Name: Microfluidique Capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser de façon réversible de petites molécules ou structures multi-composants pour applications biocapteurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Apprenez une méthode de capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser réversiblement de petites molécules et nanoparticules fonctionnalisées sur des capteurs SPR. Cette technique bioorthogonale permet des analyses d'interactions moléculaires rapides et reproductibles.

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Une. Préparation de la TPS et de nanoparticules (NP) conjugués <ol><li> TPS-TCO préparation: <ol><li> Ajouter 8 pi de solution TCO-NHS (50 mM dans du DMSO) à 100 pi de TPS (1 mg / ml dans du PBS) et agiter le mélange à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Enlever l&#39;excès de réactif en utilisant une colonne spin dessalage Zeba. Le filtrat récupéré contenant le conjugué GST-TCO est stocké à 4 ° C avant utilisation. </li></ol></li><li> TPS-Tz préparation: <ol><li> Ajouter 6 ul de solution Tz-NHS (25 mM dans du DMF) à 75 ul de GST (1 mg / ml dans du PBS) et agiter le mélange à température ambiante pendant 1 h. </li><li> On dilue le mélange réactionnel avec 25 pi de PBS et on purifie en utilisant une colonne de dessalage de spin. Le filtrat contenant le conjugué GST-Tz est stocké à 4 ° C avant utilisation. </li></ol> Remarque: les analyses de masse (MALDI-TOF) ont montré que, en moyenne ~ 10 molécules Tz ou TCO ont été conjugués à la TPS. </li><li> NP-TCO préparation: <ol><li> Ajouter 100 ul de solution TCO-NHS (50 mM dans du DMSO) à150 pi de nanoparticules aminé (NP-NH 2, 8,7 mg Fe / ml dans du PBS, 3 nm noyau de fer ~ 8000 Fe / NP) et serrent mélange à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Enlever l&#39;excès de réactif par filtration sur gel en utilisant une colonne NAP-10 éluée avec du tampon PBS. Recueillir la bande de couleur contenant le produit NP-TCO. </li><li> On concentre le filtrat jusqu&#39;à un volume final de ~ 150 ul en utilisant un dispositif de filtration centrifuge (100 k MWCO). </li><li> Ajouter 50 ul d&#39;anhydride succinique, (0,1 M dans du DMSO) à la solution NP-TCO et agiter à température ambiante pendant 1 heure (anhydride réagit avec des amines restantes pour former des acides carboxyliques terminaux. Cela empêche les interactions non spécifiques avec la surface de dextran). </li><li> Purifier le produit NP-TCO en utilisant une colonne NAP-10 en éluant avec PBS. Conserver la solution de NP-TCO à 4 ° C avant de l&#39;utiliser. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de la surface Toutes les analyses de résonance de plasmon de surface sont effectuées sur un instrument Biacore T100 (GE Healthcare) à25 ° C à l&#39;aide d&#39;une puce de capteur CM5 et du PBS-P en tant que courant de tampon, sauf indication contraire. Contrôle Biacore et logiciels d&#39;évaluation fourni avec l&#39;appareil sont utilisés pour la mise en place des expériences et l&#39;analyse des données. Deux modes de fonctionnement, assistants de l&#39;application et l&#39;exécution manuelle seront utilisés pour la préparation de la surface et de surveillance sur la puce de capture-cyclo. Le mode méthode de constructeur sera utilisé pour la mise en place des expériences de liaison d&#39;orientation inverse et pour mesurer les taux de réaction de cycloaddition. Les données sont double référence soustrait et analyses cinétiques sont réalisées en utilisant un modèle de liaison 01:01 Langmuir. <ol><li> Utilisez le modèle de l&#39;assistant amine d&#39;immobilisation et sélectionnez l&#39;immobilisation sur des cellules de flux 1 (référence) et 2 (détection). Procédé modifier amine pour activer les groupes carboxyliques en surface par injection d&#39;une solution 1:1 de 0,4 M EDC: 0,1 M NHS pour 480 secondes à un débit de 10 ul / min. Réglez l&#39;injection d&#39;éthanolamine pour étancher autres esters activés à 420 secondes de temps de contact auun débit de 10 ul / min. </li><li> Nom de l&#39;entrée de ligand, anti-TPS (18 pg / ml dans un tampon d&#39;acétate, pH 5,0) et mis à injecter pour un temps de 420 secondes de contact à une vitesse de 10 pi / min. </li><li> Placez les flacons de solution requis en réactif rack 2 en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer et