Name: Lexpression de lhémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à laide du système dexpression baculovirus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Découvrez l'expression de l'hémagglutinine et de la neuraminidase du virus H7N9 dans des cellules d'insectes. Cette méthode permet de produire des antigènes fonctionnels pour les études immunologiques et le développement vaccinal.

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Nous tenons à remercier Patrick C. Wilson pour CR9114 monoclonal d&#39;anticorps. Nous remercions également Jennifer Debeauchamp et Richard Webby pour les plasmides A/Anhui/1/13 originaux. Un soutien partiel pour ce travail a été fourni par l&#39;Institut national de l&#39;allergie et des maladies infectieuses projet financé par Programme de subventions AI097092-01A1 et CEIRS (Centres d&#39;excellence pour la recherche sur l&#39;influenza et de la surveillance, HHSN26620070010C). FK a été soutenue par une bourse de Erwin Schrödinger (J 3232) du Fonds autrichien pour la science (FWF).

Une. Génération de baculovirus recombinant <ol><li> Clonage dans plasmides transfert baculovirus <ol><li> Clone H7 HA et NA N9 ectodomaine (ou tout autre gène HA ou NA) dans des plasmides de transfert pFastBac modifiés (voir introduction). Vecteurs pour HA contenant un domaine de trimérisation C-terminal et une étiquette hexahistidine, ainsi que pour NA contenant un domaine de tétramérisation N-terminal et tag hexa-histidine, ont été décrits 1,10,11,22 (Figure 1) et peuvent être demandées les auteurs. Note explicative: ectodomaines HA exprimées sans un domaine de trimérisation seront pliées de manière incorrecte, conduisant à la perte d&#39;épitopes conformationnels neutralisants, en particulier dans le domaine de la tige. De même, la fonction enzymatique NA s&#39;appuie sur tétramérisation appropriée. </li><li> Génération de bacmides Transformer transfert de baculovirus-plasmides contenant des gènes HA et NA dans des bactéries selon DH10Bac aide d&#39;une expression de baculovirussystème selon les instructions du fabricant. Isoler et purifier bacmides utilisant un kit Midiprep selon les instructions du fabricant (figure 2). </li></ol></li><li> Sauvetage de baculovirus recombinant et de la vérification de l&#39;expression de la protéine Note explicative: Les étapes suivantes doivent être effectuées de manière aseptique dans une hotte à flux laminaire. Effectuez cette procédure indépendante pour HA et NA (ou tout autre gène d&#39;intérêt). Les cellules d&#39;insectes sont généralement cultivées à 28 ° C sans CO 2. Cellules Sf9 de ce protocole sont cultivées dans des milieux de cellules d&#39;insectes TNM-FH complet supplémenté avec 10% de FBS, 1% de Pen-Strep * et 0,1% de solution de Pluronic F68, sauf indication contraire, et des passages 01h04 deux fois par semaine. Cellules High Five sont cultivées dans des milieux de sérum libre SFX et des passages 01h15 deux fois par semaine. * Ajout d&#39;antibiotiques devrait être considérée comme facultative dans tout le protocole et ajusté selon les pratiques utilisées dans chaque laboratoire. <ol><li> Plate cellules d&#39;insecte Sf9 dans des plaques à 6 puits à une densité de 2 x 10 5 cellules / cm 2 et laisser reposer pendant 20 min dans un incubateur à 28 ° C (sans CO 2). </li><li> Mélanger 2 ug (conc. 0,5 à 2 ug / ul) de bacmide recombinant avec 100 ul de milieu TNM-FH (exempt de sérum, 1% de Pen-Strep). Mélangez 6 pi d&#39;agent de transfection avec 100 pi de milieu TNM-FH (sans sérum, Pen-Strep). Combiner les deux volumes, mélanger délicatement et laisser reposer pendant 20 min à température ambiante (mélange de transfection). Inclure une maquette transfection comme contrôle (Figure 3). </li><li> Retirer le surnageant de cellules Sf9 plaqués (cellules vont maintenant s&#39;en tenir à la plaque) et le remplacer par 2 ml de milieu sans sérum TNM-FH contenant Pen-Strep (1%). Ajouter le volume complet du mélange de transfection (étape 1.2.2) et faites délicatement basculer la plaque de 6 puits pendant 5 sec. Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO 2 pendant 6 heures (figure 3). </li><li> Remplacez le support wimédias ème frais complets TNM-FH (contenant 10% de FBS, 1% de Pen-Strep et 0,1% Pluronic F68). Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO 2 pendant 6 jours. Vérifier de temps en temps les cellules sous un microscope. Les cellules infectées apparaissent généralement plus gros, plus rond, ont élargi noyaux, et commencent à se détacher (Figure 4). </li><li> La récolte de cellules et la confirmation de l&#39;expression de la protéine <ol><li> Récolte des cellules 6 jours après la transfection par centrifugation à 2000 xg pendant 5 min à température ambiante. Le surnageant contient le baculovirus recombinant - il sera utilisé pour générer les stocks de travail tout de suite, ou peut être conservé à 4 ° C pendant des années. </li><li> Pour vérifier l&#39;expression des protéines de recueillir des pastilles et remettre en suspension dans 500 pi de PBS. Mélanger 50 pi de la suspension de 50 pi de tampon SDS-PAGE chargement (contenant un agent réducteur). Exécuter SDS-PAGE et d&#39;effectuer une analyse par Western blot avec un anticorps anti-hexahistidine pour confirmer l&#39;expression des gènes. Inclure les cellules de la maquettetransfection comme témoins négatifs (Figure 3). </li></ol></li><li> Préparation des stocks de travail <ol><li> Planche 5 x 10 5 Sf9 / cm 2 dans un flacon T175 cm 2 et laisser reposer pendant 20 min permettent d&#39;attacher à l&#39;antenne. Remplacer complète médias TNM-FH avec les médias TNM-FH contenant 3% de FBS (et 1% de Pen-Strep, 0,1% Pluronic F68). </li><li> Infecter les cellules avec 100 pi de surnageant de sauvetage. Incuber dans un incubateur à 28 ° C sans CO 2 pendant 6 jours et vérifier de temps en temps si les cellules sont infectées (comme décrit à l&#39;étape 1.2.5.). </li><li> Tourner à 2000 g à la température ambiante pendant 5 min et recueillir le surnageant. C&#39;est maintenant votre P2 actions. Ce stock peut être conservé indéfiniment à 4 ° C. Répétez la procédure de l&#39;infection en utilisant 100 pi de stock P2 pour infecter les cellules. Le stock en résulte est appelé P3 ou stock de travail, qui peut être conservé à 4 ° C ou utilisé directement pour l&#39;expression de la protéine. Le P3 magasin contient généralement 10 &lt;sup&gt; 7 -10 9 unités formant plaque / ml. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification Note explicative: cellules Sf9 de soutenir la croissance de baculovirus très bien. Cependant, leur capacité à sécréter de grandes quantités de protéine recombinante est limité. Par conséquent, nous utilisons une autre ligne de cellules d&#39;insectes, cellules High Five, pour l&#39;expression de protéines recombinantes sécrétées. Ces cellules ne prend pas en charge la réplication baculovirus à très haute de 13 titres, mais ont une grande capacité de sécrétion. <ol><li> Grandir cellules High Five Cultiver cellules High Five dans SFX milieu de culture de cellules d&#39;insecte en T175 cm2. Passage tous les jours 01h03. Pour une culture de 200 ml d&#39;expression, vous devrez développer des flacons de 5 confluentes. </li><li> Récolte et infecter cellules High Five <ol><li> Détachez cellules High Five de 5 T175 cm2 en appuyant sur ​​les flacons avec votre main. Recueillir le suspe cellulairension et transférer dans des tubes de 50 ml de centrifugation. </li><li> Tourner à 1200 xg pendant 7 min à température ambiante. Retirer le surnageant par décantation et d&#39;unir les pastilles en les remettant en suspension dans 15 ml de P3 actions. </li><li> Laisser reposer pendant 15 min dans la hotte à flux (Figure 5). </li><li> Transférer 200 ml de milieu de culture Hyclone SFX en un, stérile 1000 ml shaker flacon propre (sans buffles, scellé avec une feuille d&#39;aluminium avant l&#39;autoclavage, ne doit pas avoir été utilisé pour les cultures bactériennes avant). </li><li> Transférer la suspension P3/cell dans le ballon à secousses. Sceller avec du papier d&#39;aluminium stérile et transfert ballon dans un shaker. Agiter à 70 tours par minute à 28 ° C pendant 72-96 h. </li></ol></li><li> La récolte de la protéine recombinante à partir de surnageants de haute Cinq d&#39;expression de cellules <ol><li> 72-96 h post-infection transfert surnageants de culture dans 500 ml seaux de centrifugation. Tourner à 5500 g pendant 20 min à 4 ° C. En attendant rincer les flacons shaker 3x avec de l&#39;eau distillée deux fois(Le trou DDH 2 O). </li><li> Transfert 3 ml suspension Ni-résine dans un tube de 50 ml avec 45 ml de PBS (on avait besoin pour 200 ml de culture). Secouez bien et tourner à 3000 xg à température ambiante pendant 10 min. Décanter le PBS et garder le culot. Mélanger le surnageant de cellules d&#39;insecte avec le culot Ni-résine et les transférer dans des flacons secoueurs déjà rincés. Incuber à 4 ° C pendant 2-4 heures, tout en agitant (Figure 6). </li><li> Mont colonne de 