Microfluidique Capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser de façon réversible de petites molécules ou structures multi-composants pour applications biocapteurs

L’objectif global de l’expérience suivante est de démontrer une stratégie rapide et généralisable pour immobiliser de manière réversible de petites molécules et de nanoparticules fonctionnalisées à la surface des puces de capteurs. Ceci est réalisé en immobilisant d’abord des anticorps anti-GST sur la surface d’un capteur. Dans un deuxième temps, capture de l’antigène de la GST.

Fonctionnalisé avec des groupes transcyclo, octine ou tétrazine, il fournit une surface réactive pour les réactions ultérieures d’édition cyclo avec des dérivés sinusoïdaux de petites molécules ou des conjugués cyclooctane de tendance nanoparticulaire, qui sont ensuite fonctionnalisés avec des dérivés de sinus de petites molécules. Ensuite, la surface fonctionnalisée peut être utilisée pour l’analyse d’interaction avec une cible solubilisée souhaitée. Dans la dernière étape, la surface est régénérée, ce qui permet de capturer ultérieurement des cycles de cyclo-édition. Les résultats de liaison montrent sur le vaisseau les réactions bio-orthogonales préservent la capacité de petites molécules immobilisées ou situ deux nanoparticules fonctionnalisées à interagir avec la cible FK BP 12 et illustrent comment cette approche peut étendre la gamme d’applications pour la SPR.

Le principal avantage de cette technique d’édition de cycle de capture sur puce est qu’elle permet une réversible et une mobilisation rapides de petites molécules avec un contrôle de l’orientation et de la densité de mobilisation I. En règle générale, le processus d’édition du cycle de capture peut être effectué en quelques minutes, ce qui réduit considérablement les temps de préparation de surface, démontrant que la procédure sera démontrée par Jason Sandler, un étudiant de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure à huit microlitres d’une solution T-C-O-N-H-S de 50 millimolaires dans DMSO à 100 microlitres d’une solution GST d’un milligramme par millilitre dans PBS. Après avoir agité le mélange à température ambiante pendant une heure, retirez l’excédent de réactif à l’aide d’une colonne de dessalage Zeba spin.

Ensuite, ajoutez six microlitres d’une solution d’ester NHS tétra de 25 millimolaires dans du DMF à 75 microlitres d’une solution d’un milligramme par millilitre de GST dans du PBS et agitez le mélange à température ambiante après une heure. Diluer le mélange réactionnel avec 25 microlitres de PBS et le purifier à l’aide d’une colonne de dessalage par centrifugation. Ajoutez ensuite 100 microlitres de la solution T-C-O-N-H-S de 50 millimolaires à 150 microlitres d’une solution de nanoparticules émanant et agitez le mélange de la même manière que précédemment.

Après le mélange, éliminer l’excès de réactif par filtration sur gel à l’aide d’une colonne NAP 10. Allusion au tampon PBS. Prélevez la bande colorée contenant le produit N-P-T-C-O.

Transférez l’échantillon purifié dans un tube à centrifuger contenant un dispositif de filtration centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 100 000. Concentrez ensuite l’échantillon jusqu’à un volume final d’environ 150 microlitres après centrifugation. Ajouter 50 microlitres de solution d’anhydride cynique 0,1 molaire dans du DMSO à la solution N-P-T-C-O.

Après avoir agité le mélange à température ambiante pendant une heure, purifier le produit N-P-T-C-O à l’aide d’une colonne NAP 10 éludant avec du PBS à l’aide d’un plasma de surface dans un instrument de résonance, sélectionner l’immobilisation sur les cellules d’écoulement un et deux dans le modèle de l’assistant d’immobilisation AM. Modifier la méthode Amin pour activer les groupes carboxyliques de surface par injection d’une solution individuelle de 0,4 molaire d’EDC et de 0,1 molaire de NHS pendant 480 secondes. À un débit de 10 microlitres par minute, réglez l’injection d’éthanolamine pour éteindre les esters activés restants à un temps de contact de 422e à un débit de 10 microlitres par minute.

Entrez le nom du ligand anti GST et réglez l’injection pour un temps de contact de 420 secondes à un débit de 10 microlitres par minute. Placez ensuite les flacons de solution préalablement préparés dans le deuxième rack de réactifs. Assurez-vous de faire correspondre les positions avec la liste de contenu après avoir attribué le nom du fichier et la destination où les données seront enregistrées.

