A Novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte

L'objectif général de cette procédure est de combiner deux protocoles de dégénérescence rétinienne induite par la lumière, précédemment décrits, afin d'endommager à la fois les photorécepteurs en bâtonnets et en cônes dans toute la rétine. Cela est réalisé en exposant d'abord des poissons-zèbres adultes adaptés à l'obscurité à une lumière UV pendant 30 minutes. La deuxième étape consiste à transférer immédiatement les poissons traités par UV dans des aquariums entourés de quatre lampes halogènes de 250 watts et à exposer les poissons à une lumière continue pendant jusqu'à quatre jours.

La dernière étape consiste à euthanasier le poisson et à énucléer les yeux pour une analyse ultérieure. En fin de compte, la microscopie par immunofluorescence est utilisée pour montrer une perte constante des photorécepteurs en bâtonnets et en cônes à travers toute la rétine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles qu'un traitement par lumière UV ou un traitement similaire à celui d'une lampe à halogène, est que la combinaison de ces deux méthodes entraîne l'ablation des photorécepteurs en bâtonnets et en cônes dans toute l'étendue de la rétine.

Les lésions des photorécepteurs induisent une réponse de prolifération généralisée qui conduit finalement à la régénération des photorécepteurs perdus. Cette technique sera démontrée par Jennifer Thomas, étudiante diplômée dans mon laboratoire. Pour commencer, utilisez une boîte de Pétri en verre de 15 centimètres de diamètre, placée à l’envers, comme support, et fixez-la sur le plan de travail à l’aide de ruban adhésif pour l’exposition à la lumière UV.

Retirez le filament lumineux UV du microscope stéréo fluorescent. Ensuite, fixez le filament lumineux UV au-dessus de la boîte de Pétri retournée, en laissant environ deux millimètres de l'extrémité du filament dépasser la boîte de Pétri. Par la suite, recouvrez de papier d’aluminium la moitié des côtés inférieurs et l’arrière d’un bécher en verre de 250 millilitres, en veillant à ce que la face brillante du papier d’aluminium soit tournée vers l’intérieur du bécher.

Ensuite, remplissez le bécher avec 100 millilitres d'eau provenant du système de l'installation piscicole. Placez ce bécher dans un bécher de quatre litres. Puis remplissez le bécher de quatre litres avec de l'eau jusqu'à ce que le niveau d'eau soit aligné avec la graduation de 100 millilitres dans le bécher de 250 millilitres.

Au maximum de 10 poissons traités à l'obscurité dans le bécher de 250 millilitres, couvrez le bécher de 250 millilitres avec un petit morceau de papier d'aluminium. Ensuite, placez immédiatement tout l'appareil en bécher juste à côté du filament UV. Le filament doit toucher l'extérieur du bécher de quatre litres et être orienté vers la partie exposée du bécher de 250 millilitres.

Veillez à ce que le bécher de 250 millilitres soit centré au fond du bécher de quatre litres. Ensuite, placez un grand écran opaque derrière le bécher de quatre litres, ce qui permet d'exposer les animaux tout en empêchant le personnel du laboratoire de voir l'extrémité du filament UV. Ensuite, allumez la source d'alimentation UV.

Régler le minuteur sur 30 minutes et placer les étiquettes d'avertissement nécessaires afin de s'assurer que le personnel de laboratoire ne soit pas exposé accidentellement aux rayonnements UV. Après 30 minutes, éteindre la source d'alimentation UV. Ensuite, retirer le bécher de 250 millilitres contenant les poissons.

Dans cette procédure, transférez le poisson du bécher de 250 millilitres vers un aquarium en acrylique transparent de 1,8 litre. Ensuite, remplissez le réservoir jusqu'au niveau de débordement afin de configurer la zone d'exposition lumineuse avec la lampe halogène. Placez deux lampes utilitaires halogènes de 250, dans la même direction et espacées de 29 centimètres du réservoir.

Ensuite, placer les deux autres lampes de manière similaire sur le côté opposé, en laissant environ 73 centimètres entre les deux ensembles de lampes. Puis, placer le ventilateur à égale distance entre les deux ensembles de lampes, juste à l'extérieur de la zone de traitement lumineux. Par la suite, placer deux réservoirs de 1,8 litre remplis d'eau au centre de la zone de traitement lumineux, à égale distance entre les deux ensembles de lampes.

Ensuite, placez un aérateur à oxygène dans chaque réservoir. Couvrez chaque réservoir avec des couvercles en acrylique transparent, en laissant un espace de deux centimètres à l'extrémité la plus proche du ventilateur. Disposez le ventilateur de manière à ce qu'il souffle de l'air dans cet espace, et placez un thermomètre dans un ou les deux réservoirs.