10 ml en polypropylene sur une pince sur un stand de support. Retirer les deux bouchons et placer un bécher sous la colonne pour recueillir l&#39;écoulement à travers (déchets). Prendre le ballon à secousses de l&#39;agitateur et commencer à transférer le mélange surnageant / de suspension sur la colonne, il va conserver la résine Ni-et uniquement le surnageant s&#39;écoule à travers. Passer la totalité du volume au-dessus de la colonne (figure 7). </li><li> Laver 4x la résine avec 15 ml de tampon de lavage (50 mM de Na HCO 3 2, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8). Que toute la vidange de tampon de lavagede la colonne et fermer avec le couvercle (côté inférieur). </li><li> Ajouter 2 ml de tampon d&#39;élution (mM Na 50 2 HCO 3, 300 mM de NaCl, mM imidazole, pH de 8 300) et laisser reposer pendant 5 min. Ouvrez colonne et recueillir l&#39;éluat. Répéter cette opération 3 fois de plus (avec un total de 8 ml de tampon d&#39;élution). Éluat qui contient des concentrations élevées de protéine montre typiquement mousse quand on les secoue (figure 7). Gardez éluat sur de la glace chaque fois que possible. </li></ol></li><li> échange de tampon et la concentration <ol><li> Prespin 15 ml ultrafiltration unités de centrifugation (30 kDa de coupure pour HA / NA, mais peuvent varier en fonction de la taille de la protéine purifiée) avec du PBS (pH 7.4-7.6) à 3000 g à 4 ° C pendant 20 min. Jeter traverser et charge éluat sur la colonne. Remplir avec 5 ml de stérile, glacée PBS et centrifugation pendant 60 min à 3000 g à 4 ° C. </li><li> débit de décharge par nouveau, remplir avec 15 ml de PBS glacé et essorage pendant 60 min à 3000 g à 4 ° C. Répétez cette procédureDure une fois de plus. </li><li> Prenez la colonne de spin-out de la centrifugeuse et recueillir le concentré de tampon échangé (typiquement 200 pi). Ceci est très concentré protéine recombinante. Rincer la colonne de spin avec 400 pi de froid de glace PBS stérile et ajouter ce au concentré. Gardez le concentré sur la glace en tout temps. </li></ol></li></ol> 3. Caractérisation et contrôle de la qualité <ol><li> Mesure de la concentration protéique Prélever une partie aliquote du concentré et de le mesurer à l&#39;aide de votre méthode de quantification de protéine de choix. Régler la concentration en protéine à 1 mg / ml par addition de PBS et de geler petites aliquotes à -80 ° C. Cycles de gel-dégel nuisent à la structure de la protéine et peuvent conduire à l&#39;agrégation. </li><li> SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie Exécutez 500 ng de votre protéine sur un SDS-PAGE et effectuer une coloration de Coomassie. Pour la coloration rapide et pratique utiliser le réactif de Coomassie, en combinaison avec un protocole de micro-ondes. Protéines HA apparaissent généralement à 64kDa alors que les protéines NA doivent fonctionner à une taille d&#39;environ 56 kDa (figures 8A et B). Selon le protocole décrit vous ne devriez pas voir tous les produits de dégradation. Si la dégradation se produit, il est généralement un signe de contamination levure / fongique lors de l&#39;expression. Dans ce cas, répétez la procédure et assurez-vous de garder tout stérile. </li><li> Western blot / ELISA Afin de vérifier l&#39;identité des protéines que nous recommandons à faire un Western blot ou ELISA avec un anticorps spécifique. Idéalement, les tests ELISA sont réalisés avec un anticorps qui se lie à des épitopes conformationnels (par exemple des anticorps anti-HA tige 1). L&#39;utilisation d&#39;un tel anticorps du repliement correct de la protéine peut être confirmée (Figure 8C). </li><li> Mesure NA activité Un repliement correct de la NA du virus peut également être déterminée en mesurant l&#39;activité de NA. Nous vous recommandons d&#39;effectuer ce test en utilisant le test NA * STAR disponibles dans le commerce (il suffit de suivre les lignes directrices de l&#39;utilisateur). </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Bien que l&#39;expression de virus de la grippe HA et NA protéines dans des cellules d&#39;insectes en utilisant le système d&#39;expression baculovirus est généralement simple, il ya plusieurs points importants à considérer. Il est important, comme indiqué dans l&#39;introduction, que les ectodomaines de HA et NA sont exprimés en fusion avec la trimérisation ou la tétramérisation des domaines, respectivement. Ces domaines d&#39;assurer le repliement correct des molécules généralement assistée par le domaine transmembra...