commencer immobilisation. Remarque: L&#39;exécution de l&#39;assistant d&#39;immobilisation de cette manière entraîne des niveaux d&#39;immobilisation anti-TPS de l&#39;ordre de 14.000 à 17.000 ~ RU. </li><li> Modifier l&#39;assistant d&#39;immobilisation à n&#39;introduire que ligand de TPS (20 pg / ml) solution pour 420 secondes à 5 l / min de débit sur cellule de référence 1. </li></ol> 3. Surveillance sur puce Capture-cycloaddition de molécules fonctionnalisés <ol><li> Suivi sur puce capture cycloaddition en temps réel (Figure 2). <ol><li> Placer GST-TCO (20 ug / ml), Tz-BnNH 2 (10 pM) et de régénération (glycine 10 mM, pH = 2,0) dans des flacons de solution de réactif rack 2. Sélectionnez l&#39;hommeméthode run manuel, régler le débit à 5 l / min et le chemin de flux Flow cellule 2. </li><li> Injecter la solution de TPS-TCO pour 420 sec. </li><li> Injecter la solution de Tz-BnNH 2 pour 600 sec. </li><li> Régénérer la surface avec deux injections de 30 sec de la solution de régénération. </li></ol></li><li> Ensemble de surveillance sur la puce de structures multi-composants en temps réel (figure 3): <ol><li> Placer GST-Tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 pg Fe / ml), Tz-BnNH 2 (10 pM) et de régénération (glycine 10 mM, pH = 2.0) de la solution dans des flacons de réactif rack 2. Sélectionnez la méthode d&#39;exécution manuel de l&#39;instrument, régler le débit à 5 l / min et le trajet d&#39;écoulement à débit cellulaire 2. </li><li> Injecter une solution de TPS-Tz pendant 60 secondes. </li><li> Injecter une solution de NP-TCO pour 60 sec. </li><li> Injecter une solution de Tz-BnNH 2 pendant 60 secondes. </li><li> Régénérer la surface avec deux injections de 30 sec de la solution de régénération. </li></ol></li></ol> 4. MSUIVI Immobilisation densité et la détermination de Cycloaddition Tarifs <ol><li> Caractérisation des petites vitesses de réaction de cycloaddition molécules (figure 4). <ol><li> Sélectionnez nouvelle méthode d&#39;entrée et de paramètres généraux. Dans le panneau étapes du dosage de créer une nouvelle étape et nommez-échantillon. Définir le but et Connectez paramètres de base d&#39;échantillons. </li><li> Dans le panneau Types de vélo Créer une nouvelle étape du cycle et insérer les commandes suivantes: capture, l&#39;échantillon, Régénération 1 et régénération 2. </li><li> Sélectionnez la commande de capture, le nom de ligand d&#39;entrée (TPS-TCO, 20 pg / ml), le temps de contact de 120 secondes à 5 l / min et le chemin d&#39;écoulement fixé à: Deuxième. Sélectionnez la commande de l&#39;échantillon; entrée 180 temps de contact sec, 60 sec de temps de dissociation, débit 30 l / min et définit le chemin d&#39;écoulement à: Les deux. Sélectionnez la commande de régénération 1; entrée régénération nom de la solution (10 mM de glycine-HCl pH 2,0), le temps de contact de 30 secondes à 30 pi / min et définit le chemin d&#39;écoulement à: Deuxième. Répétez la même chose pour la régénération 2 commande. &lt;/ Li&gt; <li> Run Setup Sélectionnez et réglez voie d&#39;écoulement à: 2-1. Sélectionnez prochaine et remplir la liste de l&#39;échantillon avec une solution d&#39;analyte (Tz-BnNH 2) et la série de concentration (0,3-10 uM, dilution 1:2). Sélectionnez prochaine pour accumuler panneau de position. Lieu flacons de solution dans réactif rack 2 et série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. La liaison de données et l&#39;analyse cinétique sont présentés dans la figure 4. </li></ol></li><li> Caractérisation des NP vitesses de réaction de cycloaddition (figure 4). <ol><li> Ouvrez le modèle de méthode enregistrée par le haut et modifier les paramètres suivants. Sélectionnez le panneau Acquisition, changement de nom ligand à la TPS-Tz, 20 pg / ml. Sélectionnez le panneau de l&#39;échantillon; changement temps de contact à 120 secondes de temps de contact et le temps de dissociation à 120 sec. </li><li> Sélectionnez la liste de l&#39;échantillon; changer analyte à NP-TCO et série de concentration (7-224 nM, dilution 1:2). Flacons place de solutions dans l&#39;armoire réactif2 et de la série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. La liaison de données et l&#39;analyse cinétique sont présentés dans la figure 4. </li></ol></li></ol> 5. Mesure de la liaison de FKBP12 à AP1497 immobilisée Des études de liaison