Name: La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Apprenez la co-culture cellulaire par systèmes biphasiques aqueux utilisant le polyéthylène glycol et le dextrane. Cette méthode permet l'organisation spatiale rapide des cellules pour l'ingénierie tissulaire.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation Coulter, Beyster Fondation, l&#39;opportunité recherche de premier cycle (PIRPC) programme d&#39;été pour ATA et la National Science Foundation des étudiants diplômés de la bourse de recherche (subvention no 0718128 DGE; Identification:. 2010101926) pour JBW.

1. Caractérisation Phase System: seuils déterminant pour la séparation de phase <ol><li> Préparer des solutions contenant du PEG et DEX dans le tampon désiré ou milieu de culture cellulaire comme le montre la figure 1 (points violets) dans 15 ml ou 50 ml tubes coniques. Ci-après, le PEG et DEX se référeront à 35 kDa PEG et 500 kDa DEX; cependant, les concentrations critiques vont changer en fonction des deux polymères utilisés. Noter la masse de PEG et de DEX dans chaque solution. Forte concentration des solutions de polymères peut prendre plusieurs heures à se dissoudre. Vortex peuvent être utilisées pour des solutions sans sérum. Pour les médias contenant des protéines ou du sérum, placer les tubes sur une scène à bascule jusqu&#39;à ce que les deux polymères sont complètement dissous. Noter le poids des médias utilisés pour dissoudre les polymères et prendre note des concentrations initiales. </li><li> Une fois que les polymères sont complètement dissous, les solutions doivent apparaître nuageux. C&#39;est la première indication que la séparation de phase a eu lieu. Pour confirmer cela, permettre à l&#39;des solutions de polymère au repos dans une position verticale à la température ambiante pendant 20 min. Centrifugation à 1000 xg peut être utilisé pour accélérer le processus de séparation de phase. La phase inférieure dense sera DEX-riche et la phase supérieure sera PEG-riche. </li><li> Ajouter lentement tampon supplémentaire ou un support pour les tubes. Petits incréments doivent être utilisés de manière à ne pas dépasser le point de séparation des phases. </li><li> Lorsque la solution devient limpide et non plus en phase sépare après centrifugation, le seuil de séparation de phase a été atteint. Enregistrer le poids final du tube. </li><li> En utilisant les pondérations précédentes enregistrées dans les polymères, en même temps que le poids final après ajout de médias, déterminer le% en poids / poids de chacun des deux polymères au cours de laquelle la séparation de phase ne se produit plus. </li><li> Tracer ces valeurs en% en poids / poids de PEG sur l&#39;axe des y et% en poids / poids DEX sur l&#39;axe des abscisses. Cette courbe, appelée courbe binodale, peut être utilisé pour déterminer la concentration de seuil de séparation de phase pour différentes concentrations dModules de PEG / DEX dans un milieu de culture cellulaire spécifique. </li></ol> 2. Configuration 1: Modélisation Exclusion (96 puits Format de plaque) <ol><li> Préparer des solutions séparées de 5,0% en poids / poids de PEG et de 12,8% en poids / poids DEX en milieu de culture cellulaire. Utiliser des solutions de l&#39;ATPS au moins deux fois le point critique pour s&#39;assurer que l&#39;ATPS reste après que les polymères s&#39;équilibrer par rapport à l&#39;autre. Il ya une petite quantité de flux de DEX