Name: Souris ingénierie des génomes Utilisation nucléases de créateurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Découvrez une méthode d'édition génomique chez la souris utilisant les nucléases TALEN pour générer des souris déficientes pour un gène cible. Cette approche permet d'étudier la fonction génique in vivo avec précision.

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Nous tenons à remercier Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, et Ewa Skoczylas pour une excellente assistance technique. Cette étude a été financée par la société SNF Sinergia subvention CRSI33-125073 à PP.

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</ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêts.

Designer génome approches d&#39;édition axée sur la nucléase ont considérablement élargi la gamme des espèces qui se prêtent à des modifications ciblées de leurs génomes respectifs 10,12. Chez la souris, le gène de ciblage dans des cellules ES a été une technique standard pour plus de deux décennies; Cependant, il s&#39;est avéré difficile d&#39;adapter à des cellules ES provenant d&#39;espèces autres que la souris, bien qu&#39;il y ait eu un certain succès récent dans les cellules ES de rat. Même avec la disponibilité de la souris ES clones cellulaires de gènes ciblés &quot;off-the-shelf» fournis par des consortiums tels que EUCOMM, KOMP, ou NorCOMM 3 génome édition par ZFN et TALEN offre une plus grande précision et de flexibilité en ce qui concerne le spectre de modifications qui peuvent être introduit dans le génome de la souris. animaux fondateurs portant des mutations de la nucléase médiation semblent être très germinale compétente 4-6,20,21, ce qui n&#39;est pas toujours le cas pour des chimères provenant des injections de blastocyste de cellules ES. Ainsi, dans certains cas, la micro-injection de desnucléases igner peuvent engendrer une beaucoup plus rapidement de nouvelles lignées de souris avec des modifications génomiques ciblées. La génération réussie de souris knock-out par injection de ZFN et TALEN dépend dans une large mesure sur l&#39;activité de la paire de nucléase injecté. TALENs se sont révélés avoir un taux élevé de succès pour cibler un large éventail de gènes dans un certain nombre d&#39;organismes; Toutefois, des études récentes suggèrent que la liaison TALEN est sensible à la méthylation de la cytosine 30,31. Ainsi, les paires de nuclease nouvellement générés, par exemple TALENs cloné dans des vecteurs pCAG-T7, peuvent être transfectées de manière transitoire dans une lignée cellulaire de souris telles que les NIH-3T3 ou Neuro -2a, qui imite l&#39;état de l&#39;embryon de souris de la chromatine dans une certaine mesure. Ici, l&#39;activité nucléase peut être évaluée en utilisant l&#39;analyse par endonucléase de T7 ou une digestion de restriction des produits de PCR comme décrit dans la section 5 avant la synthèse de l&#39;ARNm et la micro-injection. Nous vous recommandons le séquençage de la région génomique d&#39;intérêt dans le respective lignée cellulaire et la souche de souris utilisée pour des expériences de micro-injection. En zygotes de souris, différentes paires Talen ou ZFN vont travailler de manière optimale à différentes concentrations d&#39;ARNm et donc la concentration optimale de travail de la nucléase ARNm microinjecté peuvent être déterminées expérimentalement. Selon la paire de nucléase, une concentration trop faible se traduira par aucun clivage alors trop élevé peut entraîner une létalité embryonnaire. En fonction de la paire de nucléase, nous avons eu du succès en utilisant des concentrations d&#39;ARNm totaux aussi faibles que 2 ng / pl et aussi élevées que 200 ng / ul. Ces effets sont difficiles à prédire, à partir des expériences en culture cellulaire et la concentration optimale de la nuclease à la fois pour la survie