utilisées dans les systèmes biphases aqueux décrits dans cette vidéo. Le premier exemple de leur utilisation est un motif d'exclusion où de petites zones peuvent être laissées vides de cellules.

Le motif en îlots crée l'effet exactement opposé au motif d'exclusion, où de petites régions peuvent être occupées par des cellules. La combinaison de ces deux procédés peut être utilisée pour former une co-culture unique, dans laquelle un îlot de cellules est entouré par un autre type cellulaire, comme illustré ici. Les cellules HeLa cultivées à l'aide du motif d'exclusion proliféreront et migreront pour remplir l'espace vide.

Au fil du temps, la taille du vide peut être surveillée afin de fournir des informations précieuses sur la migration et la croissance cellulaires dans différentes conditions. Le traçage de motifs d'îlots, en revanche, peut être utilisé pour mesurer l'expansion cellulaire.

La combinaison de motifs d'îlots et d'exclusion produit des régions bien définies de co-culture. On observe ici des îlots d'hépatocytes entourés de cellules de fibroblastes. Ces colonies ont été trouvées capables de maintenir leur organisation pendant au moins quatre jours en culture.

À l’aide de ce système, plusieurs îlots de cellules peuvent être cultivés sur la même plaque. Lorsqu’ils sont cultivés seuls sous forme d’îlots, les hépatocytes produisent légèrement moins d’albumine que lorsqu’ils sont cultivés en co-culture avec des fibroblastes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des concentrations de polymères deux fois supérieures à la concentration critique afin de former des solutions biphasiques.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de formuler un système aqueux diphasique et de l'utiliser pour structurer des cellules et définir des géométries.