inverse emploient orientation-FKBP12 comme l&#39;analyte et le composé AP1497 comme ligand immobilisé (Figure 5). La méthode générale de ce test est mis en place comme suit en utilisant l&#39;outil de méthode constructeur: <ol><li> Sélectionnez nouvelle méthode d&#39;entrée et de paramètres généraux. Dans le panneau étapes de l&#39;analyse et de créer le nom de capture, d&#39;exemples et de régénération étapes. Sélectionnez Objet correspondant et Connectez paramètres de base. </li><li> Sélectionnez les types de cycle panneau et créer 3 étapes du cycle: Capture, exemples et de régénération. </li><li> Insérez la commande de capture à deux reprises à l&#39;étape du cycle de capture. Sélectionnez Capture 1 panneau et sélectionnez solution de capture comme variable, définir le temps de contact de 300 secondes à un débit de 5 l / min et le chemin d&#39;écoulement fixé à: Deuxième. Sélectionnez le panneau Capture 2 et sélectionnez solution de capture comme variable régler le temps de contact de 250 s à une vitesse de 5 pi / min et le chemin d&#39;écoulement régler le débit à: Deuxième. </li><li> Insérez la commande de l&#39;échantillon sous l&#39;étape du cycle échantillon. Sélectionnez le panneau de l&#39;échantillon; ensemble un temps de contact de 60 secondes, le temps de dissociation à 200 secondes à un débit de 30 l / min et définit le chemin d&#39;écoulement à: Les deux. </li><li> Insérer la commande de régénération en vertu de deux fois l&#39;étape de cycle de régénération. Sélectionnez le panneau de régénération 1; entrée régénération nom de la solution (10 mM de glycine-HCl pH 2,0), le temps de contact de 30 secondes à 30 pi / min et définit le chemin d&#39;écoulement à: Deuxième. Répétez la même chose pour le panneau de régénération 2. </li><li> Run Setup Sélectionnez et réglez voie d&#39;écoulement à: 2-1. Sélectionnez prochaines entrée et noms de solution de capture (TPS-TCO et AP1497-Tz), le nom de l&#39;échantillon (FKBP12), série de concentrations (0,020 à 5 ug / ml, dilution 1:2) et MW (13 000). Lieu flacons de solution dans reagent rack 2 et série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. Les données d&#39;analyse cinétique sont présentés dans la figure 5. </li></ol> 6. Mesure de la liaison de FKBP12 à AP1497 Attaché à immobilisée IP La méthode générale de nanoparticules immobilisation, petite dérivation de molécule et essai de liaison FKBP12 est mis en place comme suit en utilisant l&#39;outil de méthode constructeur: <ol><li> Ouvrez le modèle de méthode enregistrée par le haut et modifier. Insérez une commande de capture supplémentaires à l&#39;étape du cycle de capture. Sélectionnez le 1 panneau de capture; désélectionner solution de capture comme variable et nom solution de capture 1 (TPS-Tz). Set temps de contact de 60 secondes à un débit de 5 l / min et définit le chemin d&#39;écoulement à la deuxième. Sélectionnez le panneau Capture 2; désélectionner solution de capture comme variable et nom solution de capture 2 (NP-TCO). Régler le temps de contact de 90 secondes à une vitesse de 5 pi / min et débitchemin d&#39;écoulement fixé à la seconde. Sélectionnez le 3 panneau Acquisition; désélectionner solution de capture comme variable et nom solution de capture 3 (AP1497-Tz). Régler le temps de contact de 180 secondes à un débit de 5 l / min et définit le chemin d&#39;écoulement à la deuxième. </li><li> Run Setup Sélectionnez et réglez voie d&#39;écoulement à: 2-1. Sélectionnez deux fois la prochaine. Lieu flacons de solution dans réactif rack 2 et série de dilution en plaque de 96 puits en faisant coïncider les positions avec la liste de contenu. Enregistrer modèle de méthode et commencer essai de liaison. Les données d&#39;analyse cinétique sont présentés dans la figure 5. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La méthode de capture-cyclo décrit ici permet rapide, immobilisation réversible de nanoparticules modifiées et de petites molécules pour à puce interaction sans étiquette et des études cinétiques. Le protocole d&#39;immobilisation peut être réalisée en quelques minutes nécessitant &lt;10 uM concentrations de ligands de petites molécules. En modulant la concentration de ligand et les densités d&#39;immobilisation de temps de contact peut être étroitement contrôlée. Nos données montrent que les réactions bioorthogonal sur...