embryonnaire et la vitesse du locus cible de modification doit être déterminé de manière empirique. ZFN très actif ou TALEN peuvent cliver leur séquence cible au-delà du stade d&#39;une cellule de l&#39;embryon microinjecté et provoquer ainsi des motifs complexes de mutagenèse uned mosaïque dans fondateurs. Nous et d&#39;autres avons observé quatre trois ou plusieurs allèles mutés distincts en un seul fondateur (figure 5C). Ainsi, lors de l&#39;établissement d&#39;une nouvelle lignée de souris à partir de ces fondateurs, progéniture doit être soigneusement projeté par le séquençage de la présence de la mutation favorable depuis les essais de digestion fournissent des preuves seulement qu&#39;une mutation undefined est présent. Une des critiques souvent exprimé contre les systèmes ZFN et Talen est la possibilité que ces nucléases sont également capables de cliver des séquences présentes ailleurs dans le génome qui sont similaires à des sites cibles. Ces effets hors-cible ont été observées avec des réactifs de première génération utilisant le domaine homodimérique de Fokl, et des constructions hétérodimères ont été conçus pour atténuer les effets hors-cible 25. Réduction des sites cibles potentiels peuvent être prédits dans une certaine mesure in silico 32,33 et criblés par PCR et séquençage. Un avantage évident of utilisant ZFNs TALENs et pour générer des souris plutôt que des lignées cellulaires est la possibilité de retirer hors mutations cibles non liées à la modification du génome désiré en effectuant plusieurs croisements en retour à une souche de type sauvage de choix. Pour l&#39;analyse d&#39;un grand nombre de souris fondatrices de la prochaine génération de profondeur séquençage des produits de PCR générés à partir du locus de nucléase ciblée et in silico prédites hors cible loci pourrait offrir une lecture qualitative et quantitative alternative aux essais de digestion des produits de PCR. Les techniques de procréation assistée décrites dans ce protocole sont optimisés pour les souches de souris standard utilisés pour des expériences de micro-injection telles que C57BL/6J ou B6D2F1. Souris d&#39;origines différentes, telles que les souches non consanguins, peuvent en principe être utilisés pour les approches d&#39;édition du génome et pourraient fournir une base génétique plus approprié pour des questions de recherche spécifiques. La performance des techniques de procréation assistée, comme la superovulation peut être prédicatDECT pour un certain nombre de souches 34-36 mais peut nécessiter une optimisation plus poussée des souches atypiques afin d&#39;obtenir un nombre suffisant d&#39;embryons pour la nucléase microinjection. Outre ZFN et TALEN, nouvelles nucléases de créateurs tels que le système CRISPR/Cas9 ARN-guidée 9,37,38 ont été mis en place pour les applications d&#39;édition du génome. Tous les procédés de la micro-injection et l&#39;analyse des animaux fondateurs décrits ici sont également applicables à CRISPR/Cas9 et futurs modes d&#39;édition de génome.

Les souris sont de loin la plateforme la plus populaire pour générer des modèles animaux transgéniques. La boîte à outils polyvalente pour le génie génétique de l&#39;embryon de souris 1-3 a récemment été étendu par des approches d&#39;édition du génome sur la base de nucléases de créateurs tels que nucléases à doigts de zinc (ZFN) 4-6, transcription nucléases effectrices activateur comme (Talen) 7,8, et les répétitions groupées régulièrement espacées courts palindromiques (CRISPR) / système CRISPR-associé (Cas) 9 9. ZFN et la fonction TALEN par paires de deux domaines sur mesure à base de protéines liant l&#39;ADN (arrays de protéines à doigts de zinc et répéter variable di-résidus (DRV), respectivement) qui sont couplés chacun à l&#39;endonucléase Fokl 10-12. En revanche, la spécificité du clivage médié Cas9 