Name: A Novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Découvrez une méthode améliorée d'induction de la dégénérescence rétinienne chez le poisson zèbre adulte en combinant exposition UV et lumière continue. Cette technique permet d'ablatir efficacement les photorécepteurs bâtonnets et cônes pour étudier la régénération rétinienne.

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Les auteurs tiennent à remercier Xixia Luo pour un excellent élevage de poissons et de soutien technique. Ce travail a été financé par le National Institutes of Health des subventions R21EY019401 (RT) et P30EY04068 (RT) national, et des fonds de démarrage à la température ambiante, y compris une subvention sans restriction de la recherche pour prévenir la cécité à la Wayne State University, Department of Ophthalmology. JT a été soutenue par un Thomas C. Rumble bourse fourni par l&#39;école Wayne State University Graduate.

Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le comité de l&#39;utilisation des animaux à la Wayne University School of Medicine Etat. 1. Adaptation à l&#39;obscurité <ol><li> Transfert ~ 10 poissons adultes albinos ou pigmenté à partir du système de logement normale dans une enceinte sombre. Si possible, utilisez un boîtier noir qui est intégré dans le module de logement poisson zèbre, ce qui permet l&#39;écoulement normal de l&#39;eau dans le réservoir. (Si un tel système n&#39;est pas disponible, placez le réservoir de poissons dans un boîtier entièrement noir, en veillant à aérer le poisson avec de l&#39;oxygène). </li><li> Gardez le poisson dans l&#39;obscurité pendant 10 jours. Lors de l&#39;alimentation des animaux ou en ajoutant de nouveaux poissons à la boîte sombre, assurez-vous de passer le plus rapidement possible pour éviter d&#39;exposer le poisson à une longue période de lumière. </li></ol> 2. UV exposition à la lumière <ol><li> Assurez-vous que la puissance de la source UV est éteinte. Retirez le filament de lumière UV stéréoscopique fluorescent. <ol><li> Utiliser un inversé15 cm de diamètre en verre de Pétri (ou quelque chose de semblable cm hauteur 2) comme un support pour le filament UV. Tape le boîte de Pétri à la paillasse. </li><li> Tape le filament de lumière UV en haut de la boîte de Petri inversée. Arrangement de sorte que ~ 2 mm de l&#39;extrémité des saillies de filament de la boîte de Pétri. </li></ol></li><li> Obtenir un bécher en verre de 250. Couvrir la moitié du bas, sur les côtés et l&#39;arrière du bécher avec du papier d&#39;aluminium, en s&#39;assurant que le côté &quot;brillant&quot; de la feuille tournée vers l&#39;intérieur du gobelet. Si le récipient est gradué, couvrir la moitié rédigé du bécher d&#39;une feuille, laissant la moitié claire du bécher exposée. </li><li> Remplir le bécher de 250 ml avec 100 ml d&#39;eau du système d&#39;installation de poisson. </li><li> Placer le bécher de 250 ml dans un bécher 4. Remplissez le 4 L bécher avec de l&#39;eau jusqu&#39;à ce que le niveau de l&#39;eau est encore à la ligne d&#39;eau de 100 ml dans le bécher de 250 ml. </li><li> Ajouter un maximum de 10 animaux sombre traités au bécher de 250 ml. Couvrir le bécher de 250 ml avec un petit morceau d&#39;aluminiumdéjouer. </li><li> Placer l&#39;ensemble de l&#39;appareil de gobelet à proximité immédiate du filament UV. Le filament doit être en contact avec l&#39;extérieur du récipient 4 L et faisant face à la partie exposée du bécher de 250 ml. Assurez-vous que le bécher de 250 ml est centré dans le bas de la 4 L bécher. </li><li> Placez un grand écran opaque derrière le bécher 4L, ce qui permet aux animaux d&#39;être exposés, mais empêchant tout le personnel de laboratoire de voir le bout du filament UV. ATTENTION: assurez-vous que cette barrière est en place avant la mise sous tension de la source UV. </li><li> Allumez la source d&#39;alimentation UV. Régler la minuterie pour 30 min. Lieu que ce soit les étiquettes d&#39;avertissement nécessaires pour s&#39;assurer que le personnel de laboratoire sans méfiance ne pas accidentellement s&#39;exposer au rayonnement UV. </li><li> Après 30 minutes, éteindre la source d&#39;alimentation UV. Retirer le bécher de 250 ml avec le poisson. Remarque: Si plusieurs tours de l&#39;exposition aux UV sont nécessaires, laisser la source d&#39;alimentation refroidir (~ 20 min) avant de répéter le protocole d&#39;exposition. Veillez à remplacer til 100 ml d&#39;eau avec de l&#39;eau fraîche du système pour chaque exposition. L&#39;eau dans le bécher 4 L n&#39;a pas besoin d&#39;être remplacé. </li></ol> 3. Lampe halogène exposition à la lumière <ol><li> Transférer le poisson de 250 ml bécher dans un L aquarium en acrylique transparent 1.8. Remplir le réservoir jusqu&#39;à la