Réactions de conjugaison efficaces sont des outils précieux pour la fixation de molécules bioactives de surfaces pour une variété d&#39;applications de la biotechnologie. Récemment, le bioorthogonal très rapide [4 +2] de réaction de cycloaddition entre trans-cyclooctène (TCO) et le 1,2,4,5-tétrazine (Tz) a été utilisé pour marquer la surface des cellules, des structures sous-cellulaires, les anticorps et les nanoparticules 1. - 7 Ici, nous utilisons la réaction [4 +2] de cyclo en combinaison avec capture antigène / anticorps (TPS / anti-GST) pour la synthèse de structures multi-composants pour résonance plasmonique de surface (SPR) analyse de l&#39;interaction réversible sur puce et de surveiller la processus en temps réel (Figure 1). 8,9 En particulier, la stratégie de capture-cycloaddition permet la régénération de la surface en utilisant un protocole établi. 8 En conséquence, l&#39;assemblage de surfaces de détection stables avec le contrôle de l&#39;orientation du ligand et de la densité pour la variété de nouvelle épreuve formats est désormais possible. Utilisationcette stratégie, nous avons démontré l&#39;immobilisation de petites molécules TCO / Tz-dérivatisés et de caractériser les taux de cycloaddition dans une variété de conditions de tampon. Nous avons choisi l&#39;interaction connue entre FKBP12 et un AP1497 molécule qui se lie à FKBP12 10 à 12, par exemple, pour vérifier que la stratégie de capture-cycloaddition conserve la capacité de la petite molécule d&#39;interagir avec sa cible lorsque soit lié directement à des antigènes immobilisés sur la TPS ou à des nanoparticules immobilisées (PN). Cette méthode présente plusieurs avantages. Premièrement, l&#39;immobilisation réversible de petites molécules sur des puces de capteur est à présent possible. Deuxièmement, TCO / Tz immobilisation de petites molécules permet également des études d&#39;interaction sans étiquette qui renversent l&#39;orientation des études SPR canoniques, et peut fournir une vue complémentaire d&#39;une interaction de liaison. Troisièmement, cette méthode permet la synthèse de nanoparticules ciblées microfluidique, et l&#39;évaluation immédiate de leur binding propriétés. Cela promet d&#39;améliorer l&#39;efficacité de l&#39;évaluation ou de dépistage nanoparticules ciblées, et aussi diminuer les quantités de nanoparticules nécessaires. 13-15 Quatrièmement, cette approche permet de mesurer la cinétique de réaction des réactions de cycloaddition bioorthogonal en temps réel sous flux continu. Enfin, l&#39;immobilisation de la chimie TCO / Tz est robuste en présence de sérum. Dans l&#39;ensemble, nous prévoyons que cette approche polyvalente sera largement faciliter la construction de surfaces de capteurs stables pour une grande variété d&#39;études microfluidiques avec pertinence à in vitro et dans des applications cellulaires in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Sensor Chip CM5</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-30</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de raccord amine</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-50</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Kit de capture GST</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-23</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>NAP-10 Colonnes</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0854-01</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>GST, lyophilisé dans 1X PBS</td><td>Genscript</td><td>Z02039</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>rhFKBP12</td><td>R& D Systems</td><td>3777-FK</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Surfactant