dans la phase riche en PEG et vice-versa, par conséquent, travailler trop près de la concentration critique peut entraîner la perte du système de phase en baisse des concentrations inférieures à point critique. De même, le transfert de la boîte de culture cellulaire à un incubateur à humidité et à température contrôlée peut modifier les propriétés de deux phases et de faire les deux solutions miscibles. Note: Certaines cellules peuvent être plus efficaces avec les formulations de l&#39;ATPS autres. Formulations acceptables peuvent être choisis en fonction des courbes binodale déterminées à partir de la partie 1. </li><li> Récolter les cellules à utiliser pour l&#39;exclusion patterning. Déterminer le nombre total / concentration de cellules disponibles. En option: marquer les cellules avec CellTracker ou d&#39;autres non-cytotoxiques étiquettes pour la microscopie de fluorescence. </li><li> Sédimenter les cellules et resuspendre le culot dans un volume approprié de 5,0% PEG pour atteindre le nombre désiré de cellules d&#39;exclusion. Par exemple, un puits d&#39;une plaque de 96 puits nécessite 37.500 cellules de fibroblastes d&#39;être remis en suspension dans 200 ul de PEG pour produire confluence le jour suivant. L&#39;échelle de ces chiffres en fonction de d&#39;autres types cellulaires et tailles substrat de culture. </li><li> Utiliser une micropipette, distribuer 0,5 pi de gouttelettes DEX sur un substrat de culture cellulaire sec. Gouttelettes plus grand volume de production plus grandes zones d&#39;exclusion. Gouttelettes dont la taille varie de 0,1 à 1 ul sont recommandés pour micromodelage exclusion. En option: DEX gouttelettes peuvent être déposées 24 heures à l&#39;avance et laisse se déshydrater à la température ambiante. Cela peut produire des modèles plus propres. </li><li> Distribuer 200 l de suspension cellulaire PEG dans til en bonne santé pour couvrir les gouttelettes DEX. </li><li> Placer dans un incubateur humidifié pendant 12 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Assurez-vous que le plat n&#39;est pas incliné lors de la manipulation et qu&#39;il est placé sur une étagère niveau incubateur pour éviter de perturber les habitudes. </li><li> Retirer la solution de PEG et laver trois fois avec 200 ul de milieu de culture. </li><li> Ajouter milieu de culture frais et revenir à l&#39;incubateur. </li><li> Surveiller les cultures périodiquement pour observer le mouvement des cellules dans la zone d&#39;exclusion. </li></ol> 3. Configuration 2: Modélisation Island (Format de plaque de 96 puits) <ol><li> Préparer des solutions de 5,0% en poids / poids de PEG et de 12,8% en poids / poids DEX en milieu de culture cellulaire, comme ci-dessus. </li><li> Récolter les cellules à utiliser pour des motifs île. Déterminer le nombre total / concentration de cellules disponibles. </li><li> Granulés et remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de 12,8% DEX pour obtenir la concentration désirée de cellules pour la modélisation île. Les concentrations de 5000 CElls / ul ou moins sont recommandées pour les types de cellules fortement adhérentes. Pour les cellules qui ont de la difficulté de fixer ou de cellules qui adhèrent faiblement, les concentrations de jusqu&#39;à 10.000 cellules / ul peut être envisagée. </li><li> En travaillant rapidement pour éviter le dessèchement, Pipeter 0,5 pi de gouttelettes DEX sur un substrat de culture cellulaire