d&#39;ADN est fourni par transactiver ARN CRISPR (crRNA et tracrRNA, qui peuvent également être combinées en une seule molécule d&#39;ARN chimérique d&#39;ARN de guidage appelé) 11 qui agissent dans un complexe avec l&#39;protéine de CRISPR. TALENs avec une séquence définie de DRV peut être construit rapidement par les expérimentateurs individuels avec une multitude de stratégies de montage au choix de 13 à 17. CRISPR/Cas9 promet encore moins génération de main-d&#39;œuvre des nucléases de créateurs, mais la spécificité de guidage ARN-ADN de liaison n&#39;est pas encore complètement résolu 18,19. Génération de mesure ZFNs a jusqu&#39;ici été limitée à des laboratoires universitaires spécialisés et de fournisseurs commerciaux tels que Sangamo Biosciences et le service Sigma CompoZr. En général, génome édition avec des nucléases de créateurs vise à introduire des cassures double brin (DSB) à des loci génomiques défini, qui attirent ensuite fin non homologue rejoindre (NHEJ) ou recombinaison homologue (RH) des mécanismes de réparation d&#39;ADN 10,12. Réparation NHEJ médiée par une DSB se traduit souvent par l&#39;introduction d&#39;insertions et de suppressions à proximité immédiate de l&#39;emplacement de la réparation. Ainsi NHEJ réparation cun être exploitées pour assommer la fonction d&#39;un gène cible par introduction d&#39;une mutation décalage de cadre à l&#39;intérieur de la gènes codant pour une protéine séquence 4,7,9. En variante, l&#39;addition ou le remplacement de l&#39;information génétique définie peuvent être atteints par la fourniture d&#39;un donneur d&#39;ADN avec les nucleases de luxe. Un donneur d&#39;ADN comprend des séquences d&#39;ADN enquêteur conçu flanquées de régions d&#39;homologie avec le locus cible, servant ainsi de modèle pour la réparation des CDB par les RH. Les deux plasmides 5,6,20 et oligonucléotides simple brin 8,9,21 ont été utilisés avec succès en tant que donateurs. Ni NHEJ-nor édition de génome HR médiée nécessitent l&#39;introduction d&#39;un marqueur sélectionnable dans le génome de l&#39;embryon de souris, ce qui rend ces stratégies particulièrement bien adapté pour la création de petites modifications dans la séquence de nucleotides sans perturber l&#39;architecture génétique globale. Dans ce protocole, nous décrivons toutes les procédures essentielles pour l&#39;édition du génome dans leembryon de souris à l&#39;aide TALENs. Il s&#39;agit notamment 1) l&#39;identification d&#39;un site TALEN cible 22, 2) la construction de TALENs par golden gate clonage 13, 3) la synthèse in vitro de TALEN ARNm, 4) la micro-injection de TALEN ARNm dans des ovocytes fécondés de souris, 5) les procédures chirurgicales pour le transfert d&#39;embryons et 6) l&#39;analyse de la mutagenèse induite dans TALEN animaux fondateurs. Nous nous concentrons sur TALEN ARNm micro-injection et le dépistage des fondateurs de NHEJ induites insertions / suppressions. A cet effet, nous avons généré des constructions bifonctionnelles Talen qui permettent à la fois l&#39;expression dans des cellules de mammifères transfectées lorsque que des plasmides et dans la synthèse in vitro d&#39;ARNm TALEN pour micro-injection dans des embryons de souris. Ces constructions comprennent un squelette de CONTE tronqué 23 fusionnée à hétérodimère Fokl Domaines 24,25 pour l&#39;édition du génome optimale dans les cellules de mammifères. Ce protocole peut également être adopté pour la microinjection d&#39;autres nucléases de luxe ou pour préparations injectables combinés des nucléases de créateurset les constructions de donateurs (conception des bailleurs de fonds de l&#39;ADN a été décrit dans d&#39;excellentes publications techniques par Wefers et al. 26,27). Déclaration éthique Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements de l&#39;Office vétérinaire cantonal du canton de Zurich.

