Name: Le développement, lexpansion et In vivo Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Apprenez à générer des cellules NK humaines à partir de cellules souches pluripotentes hESC et iPSC. Cette méthode sans nourricier permet l'expansion à grande échelle et le suivi in vivo de l'activité antitumorale.

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Les auteurs tiennent à remercier Melinda Hexum pour l&#39;initiation du protocole d&#39;EB de rotation au sein de notre laboratoire. Nous tenons à remercier les autres membres du laboratoire, y compris Laura E. Bendzick, Michael Lepley, et Zhenya Ni pour leur assistance technique à ce travail. Les auteurs tiennent également à remercier Brad Taylor à Caliper Life Sciences pour son expertise technique.

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).</li>
<li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+clinical+therapies+using+hematopoietic+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells.</a> Blood. 114, 3513-3523 (2009).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+describing+the+use+of+a+recombinant+protein-based%2C+animal+product-free+medium+%28APEL%29+for+human+embryonic+stem+cell+differentiation+as+spin+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies.</a> Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust%2C+reproducible+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells%3A+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105, 617-626 (2005).</li>
<li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+differentiate+into+a+homogeneous+population+of+natural+killer+cells+with+potent+in+vivo+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity.</a> Blood. 113, 6094-6101 (2009).</li>
<li>Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+NK+cells+acquire+functional+receptors+and+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity.</a> Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).</li>
<li>Ni, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pluripotent+Stem+Cells+Produce+Natural+Killer+Cells+That+Mediate+Anti-HIV-1+Activity+by+Utilizing+Diverse+Cellular+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms.</a> Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+spin+embryoid+bodies+and+a+description+of+the+hematopoietic+blast+colony+forming+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3(2008).</li>
<li>Denman, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Bound+IL-21+Promotes+Sustained+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells.</a> PLoS ONE. 7, e30264(2012).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+Purification%2C+and+Functional+Assessment+of+Human+Peripheral+Blood+NK+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells.</a> J. Vis. Exp. (48), e2540(2011).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+demonstrates+that+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells+preferentially+develop+into+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells.</a> Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).</li>
<li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+transposon-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer.</a> Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).</li>
<li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7, 827-829 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+luminescence+assays+using+scintillation+counters+for+quantitation+in+transfected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).</li>
<li>Santos, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+in+vivo+imaging+of+T+cells+using+a+membrane-bound+Gaussia+princeps+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase.</a> Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Proteins+and+Their+Applications+in+Imaging+Living+Cells+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues.</a> Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Lymphocytes+to+Study+In+Vivo+Trafficking+and+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy.</a> Stem Cells Dev. 28, 28(2013).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li>
</ol>

Ce travail a été soutenu par le NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) et par le NIH MSTP subvention T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology Training Grant T32 (DAK) (T32HD060536), Programme des possibilités de recherche de premier cycle (PIRPC) Grant, de l&#39;Université du Minnesota (AMB), le Fonds de recherche sur la leucémie de l&#39;Université du Minnesota Cancer Center, et le William L et Fondation Blanche Hughes.

CSEh sont une plateforme idéale pour étudier divers types de cellules et maintenir un potentiel considérable de traduction clinique. Nous utilisons une approche EB rotation définies pour différencier les CSEh / iPSCs de cellules souches hématopoïétiques. L&#39;approche de l&#39;EB de spin a donné dérivation cohérente de cellules souches hématopoïétiques et la différenciation de cellules NK, et pourtant, variation existe encore dans l&#39;efficacité de différenciation dans les lignées cellulaires et peut-être besoin d&#3...

