L'expression de l'hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l'aide du système d'expression baculovirus

L’objectif global de cette procédure est de générer des glycoprotéines de surface purifiées correctement repliées de la grippe, de l’hémagglutinine et de la neuraminidase pour des tests immunologiques et des expériences de vaccination. Ceci est accompli en clonant d’abord le BMid recombinant portant les gènes de la grippe, puis en générant des virus baula recombinants. La deuxième étape consiste à utiliser ces virus baula recombinants pour exprimer les protéines hémagglutinine et neuraminidase dans les cellules d’insectes.

Ensuite, les protéines recombinantes sont purifiées à partir du surnageant de culture cellulaire à l’aide de la chromatographie d’affinité. La dernière étape consiste à caractériser ces protéines pour garantir une bonne qualité et une fonctionnalité biologique. En fin de compte, les protéines recombinantes sont utilisées pour étudier les réponses immunitaires aux glycoprotéines de surface du virus de la grippe.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’expression bactérienne de HA one, par exemple, est que les antigènes purifiés sont repliés correcteurs et restent également biologiquement actifs, par opposition à l’utilisation de préparations de virus entiers pour les tests immunologiques. Ces réactifs permettent de mesurer les réponses immunitaires contre les protéines hémagglutinine et non neuraminidase. Seulement Commencer ce protocole avec la génération du virus baula recombinant comme décrit dans le protocole textuel fonctionnant aseptiquement dans une plaque de hotte à flux laminaire, SF neuf cellules d’insectes dans six plaques de puits à une densité de 200 000 cellules par centimètre carré.

Et asseyons-nous pendant 20 minutes dans un incubateur à 28 degrés Celsius sans CO2. Mélangez ensuite deux microgrammes de dos recombinant avec 100 microlitres de Trico Leia formulation de milieu de genou HINK ou TNM fh. Mélangez ensuite six microlitres de l’agent de transfection avec 100 microlitres de milieu anti-insectes TNM FH.

Mélangez doucement les deux volumes et laissez reposer le mélange de transfection pendant 20 minutes. À température ambiante, incluez une transfection fictive comme contrôle, qui contient le réactif de transfection mais pas d’ADN. Retirez le SNAT des neuf cellules SF plaquées et remplacez-les par deux millilitres de milieu TNM FH sans sérum contenant une solution de streptomycine à 1 % de pénicilline.

Ajoutez le volume complet du mélange de transfection dans les cellules et secouez soigneusement la plaque à six puits pendant cinq secondes. Incuber dans un incubateur à 28 degrés Celsius sans CO2 pendant six heures. Remplacez le milieu par un milieu TNM FH complet et frais avant d’incuber la plaque dans les mêmes conditions pendant six jours.

Vérifiez les cellules de temps en temps au microscope. Les cellules infectées semblent généralement plus grosses. Les ronds ont des noyaux élargis et commencent à se détacher.

Récolter les cellules six jours après la transfection par centrifugation à 2000 G pendant cinq minutes à température ambiante. Le surnageant contient le virus baula recombinant et sera utilisé pour générer des stocks de travail immédiatement, ou peut être stocké à quatre degrés Celsius pendant des années. Vérifier l’expression des protéines à l’aide de la page SDS et du western blot et préparer les stocks de travail comme décrit dans le protocole textuel.

Les neuf cellules SF soutiennent très bien la croissance du virus maculaire. Cependant, leur capacité à sécréter de grandes quantités de protéines recombinantes est limitée. Par conséquent, nous utilisons une autre lignée cellulaire d’insecte.

High five cellules pour l’expression des protéines recombinantes sécrétées. Ces cellules ne favorisent pas la croissance du virus balo à des titres élevés, mais elles ont une capacité sécrétoire très élevée. Cultivez cinq cellules hautes dans un milieu de culture de cellules d’insectes SFX dans des flacons de 175 centimètres carrés tous les deux jours.

En les divisant dans un rapport de un à trois. Cultivez cinq flacons confluents pour une culture d’expression de 200 millilitres afin de récolter et d’infecter les cinq cellules supérieures. Tout d’abord, détachez les cellules des cinq hautes cellules en tapotant les flacons.

Récupérez la suspension cellulaire et transférez-la dans des tubes de centrifugation de 50 millilitres. Faites tourner les tubes à 1200 G pendant sept minutes à température ambiante. Retirer le surnageant par décantation et unir les granulés par réanimation, en les suspendant dans 15 millilitres de bouillon de phosphate

Laissez les cellules reposer pendant 15 minutes dans la hotte d’écoulement. Transférez 200 millilitres de milieu de culture SFX à haut clone dans une fiole agitée propre et stérile de 1000 millilitres. Transférez ensuite la suspension à trois cellules P dans le joint du flacon d’agitation avec une feuille d’aluminium stérile avant de l’agiter à 70 tr/min et 28 degrés Celsius pendant 72 à 96 heures.