<table><tbody><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535S ou L</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S ou L</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>Sigma</td><td>S0692-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase sans danger pour les plasmides</td><td>Epicentre</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>NucAway Colonnes de centrifugation</td><td>Invitrogen</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Formaldyde Load Dye</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td></td></tr><tr><td>RNA Millennium Markers</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE tampon</td><td>Thermo Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>T7 endonucléase</td><td>NEB</td><td>M0302S ou L</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T EasyVector System I</td><td>Promega</td><td>A3600</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>jument gestante&#039 ; s gonadotrophine sérique (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td></td></tr><tr><td>gonadotrophine chorionique humaine (hCG)</td><td>Sigma</td><td>CG5</td><td></td></tr><tr><td>M2 milieu de culture d’embryons</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 milieu de culture d’embryons</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale, testée sur les embryons</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>CentraVet</td><td>Ket 201</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46995</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment/Tools</td></tr><tr><td>Microscope inversé avec optique Nomarski DIC (par exemple Nikon Eclipse TE200)</td><td></td>Unités de micromanipulateur Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>(par exemple Narishige, NT88NF)</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryo holding capillaires</td><td>Sutter Instruments</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires d’injection d’embryons</td><td>Narishige</td><td>GD-1</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur capillaire (par exemple Sutter P97)</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge (par exemple Narishige MF-900)</td>Ciseaux cutanés <td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Walton</td><td>FST</td><td>14077-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>FST</td><td>14041-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonde chirurgicale</td><td>FST</td><td>10140-03</td><td></td></tr><tr><td>Système de pince à plaie réflexe (9 mm)</td><td>FST</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Pince à réflexion (9 mm)</td><td>FST</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine Dumont 5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pince courbe Moria</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine Moria</td><td>FST</td><td>11399-80</td><td></td></tr><tr><td>Dietrich bulldog clamp</td><td>FST</td><td>18038-45</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J souris</td><td>Jackson Labs</td><td>code de souche 000664</td><td></td></tr><tr><td>souris CD-1</td><td>Charles River</td><td>code de souche 000664</td><td></td></tr></tbody></table>

souris ingénierie des génomes utilisation nucléases de créateurs

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Les souris transgéniques portant des modifications spécifiques au site génome (knock-out, knock-in) sont d&#39;une importance vitale pour disséquer les systèmes biologiques complexes ainsi que pour la modélisation des maladies humaines et tester des stratégies thérapeutiques. Les avancées récentes dans l&#39;utilisation des nucléases de créateurs tels que nucléases à doigts de zinc (de ZFNs), transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens), et les répétitions palindromiques courts régulièrement espacées cluster (CRISPR) / CRISPR-associé (Cas) 9 système pour le site- l&#39;ingénierie des génomes spécifique ouvrir la possibilité d&#39;effectuer la modification ciblée du génome rapide dans pratiquement toutes les espèces de laboratoire sans la nécessité de s&#39;appuyer sur cellules souches embryonnaires (ES) de la technologie cellulaire. Une expérience d&#39;édition de génome commence typiquement avec identification de concepteur nucléase sites cibles au sein d&#39;un gène d&#39;intérêt, suivi par la construction de domaines de liaison à l&#39;ADN mesure de diriger l&#39;activité nucléase de l&#39;investigateur locus génomique définie. Plasmides designer de nucléase sont in vitro &lt;/ Em&gt; transcrit pour produire l&#39;ARNm pour la microinjection d&#39;ovocytes fécondés de souris. Ici, nous fournissons un protocole pour la réalisation de la modification génomique ciblée par injection directe de TALEN ARNm dans des ovocytes de souris fécondés.