Comme une première réponse à la récente émergence du roman H7N9 grippe souche du virus en Chine, nous avons acquis des plasmides portant les séquences génomiques de l&#39;hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) des gènes des deux premiers isolats. L&#39;utilisation de ces plasmides, nous avons pu construire rapidement des vecteurs d&#39;expression de baculovirus recombinant pour la production de HA et NA dans des cellules d&#39;insectes. Ce système d&#39;expression est bien établi dans notre laboratoire et a prouvé crucial pour bon nombre de nos projets de recherche en cours 1-8. Les cellules d&#39;insectes sont capables de plier correctement et modifier des protéines complexes post-traductionnelle. Ces modifications comprennent la glycosylation N-liée, ce qui est important pour de nombreuses glycoprotéines virales. En tant que tel, il n&#39;est pas surprenant que le système de baculovirus est bien établie pour les virus de la grippe exprimant les antigènes de surface. En fait, la plupart des structures cristallines HA et NA ont été résolus en utilisant cellulaires exprimé protéines d&#39;insectes 9-11. Un autre avantage de l&#39;système réside dans ses fiables des rendements élevés de protéines allant jusqu&#39;à 30 mg de culture de cellules HA / L (sur la base de notre expérience de plus de 50 protéines différentes HA) - une conséquence de virus infection expression entraînée par le promoteur de la polyhédrine forte. L&#39;élimination de l&#39;endodomaine transmembranaire et des protéines HA et NA permet l&#39;expression de versions solubles sécrétées, des protéines et donc facilite grandement le processus de purification. En outre, ces ectodomaines hexahistidine sont marqués et peuvent donc être purifiés en utilisant une Chromatographie d&#39;affinité en utilisant Ni2 +-résine. Les domaines transmembranaires des protéines HA et NA, et contribuent à la formation de homotrimère homotétramère, respectivement. Afin de préserver ces oligomérisations, nous ajoutons un domaine de trimérisation C-terminale de la HA, et un tétramérisation domaine N-terminal de la NA constructions (Figure 1). Nous avons démontré de façon concluante que ce domaine de trimérisation stabilise fonctionnelle, conséquencesrved épitopes conformationnels sur la tige-domaine de HA 1. Le tétramérisation correcte de la NA pourrait également contribuer à corriger le pliage et la fonction NA 10. Séquences et des vecteurs baculovirus transfert hébergeant trimérisation ou tétramérisation domaines peuvent être demandés aux auteurs ou à d&#39;autres laboratoires dans le domaine, 9,10,12. Une autre question importante pour l&#39;expression de protéines sécrétées dans des cellules d&#39;insectes est le choix de la lignée cellulaire droite. Alors que Spodoptera frugiperda dérivé des cellules Sf9 en charge la réplication baculovirus très bien et sont généralement utilisés pour le sauvetage de virus et la propagation, ils ont la capacité de sécréter de grandes quantités de protéines limité. Trichoplusia ni dérivé BTI-TN-5B1-4 cellules (communément appelés High Five) avoir une capacité de sécrétion plus élevée et sont de la lignée cellulaire de choix pour l&#39;expression dans ce protocole 13,14. En outre, il est utile pour réduire ou même éliminer le sérum de veau fœtal (FBS) à partir de cultures d&#39;expression. Nous utilisons donc médias réduite (3%) contenu FBS pour la croissance des stocks de roulement de virus, et nous effectuons l&#39;expression de protéines dans des milieux sans sérum. Protéines HA et NA recombinants sont utilisés pour de nombreuses techniques immunologiques. Peut-être la plus commune est dans des tests ELISA pour mesurer la conversion de sérum sur la vaccination chez les humains ou les animaux 4,6,7,15. AN engage et sont également utilisées dans des analyses ELISPOT comme les deux molécules stimulatrices et des réactifs de détection pour les cellules sécrétant l&#39;anticorps 16. Leur utilisation comme amorces moléculaires permet de trier spécifiquement pour plasmoblastes ou d&#39;autres types de cellules B qui peuvent ensuite être utilisés pour isoler des anticorps monoclonaux (thérapeutiques) (Acm). Des molécules de HA et NA recombinants sont ensuite utilisés dans la caractérisation de ces anticorps monoclonaux 8. D&#39;autres exemples comprennent l&#39;étude de la stabilité du pH ou la spécificité du récepteur de a exprimé par différents isolats de virus, ou d&#39;évaluer quantitativement enzymatique spécifique NAl&#39;activité ou de la résistance aux inhibiteurs. En outre, recombinant, HA purifiée peut être utilisée pour normaliser teneur en HA de vaccins inactivés du virus de la grippe. Surtout, AHr (et dans une certaine mesure NA) candidats vaccins sont actuellement testés dans des modèles animaux et des essais cliniques sur des humains avec un candidat vaccin est autorisé par la FDA en 2013 2,17-19. L&#39;avantage de ces nouveaux vaccins est que, en raison de la nature de ces protéines recombinantes, le procédé de génération de virus réassortis de croissance élevés de main-d&#39;œuvre pourrait être évité. Peut-être est d&#39;autant plus pertinente que le fait de leur rendement de HA est élevée et reproductible d&#39;une souche à l&#39;. En outre, étant donné que ces vaccins sont produits dans un système sans oeuf, ils ne contiennent pas de contaminants protéiques qui sont problématiques pour des individus allergiques aux œufs. Ici, nous avons choisi d&#39;exprimer les protéines HA et NA de deux isolats du virus de la grippe roman H7N9 chinois, A / Anhui/1/13 et A/Shanghai/1/13 20,21. Ce sont des exemples rapides, mais le protocole décrit peuvent être utilisés pour l&#39;expression selon l&#39;une quelconque des protéines de la grippe A et B de HA ou de NA et peuvent être adaptés pour exprimer toutes les autres protéines virales ou cellulaires sécrétés. Protéines transmembranaires trimères ou tétramères peuvent être clonées dans les cassettes d&#39;expression utilisées pour HA et NA, respectivement. Toutefois, les protéines cellulaires sécrétées plus solubles, comme les interférons, par exemple, n&#39;ont pas besoin d&#39;un domaine supplémentaire pour la stabilisation et peuvent être exprimés uniquement avec un tag hexa-histidine C-terminal.