Démarrez l’immobilisation. Modifiez l’assistant d’immobilisation pour n’injecter que 20 microgrammes par millilitre de la solution de ligand GST pendant 420 secondes à cinq microlitres par minute sur la cellule de débit de référence un. Placez les flacons contenant G-S-T-T-C-O-A préalablement préparée 10 micromolaires de TERAZ olaine et la solution de régénération dans le deuxième rack de réactifs.

Sélectionnez la méthode de fonctionnement manuel, réglez le débit sur cinq microlitres par minute et le chemin d’écoulement sur la cellule d’écoulement deux. Injectez la solution G-S-T-T-C-O pendant 420 secondes, puis la solution Teraz Benz Lamine pendant 600 secondes. Ensuite, régénérez la surface avec deux 32e injections de solution de régénération.

Après avoir placé les flacons GST TERAZ zine, N-P-T-C-O, teraz Belamine et la solution de régénération dans le deuxième rack de réactifs, sélectionnez la méthode de fonctionnement manuel de l’instrument, puis réglez le débit sur cinq microlitres par minute et le chemin d’écoulement sur la cellule d’écoulement deux. Injectez une solution de GST Tetrazine pendant 60 secondes, suivie d’une solution de N-P-T-C-O pendant 60 secondes. Enfin, injectez une solution de tétras zine belamine pendant 60 secondes.

Une fois terminé, régénérez la surface de la même manière que précédemment. Ensuite, sélectionnez une nouvelle méthode et saisissez les paramètres généraux, notamment la collecte de données, la détection de taux, le compartiment d’échantillons, la température, les unités de concentration et les paramètres de tampon. Dans le panneau des étapes de test, créez une nouvelle étape et nommez-la échantillon.

Définissez ensuite l’objectif et les paramètres basés sur la connexion à échantillonner dans le panneau des types de cycles, créez une nouvelle étape de cycle et insérez les commandes suivantes. Capturez l’échantillon de régénération un et de régénération deux. Sélectionnez la commande capture et entrez G-S-T-T-C-O comme ligand.

Nommez 120 secondes comme temps de contact, cinq microlitres par minute comme débit. Et réglez le chemin d’écoulement sur second. Sélectionnez ensuite la commande d’échantillonnage et entrez un temps de contact 182e, un temps de dissociation 62e, un débit de 30 microlitres par minute et réglez le chemin d’écoulement sur les deux.

Après cela, sélectionnez la commande regeneration one et entrez la solution de régénération. Nommez un 32e temps de contact à 30 microlitres par minute et réglez le chemin d’écoulement sur la seconde. Répétez la même procédure pour la régénération.

Deux commandes select set, run et définit le chemin d’écoulement sur deux tirets un. Sélectionnez suivant et remplissez la liste d’échantillons avec la solution d’analyte de tétra Belamine et une série de concentrations de 1,5 à 20 micromolaires à une dilution d’une à deux. Sélectionnez ensuite en regard du panneau de position du rack.

Après avoir placé les flacons de solution dans le deuxième rack de réactifs, placez la série de dilution. Dans une plaque à 96 puits. Assurez-vous de faire correspondre les positions avec la liste de contenu.

Enregistrez le modèle de méthode et démarrez le test de liaison. Par exemple, une fois qu’une nouvelle méthode et les paramètres généraux ont été sélectionnés, créez et nommez les étapes de capture de l’échantillon et de régénération dans le panneau des étapes de test. Ensuite, sélectionnez l’objectif correspondant et connectez les paramètres de base.

Sélectionnez ensuite le panneau des types de cycle et créez trois étapes de cycle. Capture, échantillonnage et régénération. Insérez la commande capture deux fois sous le cycle de capture.

Pas à pas dans le panneau de capture un. Sélectionnez la solution de capture comme variable. Réglez ensuite le temps de contact sur 300 secondes à un débit de cinq microlitres par minute et réglez le chemin d’écoulement sur la seconde dans le panneau de capture à deux.

Sélectionnez la solution de capture en tant que variable. Réglez le temps de contact sur 250 secondes à un débit de cinq microlitres par minute et réglez le chemin d’écoulement sur seconde. Ensuite, insérez la commande sample sous l’étape du cycle d’échantillonnage.