Nous avons construit des plasmides de destination compatibles avec l&#39;ensemble d&#39;Or GateTALEN publié par Cermak et al. Qui 13 permettent l&#39;expression de TALENs dans des cellules de mammifères, ainsi que la synthèse d&#39;ARNm in vitro à partir du promoteur du phage T7 (figure 1C). Ces plasmides portent les domaines de FokI hétérodimères (ELD ou KKR mutations) qui ont été montrés pour réduire les effets hors-cible par rapport à des homodimères FokI et pour améliorer l&#39;activité de clivage par rapport à la première génération Fokl hétérodimères 25,29. Réactions Golden Gate de montage n ° 1 et n ° 2 sont généralement très efficace et chaque colonie blanche, lorsqu&#39;on l&#39;analyse par PCR sur colonie, montre l&#39;évolution attendue pour le nombre particulier de DRV clonés (figures 1B et 1D). L&#39;analyse sur gel de synthèse in vitro de l&#39;ARNm (figure 2) doit faire apparaître une seule bande distinguable avec peu ou pas de frottis pour chaque échantillon analysé. Il devrait y avoir un changement de taille claire entre les échantillons L1/R1 et L2/R2, L3/R3, qui indique polyadénylation succès. animaux fondateurs peuvent être criblés pour des allèles mutés NHEJ-induites en utilisant le génotypage par PCR suivie soit digestion T7 endonucléase (Figure 3) ou une digestion de restriction en utilisant une enzyme qui clive la séquence de type sauvage au sein de la région d&#39;espacement de la paire de nuclease (figure 4). L&#39;analyse par endonucléase de T7 est applicable à n&#39;importe quel type de mutation, indépendamment de la séquence génomique spécifique à l&#39;intérieur de la région d&#39;espacement de la paire de nucléases injecté; Cependant, il ne détecte que les inadéquations entre les brins d&#39;ADN dans les produits de PCR heteroduplexes. Ainsi, dans les rares cas où l&#39;un des fondateurs porteur de deux allèles mutés de manière identique, les produits de PCR ne montrer aucun modèle T7 de digestion. Une telle distinction est cependant toujours possible quand un site de restriction spécifique est situé à l&#39;intérieur de la région d&#39;espaceur de nucléase qui sera éliminé par NHEJInduite par des insertions / délétions (figure 5). Ici, les bandes non digérés indiquent la présence de mutations, et l&#39;absence de produits digérés suggère fortement l&#39;un des fondateurs portant des mutations dans les deux allèles du gène ciblé (marquées par des astérisques dans la figure 4b). <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> Figure 1. Golden Gate clonage de Talen DRV en hétérodimères vecteurs pCAG-T7-Destination. A) Assemblée des tableaux DRV dans des vecteurs UFP. Voici un exemple est montré pour une paire TALEN avec des tableaux de fées individuelles comprenant 15 DRV et 17 DRV, respectivement (pour les tableaux de CONTE plus de 21 DRV, trois ensembles UFP-DRV sont nécessaires, non représenté). Les flèches indiquent les amorces pour B) produits PFUS spécifique réactions de PCR de colonie de PCR.amplifié à partir des ensembles de PFU correctes montrent généralement une bande correspondant à la longueur combinée de toutes les DRV clonés (par exemple environ 1,1 ko pour 10 DRV) et une «échelle» de petits groupes moins importants en raison de la nature répétitive des tableaux DRV. C) L&#39;assemblage final de tableaux UFP-DRV et un plasmide contenant la dernière répétition (PLR) dans hétérodimères vecteurs d&#39;expression Talen avec des variantes, respectivement FokIELD et FokIKKR. Le squelette TALEN (annoté comme N et C) ressemble à l&#39;architecture publié par Miller et al. 23 Le promoteur CAG (CMV élément activateur précoce / chicken beta-actine) assure des niveaux d&#39;expression élevés dans des cellules de mammifère transfectées, tandis que le promoteur du phage T7 permet en synthèse in vitro d&#39;ARNm (utiliser Sacl pour la linéarisation du vecteur en aval de la nucléase codon STOP). D) Colony PCR utilisant des amorces indiquées par les flèches dans C) permet d&#39;identifier correctement assemblé TALENs. Full-lengtproduits h PCR sont souvent moins important tandis que l &#39;«effet d&#39;échelle» représente un indicateur robuste de réunion réussie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> Figure 2. . contrôle de la qualité de la nucléase ARNm dans la synthèse in vitro en utilisant une électrophorèse sur gel d&#39;agarose ARNm ZFN sont