La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

L’objectif global de cette procédure est de modeler directement les cellules dans des environnements entièrement aqueux. Pour ce faire, il suffit de dissoudre d’abord les polymères à longue chaîne, tels que le polyéthylène glycol et la dextrine, dans des tubes séparés contenant du milieu de culture cellulaire. La deuxième étape consiste à essayer d’aniser, de récolter, de granuler et de remettre en suspension les cellules à la densité d’ensemencement souhaitée dans l’une ou les deux solutions polymères.

Ensuite, les solutions polymères sont distribuées dans une boîte de culture cellulaire. L’incompatibilité des deux polymères permet de structurer spatialement les deux liquides entièrement aqueux. Les cellules peuvent être incluses dans l’une ou l’autre solution de polymère ou dans les deux solutions de polymère pour produire une variété de motifs.

La dernière étape consiste à retirer les solutions polymères une fois que les cellules ont été laissées adhérer pendant quatre heures ou plus et à les remplacer par un milieu de culture. En fin de compte, la microscopie à fond clair ou à fluorescence peut être utilisée pour confirmer la structuration cellulaire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’impression par micro-contact, est que les cellules sont modelées dans un environnement entièrement aqueux avec des outils simples comme les motifs de micro-tuyaux.

Cette méthode peut être utilisée pour l’ingénierie tissulaire afin d’évaluer la migration cellulaire et d’étudier la signalisation péricrine et autocrine de cellule à cellule, démontrant que les procédures seront effectuées par Abraham, un étudiant de premier cycle, et Joshua White, un étudiant diplômé du laboratoire Takayama. Commencez par dissoudre les deux polymères différents dans le milieu spécifique qui sera utilisé dans vos expériences. Dans cet exemple, le polyéthylène glycol, également connu sous le nom de PEG, et la Dextrine, également connue sous le nom de Dex, ont des poids moléculaires de 35 kilodaltons et 500 kilodaltons respectivement.

Préparez 16 échantillons de deux millilitres dans des tubes coniques de 15 millilitres, chacun avec des concentrations différentes de PEG et de dex, similaires au tableau présenté ici. Pour ce faire, pesez les quantités appropriées de PEG et de dex conformément au tableau et mélangez-les dans le média en les secouant doucement jusqu’à ce que les deux polymères soient complètement dissous. Cela peut prendre plusieurs heures après que les polymères soient complètement dissous.

La solution doit être trouble. Confirmez la séparation de phase en centrifugeant les échantillons à 1000 G pendant cinq minutes. La phase inférieure plus dense sera riche en dex.

La phase supérieure sera riche en ancrages. Ensuite, ajoutez lentement 0,1 millilitre de milieu supplémentaire dans les tubes et faites vortex les échantillons pendant 20 secondes. Ensuite, centrifugez à nouveau les échantillons pour vérifier la séparation des phases.

La solution est claire après l’ajout de volumes supplémentaires de milieu, répétez cette étape en ajoutant 0,1 millilitre de milieu supplémentaire en mélangeant et en centrifugeant les échantillons jusqu’à ce que la solution devienne claire et qu’il n’y ait plus de séparation de phase. Cela indique que le seuil du point critique a été atteint pour ce mélange spécifique. Notez le poids final de chaque tube à ce stade.

Enfin, déterminez le pourcentage poids par poids des deux polymères au point de séparation de la face. Tracez la courbe nodale du groupe, en plaçant le pourcentage de poids par pondère de poids sur l’axe des y et le pourcentage de poids par poids sur l’axe des X. Cette courbe est les concentrations seuils pour la séparation des faces du PEG et du dex dans ce milieu.

Pour commencer la structuration d’exclusion des cellules, préparez des solutions séparées de PEG et de dex à deux fois leurs valeurs de point critique déterminées par le seuil nodal bin. Pour ces expériences, des jeux de PEG de 5 % par poids et de 12,8 % de poids par poids sont ajoutés au DMEM avec 10 % de FBS et 1 % d’antibiotiques. Les tubes sont placés sur une bascule pour les laisser se dissoudre complètement.

Ensuite, récoltez les cellules à utiliser pour le motif d’exclusion pour cette expérience, les cellules hela à 80 % de confluence sont tryps inisées à l’aide de 0,5 % de tripsin pendant trois minutes. Une fois récoltées, comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre puis d’une pastille et remettez les cellules en suspension à 375 000 cellules par millilitre dans un milieu avec 5 % de PEG ajouté. Cette concentration produira des échantillons qui, une fois cultivés, deviendront confluents le lendemain.

Ensuite, à l’aide d’un micro-pipeteur, versez des gouttelettes de 0,5 microlitre de la solution à 12,8 % sur une plaque sèche à 96 puits pour le motif d’exclusion. Les gouttelettes de Dex peuvent être laissées sécher dans des conditions stériles pour une utilisation ultérieure. Ensuite, versez lentement 200 microlitres de suspension de cellules PEG hela dans le puits.

Pour couvrir les gouttelettes D, il est important de couvrir d’abord la gouttelette D avec la solution PEG avant de remplir les zones environnantes, car cela l’empêche de perturber la gouttelette lorsqu’elle se propage dans le puits. Une fois que tous les puits ont été modelés et ensemencés avec soin, placez la plaque de culture cellulaire dans un incubateur humidifié. Assurez-vous que la parabole n’est pas inclinée pendant la manipulation et qu’elle est placée sur une étagère d’incubateur de niveau pour éviter de perturber les motifs après que les cellules aient été autorisées à adhérer pendant 12 heures.

