Name: La production de lapins de Knockout apolipoprotéine C-III à laide de zinc nucléases doigt (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Découvrez la production de lapins knockout Apolipoprotéine C-III par nucléases à doigts de zinc pour la recherche cardiovasculaire. Cette méthode avancée permet d'étudier les maladies cardiaques humaines.

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Ce travail a été partiellement financé par des subventions des Instituts nationaux de la santé (HL105114, HL088391, NS066652, et HL068878 à la SEY), l&#39;American Heart Association (National Scientifique développement 0835237N à JZ). YEC est soutenu financièrement doté Frederick Huetwell professeur de médecine cardiovasculaire à l&#39;Université de Michigan Medical Center (UMMC). Ce travail utilise Core Services pris en charge par Centre pour les modèles avancés pour sciences translationnelle et Therapeutics (CAMTraST) à UMMC.

Toutes les procédures d&#39;entretien des animaux, entretien et utilisation ont été examinés et approuvés par le Comité de l&#39;Université sur l&#39;utilisation et l&#39;entretien des animaux de l&#39;Université du Michigan. Une. ZFN conception et de choix <ol><li> Fournir les informations de séquence génomique du gène d&#39;intérêt (par exemple lapin ApoCIII) au fabricant. Sélectionner ensemble (s) ZFN pour les expériences basées sur les scores ZFN. </li></ol> 2. Lapin embryon Collection <ol><li> Superovulate mûri sexuellement (6-18 mois) Nouvelle-Zélande White (NZB) Les lapines par voie sous-cutanée (sc) injection de FSH deux fois / jour avec une dose de 3 mg pour les deux premières injections, 5 mg pour les deux prochaines injections et 6 mg pour les deux dernières injections. </li><li> Administrer une seule administration intraveineuse (iv) l&#39;injection de 200 UI de hCG à 72 h après la première injection de FSH pour induire l&#39;ovulation. Compagnon les femelles superovulées avec un lapin mâle immédiatement après l&#39;injection d&#39;hCG. </li><li> Euthanize Les lapins donateurs superovulées avec du pentobarbital de sodium (150 mg / kg, iv) à 16-18 heures après l&#39;insémination (psi). </li><li> Récupérer les ampoules oviducte en recueillant soigneusement la structure des trompes de Fallope et les ovaires entiers. </li><li> Rincer chaque oviducte avec du milieu 10 ml de tampon HEPES de manipulation TCM 199 complété avec du sérum de veau fœtal à 10%, en injectant le fluide à partir de la fin de l&#39;utérus de l&#39;oviducte. Recueillir le milieu rincé à l&#39;ouverture des ovaires fin de l&#39;oviducte à une boîte de Pétri. </li><li> Observer et identifier les embryons récupérés dans le milieu traversé, laver les embryons à trois reprises dans le milieu de la manipulation, les garder dans le milieu de la manipulation à 38,5 ° C dans l&#39;air, et les observer sous un microscope stéréoscopique pour l&#39;apparition de la fécondation. Préparez-vous à la micro-injection sur des embryons au stade pronucléaire 19-21 h psi </li></ol> 3. Préparation de l&#39;ARNm de ZFN <ol><li> Purifier l&#39;ARNm résultant avant remise en suspension dans RNase 0,1 X TE (1 mM Tris-Cl pH8,0, 0,1 mM d&#39;EDTA). Mesurer la concentration de l&#39;ARNm et stocker à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer les ARNm codant ZFN paire (4-10 ng / ul dans une mMTris-Cl, EDTA 0,1 mM à pH 7,5), aliquote dans 10 flacons de pi. Conservez-les à -80 º C jusqu&#39;à utilisation. Avant la micro-injection, décongeler le flacon (s) de l&#39;ARN, et le garder sur la glace. </li></ol> 4. Embryon microinjection <ol><li> Préparer la plate-forme de micro-injection en plaçant une goutte de 5 ul de milieu de manipulation sur une lame d&#39;une chambre de puits qui a la chambre de milieu enlevé. Couvrir la baisse moyenne de l&#39;huile minérale et le placer sur la platine du microscope chauffée. </li><li> Placer la pipette de maintien (120 um de diamètre) dans le bras de support du micromanipulateur et le positionner dans la goutte de milieu de manipulation. </li><li> Fabriquer des micropipettes d&#39;injection en chauffant et en tirant des tubes capillaires en verre de borosilicate à un dispositif de traction micropipette. Charger l&#39;ARNm devant être injectée dans la pipette d&#39;injection. </li><li>Ouvrir l&#39;alimentation en air comprimé qui est relié à un micro-injecteur. </li><li> Placer la pipette d&#39;injection dans le support d&#39;injection, le mettre sur le micromanipulateur et le positionner dans la goutte de milieu de manipulation. </li><li> Configuration de la micro-injecteur, avec les paramètres proposés suivants: holdP = 2 psi, InjP = 20 psi, ClearP = 60 psi, Injtime = 1 sec, ce qui se traduira par un volume d&#39;injection de 1-5 pl. </li><li> Ouvrez la pointe de la pipette d&#39;injection en tapotant doucement contre la pipette de maintien. </li><li> Transfert d&#39;embryons (30-50) à la chute de micromanipulation sur la plate-forme. Utiliser la pipette de maintien pour saisir un embryon et aligner l&#39;aiguille d&#39;injection, l&#39;embryon et la pipette de maintien le long de l&#39;axe x. </li><li> Sous un grossissement de 400X, avancer la pipette d&#39;injection à travers l&#39;embryon. Veillez à ne pas le noyau. Une fois la membrane plasmique est percée, la pédale de pied presse à injecter. Après l&#39;injection, retirer l&#39;aiguille, relâchez l&#39;embryon. Répétez le processus pour tout lui restantbryons. </li><li> Laver les embryons injectés trois fois dans du milieu de culture d&#39;embryons, qui se compose d&#39;une solution saline équilibrée de Earle (EBSS) supplémenté avec acides aminés non essentiels (NEAA), des acides aminés essentiels (EAA), 1 mM de L-glutamine, du pyruvate 0,4 mM de sodium, et 10% FBS. </li><li> Incuber les embryons à 38,5 ° C dans 5% de CO 2 dans l&#39;air pendant 1-2 heures avant qu&#39;ils ne soient transférés chirurgicalement dans les trompes de Fallope d&#39;une NZB lapin synchronisé destinataire femelle (voir étape 5.1). En variante, les embryons de la culture jusqu&#39;à ce qu&#39;elles atteignent le stade de blastocyste avant d&#39;être utilisées pour la validation in vitro ou des essais. </li></ol> 5. Transfert d&#39;embryons <ol><li> Sélectionnez une lapine NZB 5-12 mois, en bonne santé, pesant environ. 4,0 de 5,0 kg comme animal receveur. Administrer gonadolibérine (GnRH) injection intramusculaire (im, 50 mcg / ml, 0,3 ml / animal) à l&#39;acquéreur au même point de temps avec que de l&#39;injection d&#39;hCG à l&#39;animal (s) donneur (voir l&#39;étape 2.2). </li&gt; <li> Après l&#39;achèvement de la micro-injection, la préparation du lapin de destinataire pour le transfert d&#39;embryon (normalement 16 à 24 heures après l&#39;injection de GnRH). Anesthésier le lapin avec 10-40 mg / kg de kétamine (im), et / ou l&#39;isoflurane vaporisé (2-4%) par inhalation. Protéger les yeux du lapin de séchage excessive par l&#39;application d&#39;une pommade ophtalmique stérile. Observer l&#39;animal jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement inconscient, c&#39;est à dire. ne répond pas aux réflexes de pédale; presser le coussinet plantaire est utilisé pour vérifier l&#39;absence de pédale réflexe qui est une indication de l&#39;anesthésie adéquate. </li><li> Raser l&#39;abdomen du lapin, laver avec de l&#39;antiseptique gommage, suivi d&#39;une solution antiseptique, et essuyez la zone rasée avec des éponges de gaze stériles. </li><li> Opérer dans des conditions stériles, enregistrer les signes vitaux du lapin bénéficiaire environ toutes les 15 minutes tout au long de l&#39;opération. </li><li> Transfert d&#39;embryons de 10 à 25 à un animal receveur, en fonction du nombre d&#39;embryons disponibles. </li><li> A la fin de l&#39;interventions chirurgicales, fermer la couche musculaire avec suture absorbable couché. Suturer la peau soit avec un fil de suture sous-cutanée à l&#39;aide suture absorbable ou avec de simples sutures de la peau à l&#39;aide de suture interrompues nonabsorable (par exemple en nylon monofilament ou similaire). </li><li> Gardez l&#39;animal au chaud et de le surveiller jusqu&#39;à ce que sa position sternale est atteint. </li><li> Surveillance de l&#39;animal tous les jours. Suivez les instructions du vétérinaire pour prendre soin de l&#39;animal. Administrer méloxicam (sc 1,0 mg / kg) pour soulager la douleur et / ou de réduire le fonctionnement de la fièvre de poste tous les jours si jugé nécessaire par le vétérinaire. </li><li> Retirer les sutures nonabsorable de la peau à environ 10-14 jours de fonctionnement après. </li></ol> 6. Détection de ZFN induit disruption génique <ol><li> Pour la validation in vitro, effectuer le génotypage des embryons cultivés in vitro. Lyse embryons individuels qui se sont développées à des stades morula / du blastocyste dans 5 ul solution de NP40 (1% de NP40 plus 1 ug / ml protéinase K dans Taq Buffer) De 0,5 à 1 heure à 55 ° C, et 10 min à 95 ° C. </li><li> Pour le génotypage de la descendance, de prélever des échantillons de peau d&#39;oreille de kits nouveau-nés, extraire l&#39;ADN génomique, et les utiliser comme modèles pour le séquençage PCR. Appliquer Kwik-Stop à la zone d&#39;échantillonnage après la collecte pour arrêter le saignement et réduire l&#39;inconfort. </li><li> Utiliser la lyse de l&#39;étape 6.2 ou 6.3 en tant que matrice pour la PCR en utilisant la Taq LA-PCR et paire d&#39;amorces, qui sont situés en amont (5&#39;-TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3 &#39;) et en aval (5&#39;-GCCAGGCCCACCCACGGAACAGC-3&#39;) du site cible ZFN . </li><li> Purifier les produits de la PCR et le séquençage avec l&#39;amorce de séquençage (5&#39;-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3 &#39;). </li><li> Identifier les échantillons de mutants en consultant la double courbe dans le diagramme de séquence autour du site de ciblage. Étiqueter ceux avec des courbes doubles comme «positive». </li><li> Cloner les produits de PCR «positifs» en vecteur de clonage TA, ramasser 10-20 clones, les inserts séquence, et de confirmer les mutations autour de la tsite argeting. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Dans le présent travail, cinq lapins ApoCIII KO ont été générés en utilisant la technologie ZFN. Auparavant, le seul rapport de la production de lapins GTT a également utilisé la technologie ZFN 18. Le présent travail a confirmé que ZFN est utile pour cibler efficacement les gènes chez les lapins. Dans la présente étude, le taux transgénique (positif kits / total né) is23.8% (5/21), qui est comparable à celle du précédent rapport ZFN chez les lapins (30,8%, 16/52) 18, et ceux qui ont déclaré d&#39;utiliser ZFN dans d&#39;autres espèces animales, y compris les poissons zèbre ont 19, 20 souris, les rats et les cochons 21 17. Ce taux est en effet plus élevée que les taux de nombreuses études de production classiques lapin transgénique, qui tombent normalement dans la plage de 5 à 20%. Par exemple, dans un effort pour produit ApoCIII lapins transgéniques par micro-injection d&#39;ADN classique, Ding et al. Obtenu trois fondateurs positifs sur 54 petits nés (5,6%) 22. Conformément aux résultats précédents, les mutations sur les sites de ciblage sont variables, y compris des délétions ou des insertions consistant nombre différent de bases (allant de 1 à 21 dans les cinq lapins KO). Sur la base de l&#39;information de séquence spécifique des animaux fondateurs, il est prévu qu&#39;au moins quatre (c.-à-. Ceux contenant Δ1, 1, 1, ou des mutations Δ20) aurait une perte de fonction de l&#39;ApoCIII. R-16 animaux avec Δ21 peut pas afficher la perte fonctionnelle, cette mutation est prévu pour que la perte de sept acides aminés de cause, mais pas un décalage du cadre de lecture. En fin de compte, les essais phénotypiques sont nécessaires pour déterminer si ces animaux fondateurs présentent vraiment la perte des fonctions ApoCIII. Aucun des cinq lapins KO générés dans la présente étude contiennent des modifications bialléliques. Il est intéressant, c&#39;est aussi le cas dans le précédent rapport de lapin ZFN. En revanche, lorsque le ciblage ZFNs α1 ,3-galactosyltransférase ont été appliquées à cochoncellules, la fréquence de ciblage d&#39;un seul allèle distance de 7 à 46%, à environ un tiers de mutations créant une seule étape biallélique défonçables 23. En accord avec cela, lorsque TALEN a été appliquée à des cellules de fibroblastes de porc, les modifications bialléliques ont été trouvés dans environ 15 à 40% des clones positifs totaux 14. Il est possible que le défaut de générer des lapins KO biallèles dans la présente étude peut indiquer une différence d&#39;espèce (c.-à-lapins vs porcs) pour une telle capacité de gène de la nucléase à base de ciblage. Il est, cependant, plus probable que ce soit simplement parce que le nombre de lapins KO découlant de ce projet est relativement faible. Nous croyons que ZFN est capable de générer des mutations bialleic chez les lapins, qui doivent être considérés comme un autre avantage potentiel de production de lapin GTT base ZFN. D&#39;autres expériences sont nécessaires pour confirmer cette capacité de ZFN chez les lapins. En conclusion, ce travail montre que ZGénique basée FN approche de ciblage est efficace dans la production de lapins KO. En particulier, nous avons généré cinq lapins ApoCIII KO avec un taux transgénique satisfaisante de 23,8%. Ces animaux sont censés fournir des informations plus pertinentes sur le rôle de cette protéine sur les métabolismes lipidiques chez les humains que les modèles de souris correspondant. Nous prédisons ciblage de gène à base de ZFN, ainsi que d&#39;autres technologies à base de nuclease tels que TALEN RGEN et, chez les animaux nonmurine facilitera considérablement le développement de nouveaux modèles animaux pour l&#39;étude de diverses maladies humaines. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" /> Figure 1. Diagramme de production de lapins à élimination directe en utilisant la technologie ZFN. La production de lapins à l&#39;aide de la technologie KO ZFN commence par la sélection du gène d&#39;intérêt. L&#39;information de séquence est fourni, ensembles ZFN sont conçus, et subjecte à la levure basé validation interne. Au point de contrôle (CP) 1 (CP-1), seuls les jeux passés validation interne (50% ou plus du contrôle positif interne) seront fournis aux utilisateurs pour la sélection. Si aucun jeux passent CP-1, séquence supplémentaire peut être nécessaire pour concevoir des ensembles ZFN efficaces. Une validation in vitro de l&#39;embryon est suivie pour assurer l&#39;ensemble ZFN sélectionné peut induire des mutations dans des sites sélectionnés (CP-2). Ensemble (s) ZFN ne sera utilisée que si elle passe CP-2 (&gt; = 10% taux de mutation chez les embryons in vitro). Échec CP-2 nécessitera une refonte des ensembles ZFN. donneurs d&#39;embryons seront préparés et embryons au stade pronucléaire seront micro-injectés avec les ensembles ZFN validés. Ces embryons micro-injectés seront transférés aux bénéficiaires de l&#39;embryon synchronisés. Après la période d&#39;un mois de gestation, les nouveau-nés seront génotypés (CP-3). Si aucun des nouveau-nés sont positifs, la micro-injection supplémentaire sera effectué. Il faut 2-3 mois du début du projet à CP-2, en supposant que ninsuffisance o au cours du processus. Il faut 2-3 mois supplémentaires de CP-2 pour CP-3. Par conséquent, il est possible de générer un lapin de finale dans un délai de 4-6 mois en utilisant la technologie ZFN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" /> Figure 2. Conception ZFN. Trois ensembles de ZFN (Set 1, 2, et 3) ont été conçus en ciblant des séquences sur l&#39;exon 1 ou Exon 2 de lapin ApoCIII (A). Les trois ensembles ont été soumis à la levure MEL-1 journaliste dosage pour déterminer les activités ZFN. Selon les protocoles du fabricant, qui montrent ZFNs&gt; 50% des activités de celle du contrôle positif interne de la fabrication sont considérés comme utiles pour in vitro et in vivo génome expériences d&#39;édition.Les activités étaient ZFN 224,2% pour l&#39;ensemble 1, 196,9% pour la série 2 et 177,8% pour Set 3 (B), donc Set 1 a été sélectionné dans la présente étude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" /> Figure 3. Validation in vitro d&#39;embryons de ZFN. L&#39;ARNm (5 ug / ml) de l&#39;ensemble 1 a été micro-injecté dans le cytoplasme de 35 pronucléaire embryons de lapin de l&#39;étape (A). Embryons vidées sans traitement de micro-injection (n = 31) ont été utilisés comme groupe témoin. Le taux de développement BL était de 77,4% dans le groupe témoin. Dans le groupe microinjecté, le taux était de 51,4% BL. 16 BLS soumis à un séquençage PCR, 8 (50%) ont été identifiés comme positif, indiquant Set 1 est un ensemble ZFN efficace pour induire des mutations à la targeting place (B, apoc3wt.seq, noir-boîte) de ApoCIII chez les lapins. Le BLS contenant des mutations sont BL # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, et 17 (B, rouge souligné). Le BLS restants (# APOC-2, 6, 9, 10, 12, 14 et 16) n&#39;ont pas de mutations sur le site de ciblage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" /> Figure 4. La production de lapins ApoCIII KO. Cent quarante-cinq embryons micro-injectés avec ZFN Set 1 ARNm ont été transférés à 7 lapins bénéficiaires pseudo-enceinte (A). Embryons fraîchement rincée (n = 75) sans microinjection ZFN ont été transférées à des destinataires (n = 6) que le groupe témoin. Le taux à long terme calculée en kits terme total / embryons au total dans le groupe de l&#39;expérience est de 140,5% (21/145), alors que le taux est de 29,3% (22/75) dans le groupe témoin (A). Sur les 21 kits nés dans le groupe microinjecté, cinq (R1, R9, R11, R12 et R16) ont été identifiés kits KO comme positifs après séquençage PCR (B). Les indels sur le site de ciblage comprennent deux insertions (1 à la fois pour R9 et R11) et trois suppressions (Δ1, Δ 20, Δ 21 pour R1, R12 et R16, respectivement). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

