Souris ingénierie des génomes Utilisation nucléases de créateurs

L’objectif global de cette procédure est de générer rapidement des souris déficientes en gènes à l’aide de nucléases ou de serres de queue. Ceci est accompli en concevant et en assemblant d’abord des constructions d’ADN codant pour des paires de talons spécifiques, qui servent de modèles pour la transcription in vitro afin de générer des ARNm Talon. Les prochaines étapes de la procédure consistent à isoler les cytes de souris fécondés, puis à les micro-injecter avec le T.La dernière étape consiste à transférer chirurgicalement les cytes injectés dans les mères adoptives pseudo enceintes.

La descendance F zéro qui en résulte présente fréquemment des délétions spécifiques au site de séquences génomiques qui entraînent souvent la perte de la fonction du gène cible. Bien que la méthode présentée ici puisse donner un aperçu de la fonction des gènes chez la souris, l’approche de base peut également être adaptée à d’autres organismes modèles tels que les rats et les poissons. Tout d’abord, accédez au site Web du cibleur de nucléotides effecteurs TAL sur le site.

Choisissez le programme de ciblage TN et collez-le dans la séquence du gène cible. Pour ce protocole. Utilisez les sept constructions d’expression de TALEN P-C-A-G-T et le kit d’effecteur Talen et T de la porte dorée qui sont disponibles sur le gène ad.

Si d’autres constructions ou kits d’assemblage sont utilisés pour Talen, les paramètres d’assemblage peuvent être différents pour la longueur d’espacement optimale et le nombre de VR de queue, choisissez l’option Miller Etal 2011 sous le paramètre d’utilisation d’une architecture prédéfinie. Sélectionnez ensuite NN sous l’onglet Substitut G. Le programme génère un fichier texte avec les sites cibles potentiels générés à partir de cette liste.

Sélectionnez la ou les paires Talen requises et procédez à l’assemblage du Golden gate. Ce protocole fonctionne avec les souches de souris de laboratoire les plus couramment utilisées, y compris C 57 BL six J et BDF un super ovulat 10 femelles donneuses à l’âge de quatre semaines en utilisant une injection intrapéritonéale de cinq unités de gonadotrophine sérique de jument gravide. 48 heures plus tard, donnez aux femelles cinq unités de gonadotrophine chorionique humaine également par injection intrapéritonéale immédiatement après l’injection de gonadotrophine chorionique humaine partenaire, les femelles en tête-à-tête avec des mâles en âge de se reproduire le même jour, préparez les mères adoptives pseudo enceintes. Autrui.

Le lendemain matin, sacrifiez les femelles et récupérez les ovocytes fécondés en disséquant les ucts. Relâchez ensuite les griffes d’ovocytes dans une boîte de culture d’organes contenant un millilitre de milieu M deux. Retirez toutes les cellules du cumulus en ajoutant 10 microlitres de solution d’hyaluronidase bovine à 0,1 % dans une boîte contenant des couvées de cytes dans un milieu M deux.

Ensuite, utilisez la pipette buccale pour laver les embryons à travers deux ou trois changements de milieu M deux pour éliminer l’hyaluronidase. Poursuivre le traitement à la hyaluronidase pour les embryons qui ne se sont pas encore dissociés des cellules des cumulus. Les embryons isolés peuvent être conservés dans du M 16, un milieu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’ils soient micro-injectés.

Préparez 100 microlitres de solution d’injection contenant 10 nanogrammes par microlitre de chaque queue. Nucléase, ARNm, appariement et centrifugation pendant 30 minutes à 30 000 g de granulés. Toutes les particules susceptibles d’obstruer les aiguilles d’injection.

Gardez ensuite le mélange sur de la glace. Prévoyez d’injecter les ovocytes à leur stade pronucléaire en début d’après-midi. Immergez environ 100 embryons dans un milieu M deux sous une couche d’huile minérale et travaillez sur un microscope inversé sans optique DIC marsy.

Sous un grossissement de 20 x, sélectionnez des cytes avec des pronoyaux distincts. Le tri des ovocytes peut être effectué à l’aide d’une charge capillaire d’injection vide, le capillaire d’injection juste avant son utilisation avec un à deux microlitres de la solution d’injection. Fixez-le ensuite à la tête de micro-injection.

Ensuite, aspirez un cyte sélectionné avec un capillaire de maintien et faites une injection peu profonde de l’ARNm de la nucléase dans le cytoplasme. Eviter le contact avec les pronoyaux. Le volume d’injection doit être maintenu à un faible niveau.