<table><tbody><tr><td>Nom du matériel/ de l’équipement</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires/Description</td>Système d’expression</tr><tr><td>du baculovirus Bac-à-Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>Suivez les instructions du fabricant</td></tr><tr><td>TNM-FH insect medium</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>600-311</td><td></td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH30278.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>P/N58760</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F68</td><td>Sigma</td><td>1000702664</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifuge filters Ultracel 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC902024</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes en polypropylène (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Efficacité maximale DH10Bac bactéries</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210015</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td>pour tampons d’élution et de lavage</td></tr><tr><td>Cellules Sf9</td><td>ATCC</td><td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx » target="_blank">CRL-1711</a></td><td></td></tr><tr><td>High Five cellules</td><td>Invitrogen</td><td>B85502</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;expression de l&#39;hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe h7n9 à l&#39;aide du système d&#39;expression baculovirus

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Le système d&#39;expression de baculovirus est un outil puissant pour l&#39;expression de protéines recombinantes. Ici, nous l&#39;utilisons pour produire des versions correctement repliées et glycosylés de la grippe A virus glycoprotéines de surface - l&#39;hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). A titre d&#39;exemple, nous avons choisi les protéines HA et NA exprimées par le nouveau virus H7N9 qui a récemment émergé en Chine. Cependant le protocole peut être facilement adapté pour HA et NA protéines exprimées par tout autre virus grippal A et les souches de virus B. Recombinant HA (RRS) et NA (ARN) des protéines sont des réactifs importants pour les dosages immunologiques tels que ELISPOT et ELISA, et sont également largement utilisés pour la normalisation des vaccins, découverte d&#39;anticorps, l&#39;isolement et la caractérisation. En outre, les molécules de NA recombinantes peuvent être utilisées pour cribler des inhibiteurs de petites molécules et sont utiles pour la caractérisation de la fonction enzymatique de la Na, ainsi que de sa sensibilité aux antiviraux. Protéines HA recombinées sont également being testés en tant que vaccins expérimentaux dans des modèles animaux, et un vaccin recombinant basé sur HA a récemment été autorisé par la FDA pour une utilisation chez l&#39;homme. La méthode que nous décrivons ici la production de ces molécules est simple et peut faciliter la recherche dans les laboratoires de la grippe, car il permet la production de grandes quantités de protéines rapide et à faible coût. Bien que nous nous concentrons ici sur le virus de la grippe glycoprotéines de surface, cette méthode peut également être utilisé pour produire d&#39;autres protéines virales et cellulaires de surface.