L&#39;apolipoprotéine (Apo) C-III (ApoCIII) est une petite protéine sécrétoire O-glycosylé qui est synthétisée principalement dans le foie et l&#39;intestin. Il se trouve sur la surface de chylomicrons à plasma (CM), lipoprotéines de très basse densité (VLDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). ApoCIII a été reconnue comme un facteur de risque de maladie cardiovasculaire 1. Les patients présentant un déficit héréditaire de ApoCIII ont un faible taux plasmatique de triglycérides (TG) des niveaux et réduit l&#39;athérosclérose de l&#39;artère coronaire infraclinique 2,3. Niveau de ApoCIII de plasma élevée, d&#39;autre part, est en corrélation avec souvent une résistance à l&#39;insuline, l&#39;obésité, l&#39;hypertriglycéridémie et (HTG) 4,5. Gene KO (KO) est un moyen puissant pour étudier la fonction d&#39;un gène. En accord avec les observations dans les populations humaines mutantes, knock-out du gène ApoCIII chez la souris conduit à une réduction des TG plasmatiques et de la protection de HTG postprandiale 6. Ce rôle positif de ApoCIII apparud&#39;être indépendant de l&#39;apolipoprotéine E (ApoE), comme les souris déficientes en ApoE et de deux ApoCIII sont également protégés contre l&#39;hyperlipidémie postprandiale 7. Bien que ces modèles de souris KO ApoCIII ont fourni des informations précieuses sur les fonctions possibles de l&#39;ApoCIII chez l&#39;homme, il est noté que le métabolisme de la lipoprotéine de souris est différente de celle de l&#39;être humain dans de nombreux aspects. Par exemple, la souris ne dispose pas de cholestéryle plasmatique de protéine de transfert d&#39;ester (CETP), une enzyme importante impliquée dans le transport des VLDL, LDL, HDL et 8. Par conséquent, il est nécessaire de développer un modèle animal approprié pour mieux comprendre le rôle physiologique de l&#39;ApoCIII in vivo. Le lapin est un modèle classique espèces animales 9-11. Il a une courte période de gestation (30-31 jours), grande taille de la portée (4-12/litter) et peut être logé commodément dans une installation intérieure. Par rapport à des souris, les lapins sont phylogénétiquement plus proches des humains 10. Surtout, comme hul&#39;homme, mais contrairement aux souris, les lapins sont des mammifères de LDL-riches et ont des niveaux substantiels de la CETP 10,12. De plus, ils sont sensibles à l&#39;athérosclérose induite par l&#39;alimentation riche en cholestérol avec des lésions similaires à celles observées dans l&#39;athérosclérose humaine 13. Pour ces raisons, nous avons supposé que les lapins ApoCIII KO peuvent servir de meilleur modèle que leurs homologues de souris pour étudier les rôles des ApoCIIIplay dans le métabolisme lipidique et l&#39;athérosclérose chez les humains. Production de gène transgénique ciblé (GTT) lapins a été un défi. Ceci est principalement dû à l&#39;absence de la lignée germinale de transmettre des cellules souches embryonnaires (ESC), et la très faible efficacité de transfert des cellules somatiques (TNCS) chez les lapins. ESC est le principal outil pour générer des souris GTT, alors que SCNT et a été appliquée avec succès pour générer des animaux KO en espèces manque germinales CES transmission, y compris les porcs, les moutons et les bovins, mais pas les lapins. Récemment Zinc Finger nucléase (ZFN), Tranabonnement Activator-Like effecteur nucléase (TALEN) 14, et de l&#39;ARN endonucléase guidée (RGEN) 15 émergé moyens puissants pour l&#39;édition du génome. Ces nucléases, dites &quot;ciseaux moléculaires&quot;, sont efficaces dans la génération de cassures double brin (DSB) dans le génome qui peuvent conduire à un KO fonctionnelle du gène ciblé ou utilisées pour intégrer une séquence d&#39;ADN à un locus spécifique dans le génome dans un certain nombre d&#39;espèces 16. En 2011, parmi les premiers adapter la technologie ZFN, nous avons généré des peroxysomes gamma récepteur activé par les proliférateurs (PPAR) des cellules porcines KO par cette approche et générés succès porcs PPARy KO après l&#39;utilisation de ces cellules pour SCNT 17. Dans la même année, la rupture efficace des gènes d&#39;immunoglobulines et le remplacement ciblé chez des lapins à l&#39;aide de ZFN également été rapportés 18. Dans la présente étude, cinq lapins ApoCIII KO ont été générés comme l&#39;a confirmé par séquençage PCR, en utilisant ZFN Set 1 (voir la figure 1 </strong&gt;. pour organigramme illustration). Ces animaux sont de nouveaux moyens pour étudier les rôles des ApoCIII dans les métabolismes lipidiques.