marque de débordement. </li><li> Mettre en place la zone de traitement de la lumière d&#39;une lampe halogène. Obtenir quatre lampes utilitaires halogène de 250 W à partir d&#39;une quincaillerie locale. Face à deux lampes dans la même direction, organiser 29 cm de distance de centre à centre. Disposer les deux autres lampes de la même façon. <ol><li> Placer le second ensemble de lampes de sorte qu&#39;ils font face à la première série de lampes, en laissant ~ 73 cm entre les deux séries de lampes. Cela crée une zone de traitement par la lumière en forme de rectangle de 29 x 73 cm. </li></ol></li><li> Procurez-vous un petit ventilateur à partir d&#39;une quincaillerie locale. Placez le ventilateur à égale distance entre les deux ensembles de lampes, juste à l&#39;extérieur de la zone de traitement par la lumière. </li><li> Placez deux 1.8 L réservoirs remplis d&#39;eau dans le centre de lala zone de traitement à la lumière, à égale distance entre les deux jeux de lampes. La distance entre les lampes et la paroi extérieure de la cuve doit être ~ 29 cm. Remarque: même si seulement traiter 10 poissons dans un réservoir de 1,8 L, utiliser cet arrangement. Les deux réservoirs sont nécessaires pour maintenir la température de l&#39;eau de chaque réservoir dans la plage appropriée. </li><li> Placer un aérateur de l&#39;oxygène dans chaque réservoir. </li><li> Couvrir chaque réservoir avec des couvercles acryliques claires, laissant un écart de ~ 2 cm à l&#39;extrémité la plus proche du ventilateur. Disposer le ventilateur afin qu&#39;il souffler de l&#39;air dans cet espace. Placer un thermomètre dans l&#39;une ou les deux des réservoirs. </li><li> Tournez sur la puissance de la lumière, des ventilateurs et aérateurs. Maintenir traitement par la lumière pour un maximum de 4 jours. Le poisson ne doit pas être alimenté pendant le traitement par la lumière, car cela aura une incidence sur la qualité de l&#39;eau et se traduisent par plus de stress pour les animaux. </li><li> Surveiller le niveau de la température et de l&#39;eau sur une base quotidienne. Maintenir la température à 30-33 ° C. Si nécessaire, ajuster la vitesse du ventilateur et / ou la distance entre les réservoirs et la lidro. <ol><li> Couronner chaque réservoir avec de l&#39;eau du système en fonction des besoins, habituellement tous les jours. </li><li> Toujours utiliser le poisson zèbre adulte en bonne santé (en général 6-9 mois d&#39;âge) afin de maintenir un taux de survie de près de 100%. Toutefois, si un poisson est retrouvé mort dans le réservoir, retirez-le immédiatement et remplacez l&#39;eau dans l&#39;ensemble du réservoir. </li></ol></li></ol> 4. Collection de tissus <ol><li> 48 h après le début du traitement par la lumière d&#39;halogène retirer le poisson de la zone de traitement. <ol><li> Préparer fixateur de formaldéhyde éthanol frais (1 part 37% de formaldéhyde, 9 parties d&#39;éthanol à 100%). </li><li> Euthanasier poisson zèbre avec une surdose d&#39;anesthésique de 2-phénoxyéthanol (0,4 mg / L). </li><li> Transférer le poisson zèbre euthanasiés à une serviette en papier. Énucléer l&#39;œil en utilisant des pinces courbes. </li><li> Placez les yeux énucléés dans un fixateur et un magasin O / N à 4 ° C. </li></ol></li><li> Cryoprotect les yeux. <ol><li> Laver les yeux à 5% de saccharose 1x PBS pendant 30 min à température ambiante, puis remplacez-le parfrais 5% de saccharose 1x PBS pendant 2 heures. Ensuite, laver les yeux à 30% de saccharose 1x PBS O / N à 4 ° C. Laver les yeux dans un mélange 1:1 (parties égales) de milieu de congélation de tissu et de 30% de saccharose PBS 1x O / N à 4 ° C. </li></ol></li><li> Intégrer les yeux dans le milieu de congélation de tissu 100% et conserver à -80 ° C. Orienter les yeux pour que cryosectioning du tissu est réalisé sur l&#39;axe dorsal / ventral. </li><li> Cryosection le tissu et le placer sur des lames de verre. Diapositives chaudes pendant 2 heures à 55 ° C. Stocker les lames à -80 ° C ou d&#39;effectuer immédiatement immunohistochimie standard. </li><li> Effectuer standard d&#39;immunohistochimie sur les tissus sectionnés et l&#39;image par microscopie fluorescente 40,51. </li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Ici, nous montrons que la combinaison d&#39;une exposition aux UV court avec une lumière continuelles résultats d&#39;exposition à une perte des photorécepteurs généralisée et une réponse de régénération robuste. En comparaison avec les méthodes de LIRD individuels, cette méthode combinée est aussi le protocole le plus efficace pour endommager les bâtonnets et les cônes dans les deux moitiés de la rétine. Surtout, ce traitement est efficace chez les animaux pigmentés ainsi que les animaux albinos. <p class=...