Molécules HA de A/Shanghai/1/13 et A/Anhui/1/13 exprimé bien avec des rendements d&#39;environ 20 mg / L de culture. NA molécules des deux souches ont montré des niveaux d&#39;expression modérés allant de 0,2 mg / L de culture pour A/Shanghai/1/13 à 0,7 mg / L pour A/Anhui/1/13. Tous les quatre préparations de protéines ont très peu ou pas d&#39;impuretés (figures 8A et B) Le fait d&#39;être de pureté supérieur à AN qui peut s&#39;expliquer par le niveau d&#39;expression. A/Shanghai/1/1...

Nous décrivons ici un moyen pour exprimer des antigènes de surface du virus de l&#39;influenza correctement repliés et fonctionnels dérivés du nouveau virus H7N9 chinois dans des cellules d&#39;insectes. La technique peut être adaptée pour exprimer ectodomaines de toutes les protéines virales ou cellulaires superficiels.

L&#39;expression de l&#39;hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l&#39;aide du système d&#39;expression baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des glycoprotéines de surface purifiées correctement repliées de la grippe, de l’hémagglutinine et de la neuraminidase pour des tests immunologiques et des expériences de vaccination. Ceci est accompli en clonant d’abord le BMid recombinant portant les gènes de la grippe, puis en générant des virus baula recombinants. La deuxième étape consiste à utiliser ces virus baula recombinants pour exprimer les protéines hémagglutinine et neuraminidase dans les cellules d’insectes.Ensuite, les protéines recombinantes sont purifiées à partir du surnageant de culture cellulaire à l’aide de la chromatographie d’affinité. La dernière étape consiste à caractériser ces protéines pour garantir une bonne qualité et une fonctionnalité biologique. En fin de compte, les protéines recombinantes sont utilisées pour étudier les réponses immunitaires aux glycoprotéines de surface du virus de la grippe.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’expression bactérienne de HA one, par exemple, est que les antigènes purifiés sont repliés correcteurs et restent également biologiquement actifs, par opposition à l’ut

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Ce protocole décrit un processus expérimental pour produire des particules virales pseudotyped infectieuses à haut titre (pp) avec des glycoprotéines d'enveloppe de deux souches de grippe A et comment déterminer leur infectiosité. Ce protocole est très adaptable pour développer des pps de n'importe quel autre type de virus enveloppés avec différentes glycoprotéines d'enveloppe.

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Le système de vecteur d’expression de baculovirus (BEVS) est une plate-forme robuste pour le criblage d’expression et la production des méthyltransférases d’arginine de protéine (PRMTs) à utiliser pour des études biochimiques, biophysiques et structurelles. Des quantités milligrammes de matière peuvent être produites pour la majorité des PRT et d’autres protéines d’intérêt nécessitant une plate-forme d’expression eucaryote.

Production de protéines PRMT recombinantes à l’aide du système vectoriel d’expression du baculovirus

Nous décrivons ici un protocole pour l’emballage des pseudovirus et la mesure de l’activité neutralisante des anticorps.

Préparation de virus pseudo-typés H5 de la grippe aviaire avec procédé de transfection de phosphate de calcium et mesure de l’activité neutralisante des anticorps

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Lexpression de lhémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à laide du système dexpression baculovirus (Vidéo) | JoVE Journal

L'expression de l'hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l'aide du système d'expression baculovirus

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