<table><tbody><tr><td>APOC3-ZFN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CSTZFNY-1KT</td><td>Gène cible : APOC3, Numéro de lot : 12201118MN</td></tr><tr><td>mMESSAGE kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1344M</td><td>synthèse de l’ARNm</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908M</td><td>purification de l’ARNm</td></tr><tr><td>Hormone folliculo-stimulante</td><td>Bioniche Life Sciences</td><td>Folltropin-V</td><td>Traitement des lapins donneurs d’embryons</td></tr><tr><td>Gonadotrophine chorionique humaine</td><td>Intervet</td><td>Chorulon</td><td>Traitement des lapins donneurs d’embryons</td></tr><tr><td>Hormone de libération des gonadotrophines</td><td>Prospecbio</td><td>HOR-255</td><td>Traitement des lapins receveurs d’embryons</td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée d’Earle (EBSS)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30029.02</td><td>Culture d’embryons, milieu de base</td></tr><tr><td>MEM (acide aminé non essentiel)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145</td><td>Culture d’embryons, suppléments</td></tr><tr><td>ACIDES AMINÉS BME solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6766</td><td>Culture d’embryons, suppléments</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td>Culture d’embryons, suppléments</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Culture d’embryons, suppléments</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>Culture d’embryons, suppléments</td></tr><tr><td>HEPES tamponné TCM 199&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>12350039</td><td>Milieu de manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170</td><td>Matériel de culture d’embryons</td></tr><tr><td>Micromanipulateur&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan NK 2</td><td>Matériel de manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instruments Inc.</td><td>P-1000</td><td>Matériel de manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Micro-injecteur&nbsp ;</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D Équipement de</td><td>manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Tubes capillaires en verre borosilicaté&nbsp ;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td>Approvisionnement en manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbitol sodique)</td><td>Virbac AH, Inc.</td><td>ANADA#200-071</td><td>Euthanasie de lapins donneurs d’embryons</td></tr></tbody></table>