P-20</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-54</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Glycine 2.0</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1003-55</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Colonne de dessalage par spin Zeba</td><td>Thermo</td><td>89882</td><td>7 K MWCO</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4</td><td>Filtre centrifuge Fisher</td><td>UFC810096</td><td>100 K</td></tr><tr><td>TCO-OH</td><td>Réf. 8</td><td></td><td>Synthéqué en interne</td></tr><tr><td>TCO-NHS</td><td>Réf. 8</td><td></td><td>Synthétisé en interne, *Disponible dans le commerce chez Click Chemistry Tools # 1016-25</td></tr><tr><td>Tz-BnNH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Synthéqué en interne</td></tr><tr><td>Tz-NHS</td><td>Réf. 8</td><td>764701</td><td>synthétisé en interne, *Disponible dans le commerce chez Sigma Aldrich # 764701</td></tr><tr><td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>synthétisé en interne</td></tr><tr><td>AP1497, AP1497-Tz</td><td>réf. 8</td><td></td><td>synthétisé en interne</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>SPR Biosensor</td><td>GE Soins de santé</td><td>Biacore T100</td><td>&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

microfluidique capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser de façon réversible de petites molécules ou structures multi-composants pour applications biocapteurs

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Procédés d&#39;immobilisation de surface rapide de petites molécules bioactives avec contrôle sur l&#39;orientation et la densité d&#39;immobilisation sont hautement souhaitable pour les applications de biocapteurs et biopuces. Dans cette étude, nous utilisons une liaison covalente bioorthogonal très efficace [4 +2] de réaction de cycloaddition entre trans-cyclooctène (TCO) et le 1,2,4,5-tétrazine (Tz) pour permettre l&#39;immobilisation de molécules microfluidique TCO / Tz-dérivées . Nous surveillons le processus en temps réel dans des conditions d&#39;écoulement continu à l&#39;aide de la résonance plasmonique de surface (SPR). Pour permettre l&#39;immobilisation réversible et d&#39;étendre la gamme expérimentale de la surface du capteur, on combine un composant de capture d&#39;antigène-anticorps non covalente avec la réaction de cycloaddition. En présentant alternativement TCO ou Tz fragments à la surface du capteur, plusieurs processus de capture-cyclo sont désormais possibles sur une surface de capteur pour montage et d&#39;interaction sur puce études d&#39;une variété de structures multi-composants. Nous illustrate cette méthode avec deux expériences différentes d&#39;immobilisation sur une puce de biocapteur; une petite molécule qui se lie, AP1497 FK506-binding protein 12 (FKBP12), et la même petite molécule dans le cadre d&#39;une nanoparticule fonctionnalisée situ immobilisé et dans.

Les données et les chiffres ont été adaptés de la référence 8. Immobilisation réversible efficace de petites molécules bioactives avec un contrôle sur l&#39;orientation et la densité joue un rôle clé dans le développement de nouvelles applications de biocapteurs. En utilisant la réaction bioorthogonal rapide entre TCO et Tz, nous décrivons une méthode pour l&#39;ensemble de paliers et la régénération des surfaces de ligands avec maintien de l&#39;activité biologique. Figure 2</strong...

Nous présentons une méthode pour rapide, l&#39;immobilisation réversible de petites molécules et des ensembles de nanoparticules fonctionnalisées pour résonance plasmonique de surface (SPR) des études, utilisant séquentielle sur puce chimie de cycloaddition bioorthogonal et anticorps-antigène capture.