présentées à titre d&#39;exemple (L, gauche ZFN, R, droit ZFN). Échantillons L1/R1 montrent ARNm avant polyadénylation, des échantillons L2/R2 spectacle ARNm polyadénylé et L3/R3 montrer ARNm polyadénylé purifié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img<html> alt = &quot;Figure 3&quot; fo: contenu width = &quot;6 po&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figure 3. Exemple de test d&#39;endonucléase de T7 utilisé pour l&#39;identification des animaux fondateurs portant des mutations induites par la nuclease du locus cible. A) Une paire TALEN a été conçu pour cliver l&#39;intérieur de la région codante du gène de la protéine prion de souris (Prnp, TALEN séquence cible peut être fourni sur demande). Un produit de PCR est généré en utilisant une amorce sens (F) situé à 110 pb en amont et une amorce antisens (R) de 250 pb en aval du site de clivage TALEN. B) Le produit de PCR est ensuite soumis à heteroduplex formation et T7 digestion par une endonucléase. C) TALEN mutagenèse induite à l&#39;intérieur de la région génomique ciblée des fondateurs simples est révélée par la présence d&#39;un produit de PCR de pleine longueur avec des produits de digestion de 250 et 110 pb.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> Figure 4. Exemple d&#39;une digestion de restriction des produits de PCR utilisées pour l&#39;identification des animaux fondateurs portant des mutations induites par la nuclease du locus cible. Spécifiques ZFN pour la souris Rosa26 locus 29 cible un site de restriction XbaI au sein de l&#39;intron 1. A) Les fondateurs ont été criblés par génotypage par PCR en utilisant une amorce avant (F) situé à 500 pb en amont et une amorce antisens (R) de 250 pb en aval du site de clivage. B) La digestion des produits de PCR avec Xbal révèle schémas de digestion indiquant les souris avec des mutations bi-alléliques (repérées par des astérisques), mono alléliques mutations (bandes digérés et non digérés, par exemple animale 2)et souris en poids (digestion complète, par exemple, un animal 21). C) Ordonnancement des souris avec des modifications bi-allélique potentiels montre jusqu&#39;à 3 (24) animaux distincts insertions / suppressions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nom de Primer </td><td> Séquence 5 &#39;à 3&#39; </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Séquences d&#39;amorces utilisées pour PCR et séquençage des colonies dans l&#39;ensemble du Golden Gate TALENprotocole. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Plasmide / Collection </td><td> Collaborateur </td><td> Addgene ID </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Golden Gate TALEN et TAL effecteur Kit 2.0 </td><td> Voytas laboratoire </td><td> 1000000024 </td><td> Contient tous les plasmides nécessaires à l&#39;assemblage Golden Gate TALEN </td></tr><tr><td> pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD vecteurs de destination </td><td> Pelczar laboratoire </td><td> 40131, 40132 </td><td> Add-on plasmides pour l&#39;expression TALEN dans les cellules de mammifères et de la synthèse de l&#39;ARNm in vitro </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Les plasmides et les collections de plasmides nécessaires à l&#39;assemblage Golden Gate TALEN peuvent être obtenus auprès Addgene ( <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> En ligneRessource </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> Conception de TALEN; TALEN prévision hors cible </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> Conception de TALEN, OPEN ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> Conception de TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 prévision hors cible </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> Assemblée de TALEN séquences pour la confirmation des résultats de séquençage </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> Conception d&#39;assemblage modulaire ZFN </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> Conception d&#39;assemblage modulaire ZFN </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Ressources en ligne pour la conception ZFN, TALEN, et CRISPR/Cas9. </strong&gt;

nucléases de créateurs tels que nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) peuvent être utilisés pour modifier le génome d&#39;embryons de pré-implantation de souris en déclenchant à la fois la fin non homologue rejoindre (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH) des voies. Ces progrès permettent la génération rapide de la souris avec des modifications génétiques précises.