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et des cellules souches pluripotentes induites (CISP) sont des cellules pluripotentes indifférenciées capables d&#39;auto-renouvellement et de multi-lignée différenciation illimitée. hESCs ont été différenciés avec succès en sous-ensembles matures et fonctionnelles de chaque couche de germe, y compris des cellules du système hématopoïétique 3.1. Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des lymphocytes du système immunitaire inné qui peut être obtenue à partir de cellules hES par la formation de corps embryoïdes (EBS) 4,5 ou co-culture avec des lignées de cellules stromales 1,2,6-8. Les cellules NK possèdent des capacités anti-virales et anti-tumorale et ont le potentiel pour être efficace contre un large éventail de cancers, car ils ne nécessitent pas la stimulation antigénique avant d&#39;exercer leurs fonctions effectrices. Ainsi, les cellules CSEh dérivées NK sont une source intéressante de cellules pour l&#39;immunothérapie. En outre, la dérivation de cellules NK de CSEh fournit un système génétiquement prête à étudier le développement normal &lt;em&gt; in vitro. Parce qu&#39;ils fournissent un système génétiquement traitable, les cellules NK CSEh dérivées peuvent être expérimentalement modifiées pour exprimer les journalistes fluorescentes et bioluminescente fournissant un modèle optimal pour étudier NK fonctions effectrices cellulaires in vitro et in vivo. Les cellules NK CSEh dérivées possèdent une activité contre une gamme d&#39;objectifs, y compris le VIH 9, la leucémie (K562) et d&#39;autres types de cancer 7,8. Cependant, la capacité à tirer efficacement suffisamment de cellules NK capables de traiter les patients reste un obstacle important pour la traduction clinique et, dans une moindre mesure, une limitation pour une vaste pré-cliniques in vivo du développement des cellules NK et des fonctions anti-cancéreuses. Ici, nous utilisons une approche de EB de spin de tirer progéniteurs hématopoïétiques à partir de CSEh 4,5,10. Après 11 jours, le tour EB sont transférés à la culture des cellules NK avec ou sans mangeoires pour 28 jours. Après 4 semaines dans un milieu de culture de cellules NK, les cellules NK sont transferred de co-culture avec des cellules K562 modifiées pour exprimer liée à la membrane de l&#39;interleukine 21 (IL-21), qui servent de cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles (VAMP). Adaptation d&#39;un protocole pour l&#39;expansion des cellules NK du sang périphérique à l&#39;aide de ces APC artificielle 11,12, nous sommes en mesure de développer des cellules NK 2-logs tout en conservant un phénotype mature et capacités cytotoxiques. Ce processus de développement et d&#39;expansion prévoit cellules CSEh dérivées NK suffisantes pour extensif dans la caractérisation in vivo. Pour les études in vivo, nous sommes en mesure de surveiller de manière non invasive la prise de greffe à long terme et la cinétique de la luciférase de luciole injecté exprimer (Fluc +), les cellules NK CSEh dérivées utilisant l&#39;imagerie par bioluminescence. En outre, nous sommes en mesure de suivre les interactions des cellules NK avec des cellules tumorales en utilisant un schéma d&#39;imagerie double, bioluminescents ou fluorescent. Une étude antérieure de notre groupe a utilisé l&#39;imagerie par bioluminescence dans un modèle anti-tumorale de suivre la progression tumorale et clearance de + cellules Fluc K562 in vivo 7. Maintenant, en repensant nos CSEh pour exprimer la luciférase de luciole 13,14, nous pouvons suivre la biodistribution et la traite des cellules NK à K562 cellules tumorales qui expriment la protéine fluorescente récemment caractérisé, turboFP650 15. Nous avons choisi ce système de double journaliste afin de suivre simultanément les deux populations de cellules in vivo (figure 1). La plupart des modèles double d&#39;imagerie ont été systèmes à double luciférase, mais ces systèmes peuvent être techniquement difficile en raison des exigences de livraison de coelentérazine, le substrat nécessaire à l&#39;expression de la plupart Renilla et Gaussia journalistes luciférase 16-18. Reporters fluorescents ont permis un contrôle facile de nombreuses lignées cellulaires et des constructions in vitro, mais a eu un succès limité pour l&#39;imagerie in vivo en raison du chevauchement entre les tissus et autofluorescence de la fourrure et les spectres d&#39;émission de plusieurs commonly utilisé reporters fluorescents dont GFP, DsRed et tdTomato 15,19. Cette préoccupation a encouragé le développement de protéines fluorescentes rouge lointain, qui permettent de mieux pénétrance de tissu et un signal spécifique plus élevée par rapport au fond 15,19. TurboFP650, la protéine fluorescente montré dans ce système, est décalée rouge lointain et à bout de bien des enjeux avec des protéines fluorescentes imagerie chez les animaux vivants. Cette méthode de développement et l&#39;expansion des cellules NK provenant de CSEh nous a permis de mieux caractériser les cellules CSEh dérivées NK in vitro et in vivo, ce qui est nécessaire pour mieux comprendre la fonction des cellules NK et cliniquement important d&#39;améliorer les thérapies actuelles adoptifs de cellules NK. Il est également prête à la dérivation et l&#39;expansion des cellules NK iPSC-dérivées. Le système d&#39;imagerie double fluorescent et bioluminescence est largement applicable à d&#39;autres systèmes que le modèle anti-tumorale, nous avons montré ici.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Matériaux&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Milieux&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Milieu BPEL pour la génération d'EB en rotation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Milieu d'Iscove modifié de Dulbecco (IMDM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3022801</td><td></td></tr><tr><td>Mélange nutritif F-12 avec Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td>La BSA disponible commercialement peut être cytotoxique pour les cellules ES. La déionisation de la solution peut réduire le risque de cytotoxicité.</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcool)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Acide linoléique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Acide linolénique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Solution Synthechol 500X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5442</td><td></td></tr><tr><td>a-monothioglycérol (a-MTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5442</td><td></td></tr><tr><td>Mélange hybride sans protéines II</td><td>Invitrogen</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique 2-phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Solution Insuline, Transferrine, Sélénium 100X (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (Pen-Strep)</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Milieu de différenciation des cellules NK&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Milieu de Dulbecco modifié de Eagle (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Milieu F-12</td><td>Invitrogen</td><td>CX30315</td><td></td></tr><tr><td>Sérum humain AB à 15 %</td><td>Valley Biomed</td><td>HP1022HI</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium à 5 ng/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Éthanolamine à 50 µM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique à 20 ng/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapto&amp;#8211;éthanol (BME) à 25 µM</td><td>Gibco</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine à 2 mM</td><td>Gibco</td><td>CX30310</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine à 1 %</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cytokines&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">(toutes les cytokines utilisées fraîches à partir d'aliquots congelés)</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>300-07</td><td>40 ng/ml dans le milieu BPEL ; 20 ng/ml dans le milieu NK. Comme indiqué par le protocole Elefanty, et comme nous l'avons constaté avec un lot défectueux de BMP4, il peut exister des variations entre lots de cytokines en ce qui concerne la différenciation hématopoïétique. En particulier lors de l'achat de cytokines en vrac, il est conseillé d'obtenir un échantillon du lot pour le tester avant achat. Comparer en parallèle avec l'ancien lot.</td></tr><tr><td>rhBMP-4</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>314-BP</td><td>20 ng/ml dans le milieu BPEL</td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td>20 ng/ml dans le milieu BPEL</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-02</td><td>1 x 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; U/ml administrées aux souris après injection des cellules NK ; 50 U/ml utilisées dans le protocole d'expansion des cellules NK</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-15</td><td>10 ng/ml administrées aux souris après injection des cellules NK (seulement les 7 premiers jours)</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-03</td><td>5 ng/ml dans le milieu NK</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml dans le milieu NK</td></tr><tr><td>Ligand Flt-3</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>300-19</td><td>10 ng/ml dans le milieu NK</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; Imagerie&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sel de sodium de D-Luciférine</td><td>Gold BioTechnology</td><td>Lucna-500</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide TurboFP650</td><td>Evrogen, Moscou, Russie</td><td>FP731</td><td>Sous-cloné dans un plasmide basé sur un transposon Sleeping Beauty sous contrôle du promoteur mCAGs. Les cellules ont ensuite été triées selon leur expression de TurboFP650 par FACS. Les cellules et plasmides peuvent être obtenus auprès de notre laboratoire.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Équipement&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Système d'imagerie IVIS Spectrum</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cellules&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cellules présentatrices d'antigènes artificielles exprimant l'IL-21 membranaire</td><td><a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MD Anderson, Houston, TX</a></td><td></td><td>contact : Dean A. Lee. &lt;a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank"&gt;http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cellules souches embryonnaires humaines exprimant la luciférase de luciole</td><td>Université du Minnesota, Minneapolis, MN</td><td></td><td>contact : Dan S. Kaufman. Cellules H9 modifiées par une méthode basée sur le transposon Sleeping Beauty (références 13 et 14). L'expression de la luciférase de luciole est contrôlée par le promoteur mCAGGS. Après le gène de la luciférase de luciole se trouve un élément IRES à l'extrémité 5' d'une construction de fusion GFP:zeocine.</td></tr><tr><td>Cellules K562 exprimant TurboFP650</td><td>Université du Minnesota, Minneapolis, MN</td><td></td><td>contact : Dan S. Kaufman. Description dans la section commentaires du plasmide</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class="jove_content"&gt;&lt;strong&gt;Tableau des matériaux.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