la production de lapins de knockout apolipoprotéine c-iii à l&#39;aide de zinc nucléases doigt

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

L&#39;apolipoprotéine (Apo) C-III (ApoCIII) réside sur la surface de chylomicrons à plasma (CM), lipoprotéines de très basse densité (VLDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Il a été reconnu que des niveaux élevés de plasma ApoCIII constitutea facteur de risque de maladies cardiovasculaires (MCV). Niveau de ApoCIII de plasma élevée est souvent corrélé à la résistance à l&#39;insuline, l&#39;obésité et l&#39;hypertriglycéridémie. Précieuses connaissances sur les rôles des ApoCIIIin métabolismes lipidiques et les maladies cardiovasculaires a été obtenue à partir des modèles de souris transgéniques, y compris les souris knock-out (KO) ApoCIII, mais il est à noter que le métabolisme de la lipoprotéine chez la souris est différente de celle de l&#39;être humain dans de nombreux aspects. On ne sait pas jusqu&#39;à présent si plasma élevé ApoCIII est directement athérogène. Nous avons travaillé à développer des lapins ApoCIII KO dans la présente étude basée sur l&#39;hypothèse que les lapins peuvent servir reasonablemodelfor étude du métabolisme lipidique et l&#39;athérosclérose humaine. Lapin doigt de zinc nucléase (ZFN) ensembles ciblant ApoCIIIgene ont été soumis à une validation in vitro de l&#39;embryon avant la micro-injection. L&#39;ARNm a été injecté dans le cytoplasme de lapin 35 Des embryons au stade pronucléaire, et a évalué les taux de mutation à l&#39;état de blastocyste. De seize blastocystes qui ont été testés, un taux satisfaisant de 50% de mutation (8/16) sur le site de ciblage a été atteint, supportant l&#39;utilisation de l&#39;ensemble 1 pour des expériences in vivo. Ensuite, nous avons micro-injecté 145 embryons avec Set 1 ARNm, et transféré ces embryons à 7 lapins bénéficiaires. Après 30 jours de gestation, 21 kits sont nés, dont cinq ont été confirmés comme des lapins ApoCIII KO après PCR tests de séquençage. Le taux des animaux KO (# kits KO / total né) était de 23,8%. Le rendement global de production est de 3,4% (5 kits/145 embryons transférés). La présente étude a démontré que ZFN est une méthode très efficace pour produire des lapins KO. Ces lapins ApoCIII KO sont de nouveaux moyens pour étudier les rôles des ApoCIII dans les métabolismes lipidiques.