Souris ingénierie des génomes Utilisation nucléases de créateurs

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

L’objectif global de cette procédure est de générer rapidement des souris déficientes en gènes à l’aide de nucléases ou de serres de queue. Ceci est accompli en concevant et en assemblant d’abord des constructions d’ADN codant pour des paires de talons spécifiques, qui servent de modèles pour la transcription in vitro afin de générer des ARNm Talon. Les prochaines étapes de la procédure consistent à isoler les cytes de souris fécondés, puis à les micro-injecter avec le T.La dernière étape consiste à transférer chirurgicalement les cytes injectés dans les mères adoptives pseudo enceintes.La descendance F zéro qui en résulte présente fréquemment des délétions spécifiques au site de séquences génomiques qui entraînent souvent la perte de la fonction du gène cible. Bien que la méthode présentée ici puisse donner un aperçu de la fonction des gènes chez la souris, l’approche de base peut également être adaptée à d’autres organismes modèles tels que les rats et les poissons. Tout d’abord, accédez au site Web du cibleur de nucléotides effecteurs TAL sur le site.Choisissez le programme de ciblage TN et collez-le dans la séquence du gène cible. Pour ce protocole. Utilisez les sept constructions d’expression de TALEN P-C-A-G-T et le kit d’effecteur Talen et T de la porte dorée qui sont disponibles sur le gène ad.Si d’autres constructions ou kits d’assemblage sont utilisés pour Talen, les paramètres d’assemblage peuvent être différents pour la longueur d’espacement optimale et le nombre de VR de queue, choisissez l’option Miller Etal 2011 sous le paramètre d’utilisation d’une architecture prédéfinie. Sélectionnez ensuite NN sous l’onglet Substitut G. Le programme génère un fichier texte avec les sites cibles potentiels générés à partir de cette liste.Sélectionnez la ou les paires Talen requises et procédez à l’assemblage du Golden gate. Ce protocole fonctionne avec les souches de souris de laboratoire les plus couramment utilisées, y compris C 57 BL six J et BDF un super ovulat 10 femelles donneuses à l’âge de quatre semaines en utilisant une injection intrapéritonéale de cinq unités de gonadotrophine sérique de jument gravide. 48 heures plus tard, donnez aux femelles cinq unités de gonadotrophine chorionique humaine également par injection intrapéritonéale immédiatement après l’injection de gonadotrophine chorionique humaine partenaire, les femelles en tête-à-tête avec des mâles en âge de se reproduire le même jour, préparez les mères adoptives pseudo enceintes. Autrui.Le lendemain matin, sacrifiez les femelles et récupérez les ovocytes fécondés en disséquant les ucts. Relâchez ensuite les griffes d’ovocytes dans une boîte de culture d’organes contenant un millilitre de milieu M deux. Retirez toutes les cellules du cumulus en ajoutant 10 microlitres de solution d’hyaluronidase bovine à 0,1 % dans une boîte contenant des couvées de cytes dans un milieu M deux.Ensuite, utilisez la pipette buccale pour laver les embryons à travers deux ou trois changements de milieu M deux pour éliminer l’hyaluronidase. Poursuivre le traitement à la hyaluronidase pour les embryons qui ne se sont pas encore dissociés des cellules des cumulus. Les embryons isolés peuvent être conservés dans du M 16, un milieu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’ils soient micro-injectés.Préparez 100 microlitres de solution d’injection contenant 10 nanogrammes par microlitre de chaque queue. Nucléase, ARNm, appariement et centrifugation pendant 30 minutes à 30 000 g de granulés. Toutes les particules susceptibles d’obstruer les aiguilles d’injection.Gardez ensuite le mélange sur de la glace. Prévoyez d’injecter les ovocytes à leur stade pronucléaire en début d’après-midi. Immergez environ 100 embryons dans un milieu M deux sous une couche d’huile minérale et travaillez sur un microscope inversé sans optique DIC marsy.Sous un grossissement de 20 x, sélectionnez des cytes avec des pronoyaux distincts. Le tri des ovocytes peut être effectué à l’aide d’une charge capillaire d’injection vide, le capillaire d’injection juste avant son utilisation avec un à deux microlitres de la solution d’injection. Fixez-le ensuite à la tête de micro-injection.Ensuite, aspirez un cyte sélectionné avec un capillaire de maintien et faites une injection peu profonde de l’ARNm de la nucléase dans le cytoplasme. Eviter le contact avec les pronoyaux. Le volume d’injection doit être maintenu à un faible niveau.Au premier signe de distension cytoplasmique, retirez l’aiguille. Normalement, environ 80 à 90 % des embryons devraient survivre sans survie. Pour