Au premier signe de distension cytoplasmique, retirez l’aiguille. Normalement, environ 80 à 90 % des embryons devraient survivre sans survie. Pour augmenter la quantité d’ARNm injectée, rendez la solution plus concentrée après la micro-injection des cytes disponibles.

Transférez-les dans un milieu M 16 à l’aide d’une pipette à bouche. Incuber les embryons pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Transférez ensuite celles qui survivent dans des mères adoptives pseudo enceintes.

La veille de la micro-injection induisent une pseudo grossesse chez des souris femelles CD âgées de trois à six mois en les accouplant à des mâles sectorisés par AV. Le lendemain matin, choisissez des femelles avec un bouchon transparent pour les utiliser comme receveuses d’embryons. Les femelles inutilisées retourneront de leur état pseudo-gestation en trois semaines et peuvent être réutilisées par la suite.

Placez une mère d’accueil anesthésiée sur une surface chaude sur son abdomen. Ensuite, désinfectez la zone de l’incision en la vaporisant avec de l’éthanol à 70 %. Peignez les cheveux mouillés loin du site d’incision prévu.

Maintenant, ouvrez la cavité péritonéale avec des ciseaux et extériorisez la corne utérine. Pour ce faire. Tirez sur le coussinet adipeux attaché à l’ovaire et immobilisez les organes reproducteurs à l’aide d’une pince bouledogue.

Assurez-vous également de garder les organes humides avec une solution réchauffée de chlorure de sodium à 0,9 %. À ce stade, triez 12 à 20 embryons viables et chargez-les dans un mince capillaire de verre. À l’aide de la pipette buccale, aspirez d’abord une petite bulle d’air, puis aspirez les embryons à l’aide de pinces fines.

Saisissez doucement l’UCT juste en amont de l’ampli et créez un petit trou dans la paroi de l’UCT à l’aide d’une aiguille de calibre 30. Insérez le capillaire chargé dans le trou et soufflez doucement les embryons dans l’ampli jusqu’à ce que vous voyiez que la bulle d’air a été déplacée du capillaire. Retirez ensuite le capillaire.

Replacez immédiatement les organes reproducteurs dans la cavité corporelle et fermez la cavité péritonéale avec une seule suture. Ensuite, fermez la peau à l’aide d’une ou deux pinces de bobinage de neuf millimètres. Remettez l’animal dans sa cage d’origine et surveillez-le jusqu’à ce que l’anesthésie se dissipe.

Ensuite, hébergez les femelles dans des groupes sociaux stables de deux à trois souris pour minimiser le stress pendant les trois premiers jours postopératoires, assurez-vous de fournir un analgésique comme DEF Falcon dans l’eau potable pour chaque criquet dans le génome de la souris qui est ciblé avec des nucléases de conception. Un test basé sur la PCR est conçu pour identifier les animaux fondateurs porteurs d’un allèle muté souhaité. Dans le premier exemple, les fondateurs proviennent de la micro-injection d’une paire de nucléases de queue.

Ciblant la région d’enrobage du gène de la protéine prion de souris a été analysé par digestion d’endonucléases T sept d’un produit PCR. Le test de digestion de l’endonucléase T sept repose sur la formation d’hétéro-duplex entre les brins d’ADN des produits PCR générés à partir d’allèles mutés et de type sauvage. La mutagenèse induite par Talon dans la région génomique ciblée des fondateurs uniques a été révélée par l’apparition de produits de digestion longue appariés à 250 et 110 bases en plus du produit de PCR complet.

Alternativement, les produits PCR peuvent être soumis à un résumé de restriction si un site de restriction diagnostique approprié est situé dans la région d’espacement de la paire de nucléases conceptrices. Dans le deuxième exemple, ZFN cible un site de restriction XPO un situé dans l’intro, l’un des locus de la souris Rosa 26. Ici, des bandes non digérées indiquent la présence de mutations.

Les astérisques marquent, l’absence de tout produit digéré suggérant fortement un fondateur porteur de mutations dans les deux allèles du gène ciblé. Le clonage et le séquençage de ces produits PCR non digérés révèlent que les souris fondatrices peuvent héberger deux ou plusieurs modifications distinctes de l’allèle ciblé. L’absence de séquences de type sauvage indique l’ablation complète du gène cible.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception des nucléases de la queue, de l’assemblage de la queue, des constructions de nucléases et de la façon de les utiliser pour générer des souris mutantes par micro-injection directe d’oside. Cette méthode peut être adaptée pour fonctionner avec d’autres classes de nucléases concepteurs, telles que le zinc, les nucléis de doigt ou le CAS nine crispr. Il peut également faciliter la modification du génome par recombinaison homologue par co-injection simultanée de la nucléase et du modèle de ciblage génique approprié.