Microfluidique Capture-cyclo-réaction sur puce pour immobiliser de façon réversible de petites molécules ou structures multi-composants pour applications biocapteurs

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer une stratégie rapide et généralisable permettant d'immobiliser de façon réversible des petites molécules et des nanoparticules fonctionnalisées à la surface de puces de détection. Cette stratégie consiste, dans un premier temps, à immobiliser des anticorps anti-GST sur une surface capteur. Dans un deuxième temps, elle implique la capture de l'antigène GST.Functionalisé avec des groupes trans-cyclo, octine ou tétrazine, ce support fournit une surface réactive pour des réactions ultérieures de cycloaddition avec des dérivés de petite molécule de tétrazine ou des conjugués nanoparticulaires de trend-cyclooctane, eux-mêmes ultérieurement fonctionnalisés par des dérivés de petite molécule de tétrazine. Ensuite, la surface fonctionnalisée peut être utilisée pour l’analyse d’interactions avec une cible solubilisée souhaitée. Dans la dernière étape, la surface est régénérée, permettant ainsi des cycles successifs de capture par cycloaddition. Les résultats obtenus montrent que les réactions bio-orthogonales sur puce préservent la capacité des petites molécules immobilisées ou des nanoparticules fonctionnalisées à interagir avec la cible FK BP 12, illustrant ainsi comment cette approche peut étendre le champ d’applications de la SPR.L'avantage principal de cette technique d'édition du cycle de capture sur puce est qu'elle permet une mobilisation rapide, réversible et contrôlée de petites molécules, avec un contrôle sur l'orientation et la densité de mobilisation. Typiquement, le processus d'édition du cycle de capture peut être réalisé en quelques minutes, réduisant ainsi de façon significative les temps de préparation de la surface. La procédure sera démontrée par Jason Sandler, un étudiant de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, ajoutez huit microlitres d'une solution de T-C-O-N-H-S à 50 millimolaire dans du DMSO à 100 microlitres d'une solution de GST à un milligramme par millilitre dans du PBS. Après avoir agité le mélange à température ambiante pendant une heure, éliminez l'excès de réactif à l'aide d'une colonne de désalinisation Zeba par centrifugation.Ensuite, ajoutez six microlitres d'une solution de tétra NHS ester à 25 millimolaire dans du DMF à 75 microlitres d'une solution de GST à un milligramme par millilitre dans du PBS, puis agitez le mélange à température ambiante pendant une heure. Diluez le mélange réactionnel avec 25 microlitres de PBS et purifiez à l'aide d'une colonne de désalinisation par centrifugation. Puis, ajoutez 100 microlitres de la solution de T-C-O-N-H-S à 50 millimolaire à 150 microlitres d'une solution de nanoparticules émanées et agitez le mélange de la même manière qu'auparavant.Après le mélange, éliminer le réactif en excès par filtration sur gel à l’aide d’une colonne NAP 10. Éluer avec le tampon PBS. Recueillir la bande colorée contenant le produit N-P-T-C-O.Transférez l'échantillon purifié dans un tube d'ultracentrifugation contenant un dispositif de filtration centrifuge dont la coupure en poids moléculaire est de 100 000. Ensuite, concentrez l'échantillon jusqu'à un volume final d'environ 150 microlitres par centrifugation. Ajoutez 50 microlitres de solution de cyanure anhydre à 0,1 molaire dans le DMSO à la solution N-P-T-C-O.Après avoir agité le mélange à température ambiante pendant une heure, purifiez le produit N-P-T-C-O à l’aide d’une colonne NAP 10 en éluant avec du PBS à l’aide d’un instrument de résonance plasmatique de surface ; dans le modèle de l’assistant d’immobilisation AM, sélectionnez l’immobilisation sur les cellules d’écoulement une et deux. Modifiez la méthode Amin pour activer les groupes carboxyliques de surface par injection d’une solution équimolaire de 0,4 molaire d’EDC et de 0,1 molaire de NHS pendant 480 secondes. À un débit de 10 microlitres par minute, réglez l’injection d’éthanolamine pour bloquer les esters activés restants sur un temps de contact de 422 secondes à un débit de 10 microlitres par minute.Saisissez le nom du ligand anti GST et configurez l'injection pour un temps de contact de 420 secondes à un débit de 10 microlitres par minute. Ensuite, placez les flacons contenant les solutions préparées précédemment dans le porte-réactifs numéro deux. Veillez à faire correspondre les positions avec la liste des contenus après avoir attribué le nom du fichier et l'emplacement