Dégénérescence de la rétine induite par la lumière (LIRD) est couramment utilisé chez les rongeurs et poissons zèbres à la tige des dommages et des cônes photorécepteurs. Chez le poisson zèbre adulte, photorécepteur dégénérescence déclenche les cellules gliales de Müller à réintégrer le cycle cellulaire et de produire des progéniteurs transitoire-amplification. Ces ancêtres continuent à proliférer comme ils migrent vers la zone endommagée, où ils ont finalement donner naissance à de nouveaux photorécepteurs. Actuellement, il existe deux paradigmes LIRD largement utilisés, dont chacune entraîne degrés de perte des photorécepteurs et des différences correspondantes variant dans la réponse de régénération. En plus des outils génétiques et pharmacologiques sont disponibles pour tester le rôle des gènes individuels d&#39;intérêt lors de la régénération, il est nécessaire de développer un paradigme LIRD robuste. Nous décrivons ici un protocole LIRD qui entraîne une perte généralisée et cohérente de deux photorécepteurs bâtonnets et des cônes dans lesquels nous avons combiné l&#39;utilisation de deux techniques LIRD précédemment établies. Par ailleursCe protocole peut être étendu pour une utilisation chez les animaux pigmentés, ce qui élimine la nécessité de maintenir des lignées transgéniques d&#39;intérêt sur ​​le fond albinos pour les études LIRD.