Récolter des protéines recombinantes à partir de surnageants à haute expression cellulaire de 72 à 96 heures après l’infection. Transférez les surnageants de culture dans des godets de centrifugation de 500 millilitres. Faites tourner à 5 500 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Pendant ce temps, rincez trois fois le ballon shaker avec de l’eau distillée deux fois. Pipette suivante. Trois millilitres de résine de nickel s’accumulent dans un tube de 50 millilitres avec 45 millilitres de PBS pour 200 millilitres de culture.

Bien agiter avant d’essorer pendant 10 minutes à 3000 G et à température ambiante après centrifugation. Décantez le PBS et conservez la pastille. Mélangez le surnageant de cellules d’insecte avec la pastille de résine de nickel et transférez-le dans les flacons déjà rincés.

Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux à quatre heures en secouant. Ensuite, montez une colonne en polypropylène de 10 millilitres sur une pince sur un support de support. Retirez les deux capuchons et placez un bécher sous la colonne pour recueillir le flux.

Après l’incubation de l’agitateur, commencer à transférer le mélange de boue surnageante sur la colonne. Il conservera la résine de nickel et seul le surnageant s’écoulera à travers. Passez l’intégralité du volume sur la colonne.

Lavez la résine quatre fois avec 15 millilitres de tampon de lavage. Laissez le tampon de lavage s’écouler de la colonne et fermez la face inférieure avec le bouchon. Ajoutez deux millilitres de tampon elucian et laissez reposer pendant cinq minutes.

Ouvrez la colonne et récupérez l’eit, en le gardant sur de la glace humide dans la mesure du possible. Répétez cette opération trois fois de plus. Un EIT qui contient de fortes concentrations de protéines présente généralement de la mousse lorsqu’il est secoué pour remplacer le tampon et concentrer d’abord la protéine, des unités de centrifugation par ultrafiltration de 15 millilitres avec PBS à 3000 G et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Jetez le flux et chargez l’EIT sur la colonne de centrifugation. Remplissez la colonne avec cinq millilitres de PBS stérile et glacé avant d’essorer dans les mêmes conditions pendant 60 minutes. Évacuez à nouveau le flux, remplissez avec 15 millilitres de PBS glacé et essorez pendant 60 minutes supplémentaires.

Répétez cette procédure une fois de plus, puis récupérez le concentré échangé de tampon qui représente la protéine recombinante hautement concentrée. Gardez le concentré sur la glace en tout temps. Rincez la colonne d’essorage avec 400 microlitres de PBS stérile et glacé et ajoutez-le au concentré.

La protéine peut ensuite être caractérisée comme décrit dans le protocole textuel. Les protéines HA et NA exprimées par les souches ENUE et Shanghai ont montré des niveaux d’expression modérés allant de 0,2 milligramme par litre de culture pour la grippe A prélevée à Shanghai à 0,7 milligramme par litre pour la grippe. A prélevés dans les molécules d’enue, de neuraminidase ou de NA des deux souches ont montré des niveaux d’expression modérés allant de 0,2 milligramme par litre de culture pour la grippe A collectée à Shanghai à 0,7 milligramme par litre pour la grippe A collectée à enue.

Les quatre préparations protéiques contenaient très peu ou pas d’impuretés, les ha étant d’une pureté supérieure à celle du nas, ce qui peut s’expliquer par le niveau d’expression. La grippe A recueillie à Shanghai HA a été analysée plus en détail à l’aide d’ELI SA avec l’anticorps monoclonal humain CR 9, 1, 1, 4, largement neutralisant. Comme indiqué ici en bleu, cet anticorps monoclonal se lie à un épitope de confirmation sensible dans le domaine stock et est utilisé ici comme sonde pour le repliement correct de ce domaine.

L’anticorps montre une bonne liaison, comme en témoigne l’augmentation de l’absorbance à 490 nanomètres, ce qui donne confiance que l’AH est effectivement correctement plié. Une seconde, Eliza avec anti hémagglutinine du sous-type sept, sérum polyclonal de souris a été réalisée pour confirmer l’identité de la protéine obtenue comme hémagglutinine d’origine du sous-type sept. Après avoir regardé cette vidéo, vous avez une bonne compréhension de la façon d’exprimer les protéines du virus de la grippe recombinante, de l’hémagglutinine et de la neuraminidase dans votre laboratoire.

Ce processus pourrait également être utile pour l’expression d’autres protéines membranaires virales ou cellulaires. Je vous souhaite bonne chance dans vos expériences.