sec, tel que décrit ci-dessus. Ne pas laisser sécher les gouttelettes. En option: 200 pi de solution de PEG peut être ajouté à la bien à l&#39;avance. DEX gouttelettes peuvent alors être déposés dans la solution de PEG où ils se déposent au fond et contact avec la surface de culture. Cela peut produire des modèles plus propres îles. </li><li> Couvrir les gouttelettes DEX avec 200 ul de PEG. </li><li> Placer dans un incubateur humidifié pendant 12 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Assurez-vous que le plat n&#39;est pas incliné lors de la manipulation et qu&#39;il est placé sur une étagère niveau incubateur pour éviter de perturber les habitudes. </li><li> Retirer la solution de PEG et laver trois fois avec 200 ul de milieu de culture. </li><li> Ajouter culture fraîchemoyen et retour à l&#39;incubateur. </li><li> Surveiller les cultures périodiquement pour observer le mouvement vers l&#39;extérieur des cellules et la prolifération des îles. </li></ol> 4. Configuration 3: Exclusion des co-cultures (format plaque de 96 puits) <ol><li> Préparer des solutions de 5,0% en poids / poids de PEG et de 12,8% en poids / poids DEX en milieu de culture cellulaire, comme ci-dessus. </li><li> Récolter les cellules à utiliser pour l&#39;exclusion et de motifs île. Déterminer le nombre total / concentration de cellules disponibles pour chaque type de cellule. En option: Certaines paires de cellules peuvent afficher des indices de prolifération radicalement différents. Pour éviter que les cellules exclus de la surpopulation des cellules insulaires configuration (en particulier pour les cultures à long terme), le traitement des cellules utilisées pour l&#39;exclusion de la mitomycine C pendant 2 heures ou les irradier avant la récolte. Cela permettra d&#39;éviter la prolifération. Colorants fluorescents CellTracker peut être utilisé pour distinguer les deux populations de cellules si nécessaire. </li><li> Sédimenter les cellules et remettre en suspension le culot de exclusion de motifs dans un volume approprié de PEG 5,0% pour atteindre le nombre désiré de cellules, comme ci-dessus. Reprendre le culot pour la modélisation île dans un volume approprié de 12,8% DEX pour obtenir la concentration désirée de cellules, comme ci-dessus. </li><li> Utiliser une micropipette, distribuer 0,5 gouttelettes ul de suspension cellulaire DEX sur un substrat de culture cellulaire sec. Ne pas laisser sécher les gouttelettes. </li><li> Couvrir les gouttelettes DEX avec 200 pi de suspension cellulaire PEG. </li><li> Placer dans un incubateur humidifié pendant 12 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Assurez-vous que le plat n&#39;est pas incliné lors de la manipulation et qu&#39;il est placé sur une étagère niveau incubateur pour éviter de perturber les habitudes. </li><li> Retirer la solution de PEG et laver trois fois dans 200 pi de milieu de culture. </li><li> Ajouter milieu de culture frais et revenir à l&#39;incubateur. </li><li> Surveiller les co-cultures d&#39;observer l&#39;interaction entre les populations de cellules. En option: Les contrôles peuvent être préparés en effectuant l&#39;exclusion ou de la modélisation île individually, par co-culture des cellules qui n&#39;interagissent pas ou en bloquant les voies d&#39;intérêt dans une ou les deux populations de cellules avant ou après formation de motif. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