le développement, l&#39;expansion et<em&gt; in vivo</em&gt; suivi des cellules nk humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (cseh) et et induit des cellules souches pluripotentes (cisp)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Nous présentons une méthode pour dériver des cellules tueuses naturelles (NK) à partir de CSEh et iPSCs indifférenciées en utilisant une approche chargeur sans. Cette méthode donne lieu à des taux élevés de cellules NK après 4 semaines de culture et peut subir une expansion de 2 log avec des cellules présentatrices de l&#39;antigène artificielles. Les cellules NK CSEh et iPSC dérivé développés dans ce système ont un phénotype et la fonction mature. La production d&#39;un grand nombre de cellules NK modifiables génétiquement est applicable à la fois mécaniste de base ainsi que des études anti-tumorales. Expression de la luciférase de luciole dans les cellules NK CSEh dérivées permet une approche non invasive pour suivre la prise de greffe de cellules NK, la distribution, et la fonction. Nous décrivons également un double système d&#39;imagerie qui permet une surveillance séparée des deux populations de cellules différentes de caractériser plus nettement leurs interactions in vivo. Ce mode de dérivation, l&#39;expansion, et la double imagerie in vivo fournit une approche fiable de production de cellules NK et leur évaation qui est nécessaire pour améliorer les thérapies actuelles adoptifs de cellules NK.