de destination où les données seront enregistrées.Démarrer l'immobilisation. Modifier l'assistant d'immobilisation pour injecter uniquement 20 microgrammes par millilitre de la solution de ligand GST pendant 420 secondes à raison de cinq microlitres par minute sur la cellule de référence un. Placer les flacons contenant la solution de GST-T-C-O-A préparée précédemment à 10 micromolaire en TERAZ olaine et la solution de régénération dans le porte-réactifs deux.Sélectionnez la méthode d'exécution manuelle, réglez le débit à cinq microlitres par minute et le trajet d'écoulement sur la cellule d'écoulement deux. Injectez la solution G-S-T-T-C-O pendant 420 secondes, puis la solution Teraz Benz Lamine pendant 600 secondes. Ensuite, régénérez la surface par deux injections de 32 secondes de solution de régénération.Après avoir placé le flacon de GST TERAZ zine, le flacon de N-P-T-C-O, le flacon de téraz bélamine et le flacon de solution de régénération dans le porte-réactifs deux, sélectionnez la méthode de fonctionnement manuel de l'appareil, puis réglez le débit à cinq microlitres par minute et le trajet d'écoulement sur la cellule d'écoulement deux. Injectez une solution de GST Tétra zine pendant 60 secondes, suivie d'une solution de N-P-T-C-O pendant 60 secondes. Enfin, injectez une solution de tétras zine bélamine pendant 60 secondes.Lorsque l'opération est terminée, régénérez la surface de la même manière qu'auparavant. Ensuite, sélectionnez une nouvelle méthode et saisissez les paramètres généraux, notamment la collecte des données, la détection du taux, le compartiment d'échantillonnage, la température, les unités de concentration et les paramètres de tampon. Dans le panneau des étapes du dosage, créez une nouvelle étape et nommez-la échantillon.Ensuite, définissez l'objectif et reliez les paramètres à l'échantillon dans le panneau des types de cycles, créez une nouvelle étape de cycle et insérez les commandes suivantes. Capturer la régénération d'échantillon un et la régénération deux. Sélectionnez la commande de capture et saisissez G-S-T-T-C-O comme ligand.Indiquez 120 secondes comme temps de contact, cinq microlitres par minute comme débit, et réglez le trajet d'écoulement sur « second ». Ensuite, sélectionnez la commande d'échantillonnage et entrez un temps de contact de 182 secondes, un temps de dissociation de 62 secondes, un débit de 30 microlitres par minute, et réglez le trajet d'écoulement sur « both ».Après cela, sélectionnez la commande de régénération et introduisez la solution de régénération. Nommez un temps de contact de 32e à 30 microlitres par minute et réglez le trajet d'écoulement sur le second. Répétez la même procédure pour la régénération.Sélectionnez l'ensemble de commandes deux, exécutez-le et réglez le trajet d'écoulement sur deux tiret un. Sélectionnez ensuite suivant et remplissez la liste d'échantillons avec la solution analyte de tétra-bélamine et une série de concentrations de 1,5 à 20 micromolaires selon un facteur de dilution de un à deux. Ensuite, sélectionnez suivant pour accéder au panneau de position du rack.Après avoir placé les flacons de solution dans le support de réactifs numéro deux, positionnez la série de dilutions dans une plaque de 96 puits, en veillant à faire correspondre les positions avec la liste des contenus.Enregistrez le modèle de méthode et démarrez le test de liaison. Une fois qu'une nouvelle méthode et les paramètres généraux ont été sélectionnés, créez et nommez les étapes d'échantillon de capture et de régénération dans le panneau des étapes du test. Ensuite, sélectionnez l'objectif correspondant et connectez les paramètres de base.Ensuite, sélectionnez le panneau des types de cycles et créez trois étapes de cycle : capture, échantillonnage et régénération. Insérez la commande de capture deux fois sous le cycle de capture.Accéder au panneau de capture un. Sélectionner la solution de capture comme variable. Puis régler le temps de contact à 300 secondes avec un débit de cinq microlitres par minute et régler le trajet d'écoulement sur le deuxième dans le panneau de capture deux.Sélectionnez la solution de capture comme variable. Réglez le temps de contact à 250 secondes avec un débit de cinq microlitres par minute et définissez le trajet d'écoulement sur le second. Ensuite, insérez la commande d'échantillon dans l'étape du cycle d'échantillonnage.Sélectionnez le panneau d'échantillon et réglez le temps de contact à 60 secondes. Réglez le temps de dissociation à 200 secondes avec un débit de 30 microlitres par minute, et