Un dosage quantitatif pour l'étude de protéines: ADN Interactions, Découverte de transcription régulateurs de l'expression des gènes, et identifier les agents anti-tumoraux

L’objectif global de cette procédure est de démontrer un test quantitatif de liaison à l’ADN, qui est utile pour examiner les interactions entre l’ADN des protéines, découvrir les régulateurs transcriptionnels de l’expression des gènes et identifier de nouveaux agents antitumoraux. Pour ce faire, il faut d’abord préparer une plaque de dosage recouverte de streptavidine avec une cible d’ADN BIOTINYLÉE appropriée. La deuxième étape consiste à ajouter des protéines d’extraction nucléaire avec ou sans inhibiteurs potentiels et à leur permettre de se lier à la cible de l’ADN.

Ensuite, les facteurs de transcription liés sont détectés avec des anticorps primaires et des anticorps secondaires couplés à la peroxydase de raifort. La dernière étape consiste à ajouter un substrat de peroxydase de raifort aux puits afin de favoriser le développement de la couleur. En fin de compte, le développement de la couleur est mesuré à l’aide du spectrophotomètre.

Au fil du temps, la quantité de changement de couleur indiquera le degré de liaison à l’ADN et l’effet des inhibiteurs potentiels de la liaison à l’ADN. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres techniques, telles que le test de déplacement de mobilité électrophorétique, est qu’il s’agit d’un test quantitatif de liaison aux inhibiteurs d’ADN. Pour commencer, préparez un nombre adéquat de cultures cellulaires composées d’au moins trois fois 10 à sept cellules pour chaque condition testée.

Ici, des cellules endothéliales de la moelle osseuse humaine sont utilisées, qui expriment la protéine run X deux. Une fois que les cellules sont confluentes à 80 %. Traitez les cellules avec 0,2 microgramme par millilitre, sans conazole pour arrêter la croissance cellulaire à la limite du cycle cellulaire G deux M.

Cela stabilisera la protéine run X two et produira une liaison maximale à l’ADN après 16 heures. Lyce les cellules et isolez la protéine comme indiqué dans le protocole de texte d’accompagnement. Une fois la protéine isolée, mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un dosage standard des BCA.

Ensuite, stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius dans des aliquotes de 10 microlitres avec des concentrations comprises entre deux et cinq milligrammes par millilitre. Fixez une plaque à 96 puits avec une solution de 0,1 molaire de carbonate de sodium en ajoutant 300 microlitres du mélange par. Eh bien, préparez-vous suffisamment bien pour que chaque échantillon soit analysé en trois exemplaires.

Incuber la plaque pendant deux heures sur une plate-forme à bascule à température ambiante. Ensuite, lavez la plaque trois fois avec 300 microlitres de streptocoque avid et lavez le tampon et incubez avec 100 microlitres d’oligonucléotides à double brin marqués à la biotine à 1,25 nanomoles par puits pendant deux heures tout en se balançant. Ensuite, lavez les plaques trois fois de plus avec le tampon de lavage streptococcique.

Ajoutez ensuite 100 microlitres par puits du mélange maître contenant un tampon de liaison XDNA, des protéines de liaison à l’ADN à trois à neuf microgrammes par puits et du poly DIGC à un microgramme par puits. Ajoutez ensuite le mélange maître contenant tout inhibiteur potentiel tel que la vitamine D trois ou la dilution appropriée du solvant témoin, tel que l’éthanol dans leurs puits respectifs. Ensuite, couvrez l’assiette et placez-la sur une plate-forme à bascule à quatre degrés Celsius pendant la nuit après l’incubation avec les extraits nucléaires.

Lavez la plaque trois fois avec le streptocoque avid et le tampon de lavage. Ajoutez ensuite 90 microlitres par puits d’un cycle X deux anticorps monoclonaux spécifiques dilués à 0,2 nanogramme par microlitre et un tampon de streptocoque avid et de lavage. Couvrez la plaque et incubez-la à température ambiante sur une plate-forme à bascule pendant une heure.

Ensuite, rincez à nouveau les puits avec un streptocoque avid et un tampon de lavage et ajoutez 90 microlitres par puits du mélange d’anticorps secondaires contenant cinq nanogrammes par microlitre d’anticorps conjugués HRP purifiés par affinité spécifique de fabrication dilués dans le streptocoque. AVID et tampon de lavage. Incuber l’anticorps secondaire pendant 30 minutes à température ambiante sur une plate-forme à bascule.

Ensuite, lavez-le six fois avec 300 microlitres par puits de Strp et tampon de lavage. Ensuite, développez les résultats en ajoutant 50 microlitres d’un substrat de tétraéthyl benadine à chaque puits directement à partir de la bouteille de stock pour une surveillance continue des échantillons. Placez les échantillons dans le spectrophotomètre et mesurez l’absorbance à 635 nanomètres en continu.

Pour une mesure unique, incubez les échantillons pendant 10 à 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Pendant ce temps, les puits doivent passer d’un bleu clair à divers degrés de bleu. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 microlitres d’acide sulfurique à chacun.

Eh bien, mesurez ensuite l’absorbance de chaque puits à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques à 96 puits. Le graphique présenté ici est un exemple de surveillance continue de l’effet de la vitamine D trois biologiquement active sur la liaison de la série X 2D NA. Les concentrations testées ont eu peu d’effet sur la liaison de la série X 2D NA.

Bien que d’autres composés de la vitamine D aient des effets spectaculaires. Le composé 5 2 2 1 9 7 5 testé ici a été identifié à l’aide de la conception de médicaments assistée par ordinateur. Lors des tests, le composé a montré une inhibition dose-dépendante de la liaison rux deux d’une nanomolaire à 100 micromolaires. 50 % de la liaison renx 2D NA a pu être inhibée avec seulement 0,01 micromolaire du composé.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’effectuer le test de liaison à l’ADN et de tester les inhibiteurs potentiels de la liaison à l’ADN.