La génération de cellules progénitrices hématopoïétiques en utilisant l&#39;approche de EB de rotation permet un développement optimal des cellules NK à partir de CSEh et iPSCs. Comme le montre la figure 2, jour 11 de spin EB contient un pourcentage élevé de cellules progénitrices exprimant CD34, CD45, CD43, CD31 et. Des niveaux élevés de CD34 et CD45 permet le transfert direct des conditions NK sans avoir besoin de tri ou de soutenir les cellules stromales. Si il n&#39;est pas optimale rotation EB diff...

Ce protocole décrit le développement, l&#39;expansion et l&#39;imagerie in vivo des cellules NK dérivées de CSEh et iPSCs.

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules tueuses naturelles humaines ou NK à partir de cellules souches floues et puissantes. Ceci est accompli en générant d’abord des cellules progénitrices hématopoïétiques. Dans la deuxième étape, les cellules progénitrices hématopoïétiques sont différenciées en cellules NK par l’utilisation de cytokines définies.Ensuite, les cellules NK peuvent être testées dans une variété d’essais fonctionnels. Dans la dernière étape, la double imagerie est utilisée pour surveiller la capacité des cellules NK à tuer les cibles tumorales in vivo. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes traditionnelles existantes telles que la différenciation médiée par les cellules stromales ou la formation régulière d’EB, est que le système B épineux fournit une approche sans mangeur complètement définie pour l’expansion à grande échelle des cellules progénitrices qui peuvent être différenciées en cellules tueuses naturelles.Les implications de cette technique s’étendent au traitement des infections virales chroniques, ainsi qu’au cancer, car il a été démontré que les cellules NK sont des cellules effectrices importantes dans c

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La capacité des cellules souches embryonnaires humaines à se renouveler et se différencier en tous les types cellulaires du corps donne à penser qu'ils sont très prometteurs pour les applications médicales et comme un outil de recherche pour aborder les questions fondamentales dans le développement et la maladie. Ici, nous fournissons un résumé concis, étape par étape de protocole pour la dérivation de cellules souches embryonnaires humaines à partir d'embryons par l'isolement immunosurgical de...

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

Avec l'intérêt croissant pour les thérapies de cellules souches, des techniques d'imagerie moléculaire sont idéales pour le comportement des cellules souches de surveillance après la transplantation. Gènes rapporteurs luciférase ont permis non invasive, l'évaluation répétitive de la survie cellulaire, l'emplacement et la prolifération in vivo. Cette vidéo vous montrera comment suivre la prolifération des CSEh dans une souris vivante.