définissez le trajet d'écoulement sur les deux voies. Insérez la commande de régénération deux fois dans l'étape du cycle de régénération, sélectionnez le panneau de régénération un, puis saisissez la solution de régénération.Indiquez un temps de contact de 30 secondes à 30 microlitres par minute, puis réglez le trajet d'écoulement sur « second ». Répétez la même procédure pour la régénération. Dans le panneau à deux options, sélectionnez « setup », lancez puis réglez le trajet d'écoulement sur « two dash one », sélectionnez « next » et saisissez G-S-T-T-C-O et teraz AP 1, 497 conjugué comme noms des solutions de capture, FKBP 12 comme nom de l'échantillon, et 1,5 à 96 nanomolaire selon une série de dilutions d'un facteur un à deux comme gamme de concentrations.Après avoir placé les flacons de solution dans le porte-réactifs deux et la série de dilution dans une plaque 96 puits, enregistrez le modèle de méthode et démarrez le test de liaison. L'immobilisation réversible efficace de petites molécules bioactives, avec un contrôle de l'orientation et de la densité, joue un rôle clé dans le développement de nouvelles applications de biocapteurs. On observe ici la surveillance en temps réel de l'immobilisation de la terazosine Benzoin.Une solution de G-S-T-T-C-O est injectée sur une surface anti-GST pré-immobilisée, entraînant une augmentation d’environ 400 unités de réponse (RU). En réponse, une seconde injection avec la téracine benzo-lamine montre une augmentation rapide de 15 RU. Aucune dissociation de l'antigène dérivé n’a été observée après le passage au tampon d’élution, ce qui témoigne de la stabilité de la structure.La surface a été régénérée à la dernière étape du cycle afin de permettre plusieurs cycles de capture. En utilisant cette procédure et en remplaçant le groupement tétrazine, benzyle amine par le conjugué tétrazine AP 1,497, on obtient une surface bioactive, utilisée pour des études d'interaction avec sa cible. La dissociation de l'interaction anticorps-antigène par FK BP 12 régénère la surface anti-GST, permettant ainsi la construction d'un nouvel assemblage moléculaire.Dans ce cas, une injection de zine GST TERAZ est suivie par une injection de N-P-T-C-O, immobilisant efficacement la nanoparticule à la surface du capteur. Les groupes TCO non réagis sur les nanoparticules sont disponibles pour une cycloaddition avec la teraz zine benzo lamine injectée. Alternativement, le conjugué TET INE AP 1,497 est utilisé pour surveiller les interactions de la nanoparticule fonctionnalisée FK BP 12.Aucune dissociation des structures multicomposants n'a été observée, ce qui témoigne de la stabilité structurale et de la bioactivité, ainsi que des capacités de suivi en temps réel de la réaction d'immobilisation et de régénération de surface. La caractérisation simple du taux d'association KA est réalisée comme indiqué ici. La connaissance des cinétiques de réaction fournit des directives pour le contrôle de la densité d'immobilisation et constitue un paramètre important pour les tests de biosenseurs.L'injection de concentrations croissantes de teraz BELAMINE ou de N-P-T-C-O en double sur des surfaces de G-S-T-T-C-O ou de GST teraz zine respectivement génère les données de liaison. Les données de liaison pour deux échantillons d'analyte consécutifs de même concentration sur la même surface sont presque superposables, reflétant une perte minimale de la capacité de liaison de l'anticorps. En raison de plusieurs cycles de capture, de cyclisation et de régénération, le logiciel d'évaluation fournit l'analyse cinétique correspondant le mieux aux taux de réaction de cyclisation.Nous avons mis au point une approche qui utilise la capture d'antigènes par anticorps, couplée à des réactions de cycloaddition rapides et hautement spécifiques entre la tétrazine et le trans-cyclooctène, permettant l'immobilisation rapide et réversible de petites molécules. Pour les études basées sur des puces SPR, la méthode de capture par cycloaddition nécessite des temps de contact courts avec des concentrations inférieures à 10 micromolaires de ligands de petites molécules. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment immobiliser des petites molécules ou des structures multicomposants sur une surface capteur à l’aide de la méthode de capture par cycloaddition.Pour y parvenir, il est important d'utiliser des réactifs de bonne qualité pour les réactions de conjugaison et de régler correctement les paramètres du test sur l'appareil SPR.

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