La méthode de l&#39;ATPS micromodelage cellule nécessite une expertise très peu au-delà de la maîtrise des techniques de culture cellulaire et peut être rapidement maîtrisé. Les avantages de cette approche est qu&#39;elle est peu coûteuse, rapide et compatible avec une variété de types de cellules et les formats de la culture. Pour ces raisons, notre protocole devrait être facilement adoptée par les sciences de la vie, en particulier ceux qui étudient la prolifération cellulaire, la migration et la chimiotaxie, et l&#39...

Aqueuses systèmes à deux phases (ATPSs) se forment lorsque des solutions de deux polymères incompatibles sont mélangés à des concentrations suffisamment élevées. Séparation de phase est influencée par divers facteurs, dont la masse moléculaire et la polarité des polymères, la température de la solution, le pH et la composition ionique de la solution aqueuse de solvant 1, 2. Le point où les deux solutions de polymère séparés est déterminée par les propriétés physico-chimiques du système de phase choisi, mais se produit généralement à des concentrations faibles de polymère (moins de 20% en poids / poids) sous des conditions non dénaturantes, permettant ATPSs à être utilisé pour la biotechnologie applications 3-9. De loin, l&#39;ATPS plus étudiés est le polyéthylène glycol (PEG) / dextran (DEX) du système. Les ATPS formés par ces polymères biocompatibles et peu coûteux a été décrit pour la purification de biomolécules au moyen de partitionnement moléculaire 2, 10. Partitionnementse produit lorsque les molécules ou particules supplémentaires qui ne contribuent pas au système de phase sont mélangés avec du PEG et DEX. Sur la base de leurs affinités relatives pour chaque DEX ou PEG, les molécules ou particules seront de préférence résider dans une des deux phases ou à l&#39;interface. Une autre propriété de l&#39;ATPS PEG / DEX est l&#39;existence de la tension interfaciale entre les phases polymères deux. ATPSs formés par PEG et DEX affichent généralement des tensions interfaciales qui sont beaucoup plus bas que les autres liquide-liquide à deux phases des systèmes tels que le pétrole et l&#39;eau, mais les forces de tension interfaciale encore exercer des effets sur de petites particules telles que les virus, les cellules et les agrégats de protéines 2 , 11-13. Enfin, depuis le plus haut poids moléculaire du PEG et DEX séparé à de faibles concentrations (moins de 5% en poids / poids de polymères de haut poids moléculaire variétés) en présence de concentrations physiologiques de sels, il ya peu ou pas d&#39;effets délétères sur les cellules de mammifères incorporé au sein de ces systèmes14-16. Récemment, les propriétés interfaciales et des effets de partitionnement de ATPSs ont été appliquées par notre laboratoire pour 14 patron de cellules, 16-20. Cela a été accompli par micromodelage une solution plus dense DEX sur des substrats de culture cellulaire en présence de PEG. Lorsque les cellules sont incorporées dans la phase PEG, ils sont exclus de pénétrer dans les gouttelettes de DEX en raison de PEG / DEX tension interfaciale 20. Lorsque les cellules sont en motif dans la phase DEX, ils sont conservés à la surface du substrat de culture cellulaire par tension interfaciale et de cloisonnement 16, 17, 19. Contrairement à d&#39;autres méthodes pour la modélisation cellulaire, patron de cellules ATPS est facile à apprendre et ne nécessite que des connaissances rudimentaires sur les polymères eux-mêmes, et la possibilité d&#39;effectuer une culture cellulaire et d&#39;utiliser une micropipette. D&#39;autres méthodes pour la modélisation cellulaire impliquent souvent un équipement spécialisé et de formation qui ne sont pas facilement convertis en ee sciences de la vie. Par exemple, certaines méthodes (microcontact impression ou impression jet d&#39;encre), les cellules motif indirectement par l&#39;application de modèles de biomolécules d&#39;adhésion cellulaire à un substrat de culture que par la suite servir de sites de fixation 21 cellules, 22. Bien que les approches indirectes sont utiles pour certains types de cellules, elles exigent un haut degré de compétences de l&#39;utilisateur et de l&#39;équipement spécialisé pour la fabrication de l&#39;outil de structuration, et peuvent manquer de spécificité en fonction du type de cellule / biomolécules modèle particulier. Alternativement, les cellules peuvent être déposés auprès de la spécificité modèle haut au moyen d&#39;approches de structuration directs qui comprennent flux laminaire motifs, pochoirs et 23-26 impression jet d&#39;encre. Cependant, ces techniques nécessitent en outre l&#39;expertise des utilisateurs et des équipements spécialisés, et peuvent endommager les cellules au cours du processus d&#39;impression. Bien que ces approches produisent généralement des modèles précis de cellules, de patron de cellules pour être un outil utile dans les sciences du vivant, il doit être rentable unee simple à mettre en œuvre. Nous rapportons ici un protocole détaillé pour la production des cultures de cellules en utilisant les motifs ATPSs décrits dans nos applications précédemment publiées. Utilisation Micropipettes seulement, les utilisateurs peuvent générer des zones d&#39;exclusion de cellules ou des îles de cellules pour des essais de migration. Ce résultat est obtenu au moyen de PEG / DEX tension interfaciale qui conserve soit des cellules dans la phase DEX ou exclut les cellules déposées dans la phase PEG de DEX. En combinant ces deux techniques de dessin fondamentales, il est possible de générer rapidement des co-cultures de cellules comme les fibroblastes de cellules de foie co-cultures. Méthodes de structuration, les paramètres de l&#39;ATPS et les résultats attendus sont décrits en détail.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Fabricant </td></tr><tr><td> Dextran 500.000 kDa </td><td> Pharmacosmos, Danemark </td></tr><tr><td> Polyéthylène Glycol 35.000 kDa </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td></tr><tr><td> Hela </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> HepG2 C3A </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> NIH 3T3 </td><td> ATCC, Manassas, VA </td></tr><tr><td> Tracker cellule </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco, Carlsbad, CA </td></tr></tbody></table>