Retirez la solution de PEG et lavez-la trois fois avec 200 microlitres de milieu de culture pour éliminer les polymères résiduels. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de culture frais et remettez la plaque dans l’incubateur. Surveiller périodiquement les cultures pour observer la prolifération cellulaire et la migration dans les zones d’exclusion.

Préparer des solutions de 5 % poids par poids de PEG et de 12,8 % poids par poids dans un milieu de culture cellulaire. Récoltez également les cellules hela à utiliser pour la structuration des îlots et, encore une fois, déterminez le nombre total de cellules disponibles à l’aide d’un hémocytomètre. Prochaine pastille et resus.

Faites tourner les cellules à 5 millions de cellules par millilitre dans le milieu. En continuant à 12,8 % dex, une concentration plus élevée de cellules peut être nécessaire pour atteindre la confluence en 24 heures si les cellules n’adhèrent pas aussi bien que les cellules heela. Ensuite, pipetez 200 microlitres de solution PEG dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.

Ajoutez ensuite lentement une gouttelette de 0,5 microlitre de suspension de cellule de pont dans chaque puits contenant la solution PEG. Les gouttelettes couleront au fond et entreront en contact avec la surface de culture. Transférez ensuite soigneusement la plaque dans l’incubateur, en prenant soin de ne pas incliner le plat à aucun moment, ce qui pourrait perturber les motifs après 12 heures.

Retirez la solution de PEG et lavez-la trois fois avec 200 microlitres de milieu de culture. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de culture frais et remettez la plaque dans l’incubateur. Surveillez périodiquement les cultures pour observer la prolifération cellulaire et la migration vers l’extérieur des îles.

Commencer la co-culture en préparant des solutions de 5 % de PEG en poids et de 12,8 % en poids par poids dans du DMEM avec 10 % de FPS et 1 % d’antibiotiques permettent également de développer les deux types de cellules à utiliser dans la structure d’exclusion et d’îlot afin qu’ils soient près de la confluence. En même temps, nous utiliserons l’hépatite G deux îles d’hépatocytes C3 a avec des fibroblastes NIH trois T qui les entourent. Ensuite, récoltez les deux types de cellules et comptez-les séparément à l’aide d’un hémocytomètre.

Ces deux types de cellules peuvent être facilement distingués à l’aide de pastilles de microscopie à fond clair, l’hépatite G de deux hépatocytes C3 A pour la structuration insulaire et la réanimation se dépensent en 12,8 % de volumes. Ensuite, granulez les fibroblastes pour l’exclusion, la structuration et la suspension de la réanimation dans 5 % de cheville. Ensuite, versez des gouttelettes de 0,5 microlitre de suspension de cellules D sur une plaque sèche à 96 puits et couvrez doucement les gouttelettes de dex avec 200 microlitres de suspension de cellules de cheville.

Transférez ensuite la plaque dans un incubateur après 12 heures. Retirez le milieu et rincez trois fois avec 200 microlitres de milieu de culture. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de culture frais et remettez la plaque dans l’incubateur.

Enfin, surveiller les co-cultures L’intensité de la coloration à l’albumine peut être utilisée pour évaluer les effets bénéfiques de la co-culture de fibroblastes. Les concentrations de polymères nécessaires pour former une variété de systèmes aqueux diphasiques sont décrites ici par les courbes nodales de bin à des concentrations supérieures à la courbe nodale de bin. Le système forme deux phases sous la courbe nodale du bac.

La solution est un système monophasé biphasé transparent d’au moins deux fois. Les concentrations de ceux trouvés sur la courbe binale sont suffisantes pour une utilisation dans les systèmes aqueux diphasiques décrits dans cette vidéo. Le premier exemple de leur utilisation est un modèle d’exclusion où de petites zones peuvent être laissées vides de cellules.

Le motif d’îlot crée l’exact opposé du motif d’exclusion, où de petites régions peuvent être assises avec des cellules. La combinaison de ces deux procédures peut être utilisée pour former une co-culture unique où un îlot de cellules peut être entouré d’un autre type de cellule, comme illustré ici. Les cellules Hela plaquées à l’aide de motifs d’exclusion proliféreront et migreront pour combler le vide.

Au fil du temps. La taille du vide peut être surveillée pour fournir des informations précieuses sur la migration et la croissance cellulaires dans des conditions variables. Le motif insulaire, en revanche, peut être utilisé pour mesurer la croissance cellulaire.

La combinaison de l’île et de l’exclusion produit des régions bien définies de co-culture. On voit ici des îlots d’hépatocytes entourés de cellules fibroblastes. On a constaté que ces colonies maintiennent leur organisation pendant au moins quatre jours en culture.

Grâce à ce système, plusieurs îlots de cellules peuvent être cultivés sur la même plaque. Lorsqu’ils sont cultivés en îlots seuls, les hépatocytes produisent un peu moins d’albumine que lorsqu’ils sont cultivés en co-culture avec des fibroblastes. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des concentrations de polymères à deux fois la concentration critique pour former des solutions diphasiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de formuler un système aqueux diphasique et de l’utiliser pour modéliser des cellules et définir des géométries.