In vitro et in vivo en bioluminescence gène rapporteur imagerie des cellules souches embryonnaires humaines

Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement et de purifier de grands nombres de cellules NK humaines et d'évaluer leur fonction.

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

La qualité de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est dicté par la souche de souris droit tel que CF-1. Pluripotence-soutien MEF et des milieux conditionnés (CM) obtenu à partir de ceux-ci devraient contenir des concentrations optimales de l'activine A, Gremlin et Tgfβ1 nécessaires pour la activine / Nodal et des voies FGF à la co-opératoire de maintenir l'auto-renouvellement et la pluripotence.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

Ici, nous montrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de 3-4 ml de sang périphérique en utilisant un vecteur lentiviral unique reprogrammation. La reprogrammation des cellules sanguines facilement disponibles promet d'accélérer l'utilisation des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche.

Génération de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Ici, nous présentons des protocoles de culture de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC), basés sur la croissance de cellules uniques dissociées de type monocouche non colonie (NCM). Cette nouvelle méthode, qui utilise des inhibiteurs de kinases associés à Rho ou l’isoforme 521 de la laminine (LN-521), convient à la production de grandes quantités de hPSC homogènes, à la manipulation génétique et à la découverte de médicaments.

Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l&#39;analyse génétique

Les protocoles décrivent deux vitro systèmes de test de toxicité sur le développement dans (UKK et UKN1) basée sur les cellules souches embryonnaires humaines et des études de transcriptome. Les systèmes de test prédisent risque de toxicité pour le développement humain, et peuvent contribuer à réduire les études sur les animaux, les coûts et le temps requis pour l'essai de la sécurité chimique.

Human cellules souches pluripotentes Basé Toxicité pour le développement dosages pour Chemical dépistage et la biologie des systèmes de sécurité de génération de données

Les protocoles décrits permettent aux laboratoires d’effectuer une culture de cellules souches évolutives et adhérentes à haut débit avec un minimum de main-d’œuvre, d’expérience et de coût d’investissement en équipement à l’aide d’un robot de manipulation de liquides programmable et de plaques à 96 puits.  Les iPSC passées plus de 20 fois sur ce système ont maintenu la pluripotence, les caryotypes normaux et se sont différenciées en cardiomyocytes.

Scalable plaque de 96 puits Basé iPSC Culture et production en utilisant un système robotique Liquid Handling

Génération de cellules souches pluripotentes induites offre des perspectives fascinantes pour la dérivation de la greffe autologue. Toutefois, la progression à travers un état pluripotent et laborieux re-différenciation entrave encore la traduction clinique. Nous décrivons ici la dérivation des fibroblastes humains adultes et leur conversion directe dans des cellules progénitrices neurales induites et la différenciation ultérieure dans les lignées neurales.

Dérivation des adultes fibroblastes humains et de leur conversion directe dans les cellules progénitrices neurales extensible

Le présent protocole montre comment différencier les cellules CD3−/CD45+CD56+ présentant une cytotoxicité légère des cellules souches à potentiel élargi humain (CSEPH) dans des conditions de culture 3D et 2D. Cela permet une validation phénotypique de routine sans la destruction du microenvironnement complexe.

Production de cellules tueuses naturelles à partir de cellules souches humaines à potentiel élargi

Ici, nous présentons une méthode pour différencier et étendre les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) humain dérivé de l’iPSC avec une meilleure destruction contre diverses tumeurs malignes. Ce protocole démontre la différenciation et l’expansion des cellules CAR-NK dérivées d’iPSC optimisées pour les tueurs naturels (NK) et la mesure de l’activité antitumorale contre diverses lignées cellulaires tumorales.

Progrès dans les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique dérivé de cellules souches pluripotentes humaines induites

Apprenez à générer des cellules NK humaines à partir de cellules souches pluripotentes hESC et iPSC. Cette méthode sans nourricier permet l'expansion à grande échelle et le suivi in vivo de l'activité antitumorale.

Le développement, lexpansion et In vivo Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP) (Vidéo) | JoVE Journal

Le développement, l'expansion et

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