augmenter la quantité d’ARNm injectée, rendez la solution plus concentrée après la micro-injection des cytes disponibles.Transférez-les dans un milieu M 16 à l’aide d’une pipette à bouche. Incuber les embryons pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Transférez ensuite celles qui survivent dans des mères adoptives pseudo enceintes.La veille de la micro-injection induisent une pseudo grossesse chez des souris femelles CD âgées de trois à six mois en les accouplant à des mâles sectorisés par AV. Le lendemain matin, choisissez des femelles avec un bouchon transparent pour les utiliser comme receveuses d’embryons. Les femelles inutilisées retourneront de leur état pseudo-gestation en trois semaines et peuvent être réutilisées par la suite.Placez une mère d’accueil anesthésiée sur une surface chaude sur son abdomen. Ensuite, désinfectez la zone de l’incision en la vaporisant avec de l’éthanol à 70 %. Peignez les cheveux mouillés loin du site d’incision prévu.Maintenant, ouvrez la cavité péritonéale avec des ciseaux et extériorisez la corne utérine. Pour ce faire. Tirez sur le coussinet adipeux attaché à l’ovaire et immobilisez les organes reproducteurs à l’aide d’une pince bouledogue.Assurez-vous également de garder les organes humides avec une solution réchauffée de chlorure de sodium à 0,9 %. À ce stade, triez 12 à 20 embryons viables et chargez-les dans un mince capillaire de verre. À l’aide de la pipette buccale, aspirez d’abord une petite bulle d’air, puis aspirez les embryons à l’aide de pinces fines.Saisissez doucement l’UCT juste en amont de l’ampli et créez un petit trou dans la paroi de l’UCT à l’aide d’une aiguille de calibre 30. Insérez le capillaire chargé dans le trou et soufflez doucement les embryons dans l’ampli jusqu’à ce que vous voyiez que la bulle d’air a été déplacée du capillaire. Retirez ensuite le capillaire.Replacez immédiatement les organes reproducteurs dans la cavité corporelle et fermez la cavité péritonéale avec une seule suture. Ensuite, fermez la peau à l’aide d’une ou deux pinces de bobinage de neuf millimètres. Remettez l’animal dans sa cage d’origine et surveillez-le jusqu’à ce que l’anesthésie se dissipe.Ensuite, hébergez les femelles dans des groupes sociaux stables de deux à trois souris pour minimiser le stress pendant les trois premiers jours postopératoires, assurez-vous de fournir un analgésique comme DEF Falcon dans l’eau potable pour chaque criquet dans le génome de la souris qui est ciblé avec des nucléases de conception. Un test basé sur la PCR est conçu pour identifier les animaux fondateurs porteurs d’un allèle muté souhaité. Dans le premier exemple, les fondateurs proviennent de la micro-injection d’une paire de nucléases de queue.Ciblant la région d’enrobage du gène de la protéine prion de souris a été analysé par digestion d’endonucléases T sept d’un produit PCR. Le test de digestion de l’endonucléase T sept repose sur la formation d’hétéro-duplex entre les brins d’ADN des produits PCR générés à partir d’allèles mutés et de type sauvage. La mutagenèse induite par Talon dans la région génomique ciblée des fondateurs uniques a été révélée par l’apparition de produits de digestion longue appariés à 250 et 110 bases en plus du produit de PCR complet.Alternativement, les produits PCR peuvent être soumis à un résumé de restriction si un site de restriction diagnostique approprié est situé dans la région d’espacement de la paire de nucléases conceptrices. Dans le deuxième exemple, ZFN cible un site de restriction XPO un situé dans l’intro, l’un des locus de la souris Rosa 26. Ici, des bandes non digérées indiquent la présence de mutations.Les astérisques marquent, l’absence de tout produit digéré suggérant fortement un fondateur porteur de mutations dans les deux allèles du gène ciblé. Le clonage et le séquençage de ces produits PCR non digérés révèlent que les souris fondatrices peuvent héberger deux ou plusieurs modifications distinctes de l’allèle ciblé. L’absence de séquences de type sauvage indique l’ablation complète du gène cible.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception des nucléases de la queue, de l’assemblage de la queue, des constructions de nucléases et de la façon de les utiliser pour générer des souris mutantes par micro-injection directe d’oside. Cette méthode peut être adaptée pour fonctionner avec d’autres classes de nucléases concepteurs, telles que le zinc, les nucléis de doigt ou le CAS nine crispr. Il peut également faciliter la modification du génome par recombinaison homologue par co-injection simultanée de la nucléase et du modèle de ciblage génique approprié.

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