<table><tbody><tr><td>Source de lumière UV</td><td>Leica</td><td>EL600</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre (150 x 20 mm)</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS3160152BO</td><td></td></tr><tr><td>250 ml bécher en verre</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS1000250</td><td></td></tr><tr><td>4 L Bécher en verre</td><td>Sigma-Aldrich/Pyrex</td><td>CLS10004L</td><td></td></tr><tr><td>Feuille d’aluminium</td><td>Fisher</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>250 W halogène lampes</td><td>Workforce</td><td>265-669</td><td></td></tr><tr><td>Réservoirs en acrylique transparent de 1,8 L</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180T</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles de réservoir en acrylique transparent de 1,8 L</td><td>Aquaneering</td><td>ZT180LCL</td><td></td></tr><tr><td>Ventilateur</td><td>Honeywell</td><td>HT-900</td><td></td></tr><tr><td>Aérateur</td><td>Tetra</td><td>77853-900</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-08008-58</td><td></td></tr><tr><td>Courbé pince (5/45)</td><td>World Precision Instruments</td><td>504155</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Dégénérescence de la rétine induite par la lumière (LIRD) est couramment utilisé chez les rongeurs et poissons zèbres à la tige des dommages et des cônes photorécepteurs. Chez le poisson zèbre adulte, photorécepteur dégénérescence déclenche les cellules gliales de Müller à réintégrer le cycle cellulaire et de produire des progéniteurs transitoire-amplification. Ces ancêtres continuent à proliférer comme ils migrent vers la zone endommagée, où ils ont finalement donner naissance à de nouveaux photorécepteurs. Actuellement, il existe deux paradigmes LIRD largement utilisés, dont chacune entraîne degrés de perte des photorécepteurs et des différences correspondantes variant dans la réponse de régénération. En plus des outils génétiques et pharmacologiques sont disponibles pour tester le rôle des gènes individuels d&#39;intérêt lors de la régénération, il est nécessaire de développer un paradigme LIRD robuste. Nous décrivons ici un protocole LIRD qui entraîne une perte généralisée et cohérente de deux photorécepteurs bâtonnets et des cônes dans lesquels nous avons combiné l&#39;utilisation de deux techniques LIRD précédemment établies. Par ailleursCe protocole peut être étendu pour une utilisation chez les animaux pigmentés, ce qui élimine la nécessité de maintenir des lignées transgéniques d&#39;intérêt sur le fond albinos pour les études LIRD.

Le protocole de traitement de la lumière décrit ci-dessus a été comparée à chaque méthode individuelle de LIRD. Chez les animaux albinos adultes dark-traitées (figures 3-5), les traitements de lumière individuelles a entraîné une perte importante de la tige (Figure 3) et le cône (Figure 4) photorécepteurs. Cependant, les deux traitements individuels endommagés principalement photorécepteurs dans la moitié postérieure de la rétine, en laissant la rétine ventrale...

Protocoles de légers dégâts multiples ont été décrits pour les photorécepteurs des dommages et par conséquent induire une réponse de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte. Ce protocole décrit une méthode améliorée qui peut être utilisé chez les animaux pigmentés et qui endommage la grande majorité de la tige et des cônes photorécepteurs dans la rétine entière.

A Novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

L'objectif général de cette procédure est de combiner deux protocoles de dégénérescence rétinienne induite par la lumière, précédemment décrits, afin d'endommager à la fois les photorécepteurs en bâtonnets et en cônes dans toute la rétine. Cela est réalisé en exposant d'abord des poissons-zèbres adultes adaptés à l'obscurité à une lumière UV pendant 30 minutes. La deuxième étape consiste à transférer immédiatement les poissons traités par UV dans des aquariums entourés de quatre lampes halogènes de 250 watts et à exposer les poissons à une lumière continue pendant jusqu'à quatre jours.La dernière étape consiste à euthanasier le poisson et à énucléer les yeux pour une analyse ultérieure. En fin de compte, la microscopie par immunofluorescence est utilisée pour montrer une perte constante des photorécepteurs en bâtonnets et en cônes à travers toute la rétine. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles qu'un traitement par lumière UV ou un traitement similaire à celui d'une lampe à halogène, est que la combinaison de ces deux méthodes entraîne l'ablation des photorécepteurs en bâtonnets et en cônes dans toute l'étendue de la rétine.Les lésions

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Une méthode pour l'expression conditionnelle knockdown une protéine cible dans la rétine de poisson zèbre adulte est décrite, qui consiste à injecter par voie intravitréenne morpholinos antisens et les électroporation dans la rétine. La protéine résultante est assommée pendant plusieurs jours, ce qui permet de tester le rôle de la protéine dans la régénération ou de la rétine intacte.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Cette vidéo montre une procédure pour induire la dégénérescence rétinienne chez le poisson-zèbre adulte à l’aide d’une lésion laser. Le laser cible les cellules photoréceptrices de la rétine, déclenchant la mort cellulaire et un processus dégénératif. Ces dommages activent les cellules gliales de Müller (MG), entraînant leur dédifférenciation en progéniteurs de cellules souches qui aident à la régénération rétinienne.