Dans validation in vitro de paires ZFN Seize paires ZFN ont été initialement conçus. La séquence d&#39;interruption ciblée de l&#39;ensemble 1 se trouve à l&#39;exon 2 de lapin ApoCIII (Figure 2A). Trois paires (Set 1, 2, et 3, figure 2A) ont été sélectionnés et soumis à la levure MEL-1 essai rapporteur pour déterminer les activités de ZFN (Figure 2B). Set 1 a un score de ZFN de 224,2%, plus élevés que ceux de la série 2 (196,9%) et Set 3 (177,8%) et beaucoup plus élevé que le seuil de sélection (soit 50% du contrôle positif interne). Par conséquent Set 1 a été choisi pour des expériences in vitro de validation. Un ensemble particulier doit se traduire par un taux positifs dans les embryons de 10% ou plus, pour passer de la validation de l&#39;embryon in vitro, sur la base des critères de validation internes. L&#39;ARNm (5 ug / ml) de l&#39;ensemble 1 a été micro-injecté dans le cytoplasme de 35 pronucléaire embryons de lapin de phase (figure 3A &lt;/ Strong&gt;). Embryons vidées sans traitement de micro-injection (n = 31) ont été utilisés comme groupe témoin. Dix-huit embryons du groupe microinjecté développés à l&#39;étape BL sur D5, dont seize ont été séquencés, et huit (BL # APOC-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, figure 3B, rouge souligné) affichés mutés séquences sur le site de ciblage (noir-boîte, Figure 2B, rangée du haut, apoC3wt.seq). Le taux BL du groupe microinjecté (51,4%) est inférieur à celui du groupe de contrôle (77,4%), ce qui indique la compétence développementale légèrement altérée d&#39;embryons micro-injectés. Le taux de mutation positive des micro-injection d&#39;embryons est de 50,0% (8/16), bien plus élevé que le seuil de sélection (par exemple 10%). Ces résultats ont révélé que l&#39;ensemble 1 est un ensemble ZFN efficace pour induire des mutations au niveau du site de ciblage de l&#39;ApoCIII de lapin. Par conséquent Set 1 a été choisi pour la production in vivo de lapins ApoCIII KO. La production de lapins ApoCIII KO L&#39;ARNm of ZFN Set 1 a été micro-injecté dans le cytoplasme des embryons au stade pronucléaire de lapin, et transféré 145 embryons micro-injectés à 7 lapins bénéficiaires pseudo-enceinte (figure 4A). Embryons fraîchement rincée (n = 75) sans microinjection ZFN ont été transférées à des destinataires (n = 6) que le groupe témoin. Après 30 jours de gestation, 21 kits sont nés dans le groupe microinjecté. Séquençage PCR a identifié cinq (APOC3-R1, R9, R11, R12 et R16) sous forme de kits KO positifs (figure 4B). Le taux à long terme calculée en kits terme total / embryons totaux est de 14,5% (21/145), alors que le taux est de 29,3% (22/75) dans le groupe de contrôle. Le taux KO calculé que le total des kits KO / durée totale est de 23,8% (5/21). Un kit KO (apoC-R16) est décédé cinq jours après l&#39;accouchement (20,0%, 1/5). Le indelsat le site de ciblage comprennent deux insertions et délétions trois, ils areΔ1, 1, 1, Δ20 et Δ21, pour lapins # R1, R9, R11, R12, et R16, respectivement (figure 4B). Bianalyse des oinformatics a été utilisé pour identifier le potentiel ZFN hors-cibles avec 7 ou moins inadéquation de Set 1 séquence, comme décrit précédemment 17. Un seul prédit site possible hors cible, situé sur le chromosome 14, a été identifié avec 7 points de base correspondent pas. PCR détecté aucun événement hors-cible dans l&#39;un des animaux fondateurs.

Le développement récent des outils de ciblage de gène rend la production des huitièmes de finale (KO) lapins possible. Dans le présent travail, nous avons généré cinq lapins apolipoprotéine (Apo) C-III KO à l&#39;aide de nucléases à doigt de zinc (ZFN). Ce travail a démontré que ZFN est une méthode très efficace pour produire des lapins KO.

La production de lapins de Knockout apolipoprotéine C-III à l&#39;aide de zinc nucléases doigt