la co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse modélisation des systèmes biphasiques

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Technologies patron de cellules qui sont rapides, faciles à utiliser et abordables seront nécessaires pour le développement futur des hauts dosages de cellules débit, plates-formes pour l&#39;étude des interactions cellule-cellule et des systèmes de l&#39;ingénierie tissulaire. Ce protocole détaillé décrit une méthode pour générer des co-cultures de cellules en utilisant des solutions biocompatibles de dextrane (DEX) et de polyéthylène glycol (PEG) que phase séparée lorsqu&#39;ils sont combinés au-dessus des seuils de concentration. Cellules peut être configurée en une variété de configurations en utilisant ce procédé. Un motif d&#39;exclusion de cellules peut être réalisée par des gouttelettes d&#39;impression DEX sur un substrat et à les recouvrir avec une solution de PEG contenant des cellules. La tension interfaciale entre la solution formée polymère provoque deux cellules de tomber à l&#39;extérieur de la gouttelette DEX et former un dégagement circulaire qui peut être utilisé pour les essais de migration. Îlots de cellules peut être modelée par la distribution d&#39;une phase riche en cellules DEX dans une solution de PEG ou en recouvrant le DEXde gouttelettes avec une solution de PEG. Co-cultures peuvent être formées directement par la combinaison d&#39;exclusion de cellules avec DEX île de motifs. Ces méthodes sont compatibles avec une variété d&#39;approches de manipulation des liquides, y compris micropipetage manuel, et peut être utilisé avec n&#39;importe quel type de cellules adhérentes.

Pour sélectionner une combinaison appropriée de PEG et de DEX pour la modélisation cellulaire, il est important de déterminer la courbe binodale. Cette courbe délimite les points au niveau desquels peuvent se former une ATPS et peut varier d&#39;un ensemble donné de polymères sur la base de la température, le pH et la teneur ionique. Pour la culture de cellules qui nécessitent formulations de milieu personnalisés, il peut être nécessaire de déterminer expérimentalement la courbe binodale. Ceci est accompli en générant u...

Aqueuses systèmes biphasiques ont été utilisés pour les populations de motif simultanément de multiples cellules. Cette méthode est simple et rapide pour un patron de cellules tire parti de la séparation de phases de solutions aqueuses de glycol de polyéthylène et de dextrane et la tension interfaciale qui existe entre les deux solutions de polymères.

La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

L'objectif général de cette procédure est de structurer directement les cellules dans des environnements entièrement aqueux. Cela est réalisé en dissolvant d'abord des polymères à longue chaîne, tels que le polyéthylène glycol et la dextrine, dans des tubes séparés contenant du milieu de culture cellulaire. La deuxième étape consiste à trypsiner, récolter le culot et resuspendre les cellules à la densité d'ensemencement souhaitée dans l'une ou l'autre des solutions polymériques.Ensuite, les solutions polymériques sont déposées sur une boîte de culture cellulaire. L'incompatibilité des deux polymères permet un façonnage spatial des deux liquides entièrement aqueux. Des cellules peuvent être incluses dans l'une ou l'autre solution polymérique, ou dans les deux solutions polymériques, afin de produire une variété de motifs.La dernière étape consiste à éliminer les solutions polymériques une fois que les cellules ont été laissées à adhérer pendant quatre heures ou plus, puis à les remplacer par un milieu de culture. Enfin, une microscopie en champ clair ou en fluorescence peut être utilisée pour confirmer le dessin des cellules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Un protocole pour l’impression robotisée de sphéroïdes de cellules cancéreuses dans un format de plaque à 96 puits à haut débit à l’aide d’un système aqueux biphasé est présenté.