Modélisation de la dégénérescence et de la régénération rétiniennes chez le poisson-zèbre à l’aide d’une lésion focale au laser

Nous introduisons une méthode efficace pour rétrograder le marquage des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) chez le poisson-zèbre adulte.

Marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine à l&#39;âge adulte de poisson zèbre avec des colorants fluorescents

Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes plutôt que l'embryon / larve, nous avons développé un dosage latéral de régénération de ligne quantitative qui peut être appliquée à des modèles de maladies de poisson zèbre adulte. Le dosage impliqué résolution au neuromastes 1) et 2) les niveaux cellulaires de cheveu.

Un test pour ligne latérale de régénération à l&#39;âge adulte de poisson zèbre

Ici, nous démontrons la quantification des ment de la rétine et de la régénération et de son impact sur ​​la fonction visuelle en utilisant la N -nitrosourea de N chez le poisson zèbre adulte. Baisse de l'acuité visuelle et une diminution du nombre de photorécepteurs ont été suivis par une prolifération dans la couche nucléaire interne. Régénération morphologique et fonctionnelle complète a eu lieu 30 jours après le traitement initial.

Méthylnitrosourée (MNU) induite par dégénérescence rétinienne et la régénération dans le poisson zèbre: caractéristiques histologiques et fonctionnelles

la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d'imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

Le poisson-zèbre est un populaire modèle animal pour étudier les mécanismes de dégénérescence rétinienne/régénération chez les vertébrés. Ce protocole décrit une méthode pour induire des lésions localisées perturbant la rétine externe avec un minimum de dommages à la rétine interne. Par la suite, nous surveillons in vivo la morphologie de la rétine et la réponse de glia Müller tout au long de la régénération rétinienne.

Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre

Un modèle de lésion cérébrale mécanique chez le poisson-zèbre adulte est décrit pour étudier les mécanismes moléculaires régulant leur capacité de régénération élevée. La méthode explique de créer une blessure par arme blanche dans le tectum optique de plusieurs espèces de petits poissons afin d’évaluer les réponses régénératives à l’aide d’immunomarquage fluorescent.

Modèle de blessure par arme blanche du tectum optique adulte à l’aide de poisson-zèbre et de Medaka pour l’analyse comparative de la capacité de régénération

Le présent protocole décrit une méthode pour induire des lésions tissulaires spécifiques et hautement reproductibles chez les larves de poisson zèbre à l’aide d’un système de lésion laser combiné à une plate-forme microfluidique automatisée pour la manipulation des larves.

Lésions semi-automatisées contrôlées induites par laser pour étudier la régénération de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre

L’article explique comment enlever chirurgicalement les yeux des larves vivantes de poisson zèbre comme première étape vers l’étude de la façon dont l’apport rétinien influence la croissance et le développement du tectum optique. En outre, l’article fournit des informations sur l’anesthésie larvaire, la fixation et la dissection cérébrale, suivies de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale.

Enlèvement des yeux chez les larves vivantes de poisson zèbre pour examiner la croissance et le développement du système visuel dépendants de l’innervation

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.

Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

Découvrez une méthode améliorée d'induction de la dégénérescence rétinienne chez le poisson zèbre adulte en combinant exposition UV et lumière continue. Cette technique permet d'ablatir efficacement les photorécepteurs bâtonnets et cônes pour étudier la régénération rétinienne.

A Novel lumière paradigme de dommages pour utilisation dans les études de régénération rétinienne chez le poisson zèbre adulte

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