Ensuite, allumez l'alimentation des ventilateurs des lumières et des aérateurs. Maintenez le traitement lumineux jusqu'à quatre jours. Les poissons ne doivent pas être nourris pendant le traitement lumineux, car cela affecterait la qualité de l'eau et entraînerait un stress accru pour les animaux.

Surveillez quotidiennement la température et le niveau d'eau, et maintenez la température entre 30 et 33 degrés Celsius. Si nécessaire, ajustez la vitesse du ventilateur et la distance entre les réservoirs et les lampes. Remplissez également chaque réservoir avec de l'eau du système quotidiennement.

48 heures après le début du traitement à la lumière halogène, retirer les poissons de la zone de traitement. Ensuite, préparer du formol à l'éthanol frais pour fixer et euthanasier les poissons zèbres à l'aide d'une surdose d'anesthésique constituée de tuen oxy éthanol. Par la suite, transférer les poissons zèbres euthanasiés sur une serviette en papier, puis énucléer l'œil à l'aide d'une pince courbe.

Conserver les yeux nucléés et le fixateur toute la nuit à quatre degrés Celsius pour la congélation. Protéger les yeux. Les laver dans du saccharose à 5 % dans du PBS 1X pendant 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, le remplacer par du saccharose à 5 % dans du XPBS frais et conserver les yeux pendant deux heures. Après deux heures, laver les yeux dans du saccharose à 30 % dans du XPBS une nuit entière à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, laver les yeux dans un mélange à parts égales de milieu de congélation et de solution de saccharose à 30 % dans du XPBS, une nuit entière à quatre degrés Celsius.

Ensuite, inclure les yeux dans un milieu de congélation pour tissus à 100 %, orientés selon l'axe dorso-ventral. Les stocker ensuite à moins 80 degrés Celsius pendant au moins deux heures avant de procéder à la cryoséction du tissu. Procéder maintenant à la cryoséction du tissu et le déposer sur des lames en verre.

Ensuite, faire chauffer les lames pendant deux heures à 55 degrés Celsius. Après cela, conserver les lames à moins 80 degrés Celsius ou réaliser immédiatement une immunohistochimie standard et observer par microscopie fluorescente. Cette figure montre les modifications de la réponse proliférative suite à divers paradigmes de dommages lumineux.

Voici des sections rétiniennes provenant d'un zebrafish albinos adulte, marquées par immunofluorescence à l'aide de PCNA afin de révéler la prolifération cellulaire, indiquée en rouge dans les moitiés dorsale et ventrale de la rétine, après différents paradigmes de dommages lumineux à zéro heure. La prolifération était absente de la couche interne à 48 HLT. Des cellules progénitrices uniques étaient présentes dans la couche nucléaire interne (INL) à travers la rétine dorsale, ainsi que dans une petite partie de la rétine ventrale.

À 48 HPUV. Des colonnes de cellules progénitrices étaient présentes dans la rétine dorsale, tandis que seules des cellules progénitrices isolées étaient présentes dans une petite portion de la rétine ventrale. À UV plus 48, de grandes colonnes de cellules progénitrices étaient présentes dans toute la rétine dorsale et ventrale.

Cette figure montre la perte des photorécepteurs en bâtonnets et en cônes chez les zebrafish pigmentés après divers paradigmes de dommages lumineux. Voici des sections rétiniennes colorées au Pro trois pour visualiser les noyaux en bleu et immunomarquées au zpr R trois pour révéler les segments externes des bâtonnets en magenta ou au zpr R un pour mettre en évidence les doubles cônes en or, après chacun des paradigmes de dommages lumineux. Des diminutions significatives du nombre de noyaux des photorécepteurs en bâtonnets étaient présentes dans la rétine dorsale à 48 HLT ainsi que dans les régions dorsale et ventrale de la rétine à UV plus 48 HLT.

Bien que les noyaux aient été hypertrophiés dans la rétine dorsale à 48 HPUV, aucune diminution significative des noyaux de cônes doubles n'était présente à 48 HLT ou à 48 HPUV. Des diminutions significatives des noyaux étaient observées dans la rétine dorsale et ventrale à UB plus huit H lt. La combinaison de cette procédure avec d'autres méthodes, telles que des inhibiteurs pharmacologiques spécifiques de gènes ou une inhibition in vivo de protéines, peut révéler le rôle de gènes individuels dans la dégénérescence des photorécepteurs et la réponse subséquente de régénération.