Production robotique de Cancer Cell Sphéroïdes avec un système aqueux à deux phases pour le dépistage des drogues

Nous décrivons un protocole pour modifier l’affinité cellulaire d’une surface d’échafaudage en milieu aqueux. La méthode tire parti de la photocatalyse au dioxyde de titane pour décomposer le film organique dans la région photo-irradiée. Nous montrons qu’il peut être utilisé pour créer des microdomaines de protéines d’échafaudage, à la fois ex situ et in situ.

Photopatterning protéines et des cellules dans une solution aqueuse Environnement Utilisation de TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Photocatalyse

Nous présentons un protocole pour effectuer la structuration soustractive de monocouches de cellules vivantes sur une surface. Ceci est réalisé par lyse locale et sélective des cellules adhérentes à l’aide d’une sonde microfluidique (MFP). Le lysat cellulaire extrait des régions locales peut être utilisé pour l’analyse en aval, ce qui permet des études de profilage moléculaire.

Modélisation soustractive rapide des couches de cellules vivantes avec une sonde microfluidique

Nous décrivons un processus séquentiel pour la formation médiée par la lumière et la structuration biochimique ultérieure de matrices d’hydrogel synthétiques pour des applications de culture cellulaire tridimensionnelle. La construction et la modification d’hydrogels avec la chimie photoclic cytocompatible sont démontrées. De plus, des techniques simples pour quantifier et observer les modèles et déterminer la viabilité cellulaire au sein de ces hydrogels sont présentées.

Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

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Une méthode polyvalente de patterning Les protéines et les cellules

Nous présentons ici un protocole pour les cellules micromotérinaires à résolution unicellulaire en utilisant l’adhésion programmée par l’ADN. Ce protocole utilise une plate-forme de photolithographie de paillasse pour créer des motifs d’oligonucléotides d’ADN sur une lame de verre, puis marque les membranes cellulaires avec des oligonucléotides complémentaires disponibles dans le commerce. L’hybridation des oligos entraîne une adhésion cellulaireprogrammée.

Modélisation simple, abordable et modulaire des cellules à l’aide de l’ADN

Traditionnellement, la culture cellulaire est réalisée sur des substrats planaires qui imitent mal l’environnement naturel des cellules in vivo. Nous décrivons ici une méthode pour produire des substrats de culture cellulaire avec des géométries courbes physiologiquement pertinentes et des protéines extracellulaires micromotifs, permettant des recherches systématiques sur la détection cellulaire de ces signaux extracellulaires.

Génération de microenvironnements cellulaires multicue par photomodèlement UV de substrats de culture cellulaire tridimensionnels

Ce protocole décrit une méthode de structuration cellulaire à haut débit sans encre, sans marquage, indépendante du substrat, basée sur l’effet Archimède magnétique.

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Le protocole présente un nouveau modèle expérimental in vitro capable de récapituler la biologie de deux types de lignées cellulaires adhérentes avec un échafaudage imprimé en trois dimensions (3D). La construction de ce modèle et les procédures opératoires, de la préparation et de la culture cellulaires à l’analyse et à l’évaluation, sont décrites.

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Une technique de plasma polyvalent lithographie a été développé pour générer des modèles de surface stable pour orienter l'attachement cellulaire. Cette technique peut être appliquée pour créer des réseaux cellulaires, y compris ceux qui imitent les tissus naturels et a été utilisé pour étudier plusieurs types cellulaires distincts.

Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

Apprenez la co-culture cellulaire par systèmes biphasiques aqueux utilisant le polyéthylène glycol et le dextrane. Cette méthode permet l'organisation spatiale rapide des cellules pour l'ingénierie tissulaire.

La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

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