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

L'objectif général de cette procédure est de développer de nouveaux modèles de lapin pour l'étude des maladies cardiovasculaires humaines. Cela est réalisé en concevant et en synthétisant d'abord des nucléases à doigts de zinc ciblant le gène d'intérêt. La deuxième étape de la procédure consiste à micro-injecter les ARN des ZFN dans le cytoplasme d'embryons au stade de pronoyau.La troisième étape consiste à transférer chirurgicalement les embryons dans un lapin receveur. L'étape finale consiste à génotyper les nouveau-nés afin d'identifier les animaux transgéniques. Le ciblage génique global par ZFN est très efficace et est démontré ici par la création d'un lapin knock-out A OC trois.Cette technique constitue une étape marquante en ingénierie génétique, car elle est la première à permettre la production de lapins sans code. Les retombées de cette technique s'étendent à la thérapie de nombreuses maladies humaines, telles que les maladies cardiovasculaires. On prend de plus en plus conscience que des modèles animaux de grande taille sont nécessaires pour mieux imiter la physiologie et la pathologie humaines.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en lisant l'article rapportant un ciblage génique réussi à l'aide d'une nucléase importante en rouge en 2009. En général, les personnes connaissant cette méthode éprouveront des difficultés, car elle implique une microinjection cytoplasmique de constructions. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le ciblage génique chez les lapins, elle pourrait également être appliquée à d'autres systèmes, comme les porcs.Commencez par une hyperovulation de lapines blanches de Nouvelle-Zélande sexuellement matures à l'aide d'une injection sous-cutanée de FSH deux fois par jour pendant trois jours, en augmentant la dose quotidiennement. Soixante-douze heures après la dernière injection de FSH, injectez 200 UI de HCG par voie intraveineuse pour induire l'ovulation, rendant ainsi immédiatement les femelles hyperovulantes. À ce moment-là, un animal receveur doit également être préparé.16 à 18 heures après l'insémination, euthanasier les lapines donneurs hyperovulantes au pentobarbital de sodium. Récupérer les trompes utérines en prélevant soigneusement l'utérus entier. Pour chaque trompe utérine, rincer les ovaires et la structure à l'aide de 10 millilitres de milieu de manipulation en injectant le milieu par l'extrémité utérine de la trompe.Recueillir le milieu lavé à l'extrémité ovarienne du CTU dans une boîte de Pétri. Les embryons récupérés se trouvent dans le milieu lavé. Ensuite, laver les embryons trois fois avec le milieu de manipulation.Ensuite, incuber les embryons dans le milieu de manipulation à 38,5 degrés Celsius dans l'air normal. Entre 19 et 21 heures après l'insémination, sélectionner les embryons à l'aide d'un microscope stéréo.Prélevez environ 30 embryons au stade des pronoyaux pour chaque condition d'injection ; comptez sur 30 à 40 embryons par femelle hyperovulée. Au préalable, obtenez des jeux de ZFN pour le gène d'intérêt auprès d'un fabricant.Sélectionner ceux qui présentent les meilleurs scores de ZFN. Dans cet exemple, le gène d'intérêt est A OC three. Pour préparer l'ARNm de ZFN, transcrire d'abord l'ARN messager de ZFN in vitro, puis polyadényler les transcrits.Ensuite, purifiez l'ARNm obtenu et resuspendez-le dans du RNA spree 0,1 xte E. Mesurez ensuite la concentration en ARN à l'aide d'un spectrophotomètre et préparez des aliquotes d'ARNm codant pour les paires de ZFN à une concentration de quatre à 10 nanogrammes par microlitre, dans des flacons de 10 microlitres pour stockage. Commencez par chauffer le plateau de micro-injection à 38 degrés Celsius.Pour préparer la plateforme de microinjection, commencez par retirer la chambre de milieu d'une lame à puits unique, puis ajoutez une goutte de cinq microlitres de milieu de manipulation sur la lame et recouvrez-la d'huile minérale. Placez la lame préparée sur la platine chauffante du microscope.Ensuite, fixez une pipette de maintien de 120 microns de diamètre à un micromanipulateur et positionnez la pipette dans la goutte de milieu sur la plateforme. Faites maintenant décongeler les ARNm à injecter sur de la glace. Chargez-les dans une pipette d'injection, façonnée à partir d'un capillaire en verre au borosilicate à l'aide d'un étireur de micropipettes.Ensuite, allumez l'alimentation en air comprimé reliée au micro-injecteur. Puis, fixez la pipette d'injection à son support et attachez ce dernier à un deuxième micromanipulateur. Placez également cette pipette dans la goutte de milieu.Configurez maintenant le microinjecteur pour un volume d'injection de un à cinq picolitres. Pour ouvrir l'extrémité de la pipette d'injection, tapez doucement contre la pipette de maintien.À l’aide d’une pipette en verre, transférez 30 à 50 embryons vers la goutte de micro-manipulation sur la plateforme. Ensuite, observez à un grossissement de 100 x.Utilisez la pipette de maintien pour capturer un embryon. Alignez la pipette de maintien et l'embryon avec l'aiguille d'injection actuellement sous un grossissement de 400 x. Avancez la pipette d'injection à travers l'embryon.Faites attention à éviter le noyau. Une fois que la membrane plasmique est percée, appuyez sur la pédale pour injecter l'ARNm ; après l'injection, retirez l'aiguille et relâchez l'embryon. Répétez le processus pour tous les embryons restants.Une fois que tous ont été injectés, laver les embryons trois fois dans un milieu de culture embryonnaire, 30 secondes par lavage. Incuber ensuite les embryons à 38,5 degrés Celsius avec un air contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant une à deux heures avant de transférer les embryons vers la receveuse synchronisée.Lapine femelle. Pour cultiver les embryons jusqu'au stade de blastocyste, l'incubateur doit contenir de l'air humidifié. Sélectionner une lapine femelle NZW âgée de cinq à douze mois, en bonne santé, et pesant de quatre à cinq kilos.Préparez-la en tant qu'animal récepteur en administrant d'abord par voie intramusculaire une hormone libérant les gonadotrophines. De 16 à 24 heures après l'injection hormonale, anesthésiez le lapin au kétabamine et/ou à l'isoflurane vaporisé. Lorsque le lapin est complètement inconscient, il ne présente plus de réflexe plantaire.Lorsque l'on serre le coussinet plantaire avant la chirurgie, protégez les yeux avec un onguent ophtalmique et préparez l'abdomen. Pendant l'intervention, enregistrez les signes vitaux du lapin. Toutes les 15 minutes, commencez par pratiquer une incision d'environ 2,5 centimètres à travers la peau, puis le long de la couche musculaire.Exposer chaque ovaire ainsi que la corne utérine qui y est attachée, en tenant un ovaire entre le pouce et l'index. Transférer les embryons dans la trompe à l'aide d'une pipette stérile insérée avec précaution. Habituellement, de 10 à 25 embryons sur chaque lot de 30 embryons injectés sont viables, et tous peuvent être transférés dans une même receveuse.Terminer la chirurgie en refermant la couche musculaire à l’aide d’un fil résorbable revêtu. Fermer la peau soit avec un fil sous-cutané résorbable, soit avec des points de suture cutanés simples interrompus non résorbables. Ensuite, maintenir l’animal au chaud et le surveiller jusqu’à ce qu’il recouvre une position sterno-abdominale.La position couchée est atteinte. Seize paires de ZFN ont été initialement conçues. La séquence ciblée de disruption du premier ensemble se situe dans l'exon deux d'un OC trois ensembles.Un, deux et trois ont été sélectionnés et soumis au test rapporteur MEL de levure afin de déterminer les activités des ZFN. Pour le jeu un, le score de ZFN était de 224,2 % supérieur à celui des jeux deux et trois, et nettement supérieur au seuil de sélection, qui correspond à 50 % du contrôle interne positif. Par conséquent, le jeu un a été sélectionné pour les expériences de validation in vitro. L'ARNm du jeu un a été micro-injecté dans 35 embryons de lapin.Le taux de développement jusqu’au stade BL du groupe micro-injecté était plus faible par rapport à ceux qui n’avaient pas été micro-injectés, indiquant une compétence développementale légèrement altérée. 18 embryons du groupe micro-injecté ont atteint le stade BL au cinquième jour, dont 16 ont été séquencés. La fréquence de quatre mutations au site cible était nettement supérieure au seuil de sélection, ce qui montre que la paire de ZFN définie était efficace sur un total de 145 embryons.Des embryons micro-injectés avec l'ARNm des ZFN du jeu un ont été transférés à sept lapines pseudo-gestantes. Des embryons fraîchement récupérés, non micro-injectés avec les ZFN, ont été transférés aux receveuses en tant que groupe témoin après 30 jours de gestation. Vingt-et-un lapereaux sont nés dans le groupe micro-injecté.Le séquençage par PCR a identifié cinq knockouts positifs. Les indels au site ciblé comprenaient deux insertions et trois délétions. Une analyse bioinformatique a été utilisée pour identifier les sites hors cible potentiels des ZFN présentant sept différences ou moins par rapport à la séquence du jeu un ; un seul site hors cible possible a été identifié, et la PCR n'a détecté aucun événement à ce site chez aucun des animaux fondateurs.Regardez cette vidéo. Vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de produire des lapins knock-out par microinjection nucléaire de doigts de zinc.Une fois maîtrisées, la collecte des embryons, la microinjection et le transfert peuvent être réalisés en quatre heures si l'on procède correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que le matériel d'injection est de l'ARN, ce qui exige une prudence accrue. Après cette procédure, un phénotypage sera effectué afin de comprendre les règles biologiques des gènes ciblés.