Sélectionnez le panneau d’échantillonnage et réglez le temps de contact sur 60 secondes. Le temps de dissociation à 200 secondes à un débit de 30 microlitres par minute et régler le chemin d’écoulement sur les deux. Insérez la commande de régénération deux fois sous l’étape du cycle de régénération, sélectionnez le panneau de régénération, entrez la solution de régénération.

Nommez un temps de contact de 30 secondes à 30 microlitres par minute et réglez le chemin d’écoulement sur seconde. Répétez la même procédure pour la régénération. Deux panneaux sélectionner, configurer, exécuter et régler le chemin d’écoulement à deux tirets un sélectionner suivant et entrer G-S-T-T-C-O et teraz AP 1, 497 conjugué comme nom de solution de capture FKBP 12 comme nom de l’échantillon et 1,5 à 96 nano molaires à une dilution un à deux comme série de concentration.

Après avoir placé les flacons de solution dans le deuxième rack de réactifs et la série de dilution dans une plaque à 96 puits, enregistrez le modèle de méthode et commencez le test de liaison. L’immobilisation réversible efficace de petites molécules bioactives avec contrôle de l’orientation et de la densité joue un rôle clé dans le développement de nouvelles applications de biocapteurs. Voici la surveillance en temps réel de l’immobilisation du benjoin teraz zine.

Une solution de G-S-T-T-C-O est injectée sur une surface anti GST pré-immobilisée, ce qui entraîne une élévation d’environ 400 R RU. En réponse, une deuxième injection de zine Teraz Benzo Lamine montre une augmentation rapide de 15 RU en réponse. Aucune dissociation de l’antigène dert n’a été observée après le passage au tampon de fonctionnement, ce qui fournit des preuves de la stabilité de la structure.

La surface a été régénérée lors de la dernière étape du cycle pour permettre plusieurs cycles de capture d’édition cyclo. En utilisant cette procédure et en remplaçant le tétrazine, le groupement benzylamine lamine par le conjugué térazzine AP 1, 497 génère une surface bioactive, qui est utilisée pour les études d’interaction avec sa cible. La perturbation de l’interaction antigène de l’anticorps par FK BP 12 régénère la surface anti-GST, permettant la construction d’un nouvel assemblage moléculaire.

Dans ce cas, une injection de zine GST TERAZ est suivie d’une injection de N-P-T-C-O, immobilisant efficacement la nanoparticule à la surface du capteur. Les groupes TCO non réactifs sur les nanoparticules sont disponibles pour l’édition cyclo avec injecté de térazzine benzo lamine. Alternativement, le conjugué TET INE AP 1, 497 est utilisé pour surveiller les interactions fonctionnalisées des nanoparticules FK BP 12.

Aucune dissociation des structures à plusieurs composants n’a été observée, ce qui prouve la stabilité de la structure et la bioactivité, avec des capacités de surveillance de la réaction d’immobilisation en temps réel et de régénération de surface. La caractérisation simple du taux d’association KA est réalisée comme illustré ici. La connaissance de la cinétique de réaction fournit des lignes directrices pour le contrôle de la densité d’immobilisation et des paramètres importants pour les tests de biocapteurs.

L’injection de concentrations croissantes de téraz bélamine ou de N-P-T-C-O en double sur les surfaces G-S-T-T-C-O ou GST teraz zine respectivement génère les données de liaison. Les données de liaison pour deux échantillons séquentiels d’analytes de même concentration sur la même surface sont presque superposables, ce qui reflète une perte minimale de la capacité de liaison des anticorps. En raison des multiples cycles de capture et de régénération de la cyclo-édition, le logiciel d’évaluation fournit l’analyse cinétique la mieux adaptée pour les taux de réaction de l’édition cyclo.

Nous avons développé une approche qui utilise la capture de l’antigène de l’anticorps, couplée à des réactions rapides et hautement spécifiques d’édition cyclo entre le térazzine et la transcycline qui permettent une immobilisation réversible rapide de petites molécules. Pour les études basées sur des puces SPR, la méthode d’édition du cycle de capture nécessite des temps de contact courts avec des concentrations inférieures à 10 micromolaires de ligands de petites molécules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’immobiliser de petites molécules ou des structures à plusieurs composants sur la surface d’un capteur à l’aide de la méthode de capture cyclo edition.

Pour y parvenir, il est important d’utiliser des réactifs de bonne qualité pour les réactions de conjugaison et de configurer correctement les paramètres de dosage sur l’instrument SPR.