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Le CompoZr personnalisé à doigt de zinc nucléase (ZFN) permet la fonction d'édition génome précis dans un organisme ou lignée cellulaire à tout lieu défini par l'utilisateur. Cet article décrit le processus pour la conception, la fabrication, la validation et la mise en œuvre du Service CompoZr personnalisé ZFN.

Génome édition avec des nucléases personnalisés CompoZr doigt de zinc (ZFNs)

nucléases de créateurs tels que nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) peuvent être utilisés pour modifier le génome d'embryons de pré-implantation de souris en déclenchant à la fois la fin non homologue rejoindre (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH) des voies. Ces progrès permettent la génération rapide de la souris avec des modifications génétiques précises.

Souris ingénierie des génomes Utilisation nucléases de créateurs

Nous décrivons une méthode de génération d’un modèle possible de poisson-zèbre de la maladie polykystique des reins. Nous avons utilisé des poissons Tg(wt1b :GFP) pour visualiser la structure rénale. L’inactivation de wnt5a s’est faite par injection de morpholino. La formation de kystes pronéphriques après l’inactivation de wnt5a a été observée chez ce poisson zèbre transgénique GFP.

Un modèle de poisson zèbre possible de la maladie polykystique des reins: Knockdown de Wnt5a Causes kystes chez le poisson zèbre reins

Présenté ici est un protocole pour l'édition efficace de gène de ribonucleoprotein-mediated de CRISPR/Cas9 dans les cellules mammifères utilisant l'électroporation de tube.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Ici, nous présentons une méthode modifiée pour la cryoconservation des embryons à une cellule ainsi qu’un protocole qui couple l’utilisation d’embryons dégelés et l’électroporation pour la génération efficace de souris génétiquement modifiées.

Utilisation d’embryons décongelés par le gel pour la production à haut rendement de souris génétiquement modifiées

Plusieurs méthodes ont été utilisées pour analyser les lipoprotéines plasmatiques; cependant, l’ultracentrifugation reste l’une des méthodes les plus populaires et fiables. Ici, nous décrivons une méthode concernant la façon d’isoler les lipoprotéines du plasma en utilisant l’ultracentrifugation séquentielle de densité et comment analyser les apolipoprotéines à des fins diagnostiques et de recherche.

Isolement et analyse des lipoprotéines plasmatiques par ultracentrifugation

Le présent protocole décrit la micro-injection de zygotes de CRISPR-Cas9 et d’ADN de donneur pour produire efficacement des souris frappées par cassette de gènes et floxées.

Micro-injection de zygote pour la création d’allèles knock-in et flox de cassette génique chez la souris

Ici, nous décrivons une technique simple destinée à la génération efficace de souris génétiquement modifiées appelée CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Cette méthode délivre des réactifs d’édition par électroporation dans des embryons avec une efficacité proche de 100%. Ce protocole est efficace pour les mutations ponctuelles, les petites insertions génomiques et les délétions dans les embryons de mammifères.

Édition efficace du génome de souris par électroporation CRISPR de zygotes

Dans ce protocole, nous décrivons les procédures techniques pour générer des souris knockout spécifiques au tissu adipeux brun (MTD) en utilisant un système combiné d’ARN monoguide (ARNg) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé (AAV). Les étapes décrites comprennent la conception des ARNg, la préparation des particules AAV-sgRNA et la microinjection d’AAV dans les lobes BAT.

Génération de souris knockout spécifiques à la graisse brune à l’aide d’un système combiné d’ARN monoguide Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 et virus adéno-associé

Ici, nous décrivons un protocole de génération de mutant maternel qui couple une ligne d’entraînement stable zpc :cas9 avec l’administration médiée par Tol2 de cassettes d’expression d’ARNsg.

Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

L’efficacité de la méthode I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) est comparable à celle de la micro-injection traditionnelle, qui nécessite la collecte de zygotes sur les femelles donneuses et le transfert à des femelles pseudo-enceintes. Ce protocole démontre son efficacité en introduisant des mutations induites par CRISPR/Cas9 dans le locus ROSA26 sur le chromosome 6.

Amélioration de l’édition du génome via une technique d’électroporation in vivo basée sur l’administration d’acides nucléiques oviductaux pour la génération de souris knock-out

Découvrez la production de lapins knockout Apolipoprotéine C-III par nucléases à doigts de zinc pour la recherche cardiovasculaire. Cette méthode avancée permet d'étudier les maladies cardiaques humaines.

La production de lapins de Knockout apolipoprotéine C-III à l'aide de zinc nucléases doigt

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