Production d’ARN pour l’analyse transcriptomique à partir de corps cellulaires de motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser

L'objectif général de cette procédure est de récupérer un ARN de haute qualité à partir de motoneurones de la moelle épinière, sans contamination par l'ARN provenant des cellules voisines. Cela est réalisé en premier lieu en récupérant, divisant et incluant la moelle dans un milieu d'inclusion cryogénique, puis en la congelant à moins 160 degrés Celsius. La deuxième étape consiste à réaliser des coupes cryogéniques de la moelle sur des lames à membrane PEN à moins 20 degrés Celsius.

Ensuite, les lames sont lavées dans de l'éthanol à 70 % et colorées avec du bleu d’Azure B dans de l’éthanol à 70 %. La dernière étape consiste en la microdissection par capture laser des corps cellulaires des motoneurones identifiés, directement dans un tampon de lyse contenant de la thiocyanate de guanidine. Enfin, l’ARN total est préparé à partir des lysats combinés et analysé afin de révéler d’éventuelles différences dans la transcription d’ARN général ou spécifique dans les neurones d’animaux mutants par rapport aux animaux de type sauvage.

La microdissection par capture laser permet de récupérer des corps cellulaires de motoneurones à partir de sections de moelle épinière sans contamination par les cellules de type Scalia et d'autres types cellulaires plus nombreux. Cela offre la possibilité de préparer de l'ARN et de comparer la transcription entre des neurones provenant d'un animal malade et d'un animal normal. L'aspect le plus difficile dans le développement de cette procédure a été de trouver une méthode de coloration qui nous permettrait de détecter les motoneurones dans les sections de moelle épinière tout en maintenant un niveau élevé d'intégrité de l'ARN et sa capacité d'extraction, tant avant qu'au cours de la capture laser.

Nous avons constaté que la coloration des sections dans le bleu d’Azure B et dans de l’éthanol à 70 % répondait à ces critères lorsqu’elle était associée à la collecte directe des corps cellulaires disséqués dans un tampon de lyse à la guanidine thiocyanate, démontrant ainsi la procédure est ine Van Padia, postdoctorante dans notre laboratoire. Pour de meilleurs résultats, assurez-vous que tout l’équipement est nettoyé avec une solution désinfectante pour ARN, suivie d’éthanol à 70 % sans ARNase, après l’euthanasie et la perfusion transcardiale. Isolez soigneusement la moelle épinière. Rincez la moelle pendant 10 secondes dans des ARNases.

De l’eau libre pour rincer tout sang résiduel et déposer délicatement mais rapidement sur une lame en verre exempte de RNAs. Ensuite, diviser la moelle épinière transversalement à l’aide d’un nouveau rasoir en neuf à dix morceaux. Placer les morceaux dans un moule cryogénique rempli de OCT et les aligner verticalement à l’aide d’une aiguille propre.

Placer le moule dans un bac peu profond contenant du méthylbutane prérefroidi à l'azote liquide. Pour éviter la dégradation de l'ARN, placer le bac dans un bain d'azote liquide afin de congeler rapidement les fragments de moelle épinière.

Conserver le bloc inclus dans l'OCT à moins 80 degrés Celsius pendant jusqu'à six mois avant la coupe. Lorsque vous êtes prêt à effectuer la section, placer le bloc inclus dans l'OCT dans un cryostat refroidi. Réaliser des tranches de 20 micromètres, chacune contenant de neuf à dix sections transversales de la moelle épinière.

Placer les sections sur une membrane exempte d'ARN. Les lames de deux microns sont conservées initialement à température ambiante pour garantir l'adhérence des sections. Bien refermer immédiatement la section sur une surface à moins 20 degrés Celsius à l'intérieur du cryostat.

Conserver les lames à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation sur une grille propre. Six tubes coniques de 50 millilitres remplis d'éthanol à 70 %, exempt d'ARN. La profondeur doit être suffisante pour recouvrir toutes les sections d'une lame lorsque celle-ci est immergée.

Placez ensuite la solution de bleu d’Azure B à 1 % sur le même support. Pour minimiser le temps entre les changements de solution lors du lavage ou de la coloration, gardez trois ou quatre lingettes de laboratoire devant le support afin d’éliminer rapidement l’excès de solution. Lorsque vous êtes prêt, sortez les lames du congélateur à -80 degrés Celsius et placez-les sur de la glace sèche ; faites décongeler une lame en la posant sur la paume gantée.

Retirez la majeure partie de l'humidité et de la condensation sur la lame en l'essuyant avec un chiffon de laboratoire, en prenant soin de ne pas toucher les sections. Placez la lame sur un dessiccant de gel de silice fraîchement renouvelé dans une boîte de Pétri pendant 30 à 40 secondes afin de la faire sécher complètement. Une fois sèche, plongez la lame dans le premier tube d'éthanol à 70 %, exempt de RNAses.

Plonger la lame pendant 30 secondes, puis rincer le OCT en la trempant de haut en bas pendant 45 secondes à une minute. Ensuite, retirer la lame de la solution et éliminer le liquide excédentaire en l'essuyant avec des essuie-tout de laboratoire. Répéter cette opération en trempant la lame dans le deuxième tube contenant de l'éthanol à 70 %.

Si du OCT subsiste autour des sections de la moelle épinière, répétez le lavage dans le troisième tube. Après avoir éliminé le liquide excédentaire, plongez la lame dans une solution de 1 % de bleu de méthylène (Azure B) dans de l'éthanol exempt d'ARN à 70 % pendant 30 à 45 secondes. Éliminez l'excès de bleu de méthylène sur un essuie-tout de laboratoire.

À ce stade, la lame entière sera bleue. Plongez la lame dans le tube suivant contenant de l'éthanol à 70 % et agitez-la rapidement de haut en bas trois à quatre fois afin d'éliminer l'excès de colorant et de rendre visible la coloration spécifique des motoneurones. Si les sections apparaissent très fortement colorées, répétez l'étape de décoloration dans un tube neuf contenant de l'éthanol à 70 %.

Si la coloration semble trop pâle, replacer la lame dans la solution de bleu d'Azure B pendant encore 32 secondes et répéter la décoloration. Si la coloration est satisfaisante, laisser sécher la lame à l'air brièvement, puis passer à l'étape suivante. Après la coloration DES et le séchage, la substance grise apparaîtra en bleu clair et les motoneurones colorés en bleu foncé seront facilement visibles.

Commencez la dissection immédiatement après avoir allumé le microscope. Déchargez le porte-tube afin d'attacher le bouchon d'un microtube de 0,6 millimètre. Pour la collecte de l'échantillon, placez 30 microlitres de tampon de lyse au thiocyanate de guanidine dans le bouchon et recouvrez la surface en étalant la solution.

À l’aide d’une pipette, alignez le capuchon avec le trou et l’objectif. À l’aide du logiciel du microscope, maintenez le capuchon en position fermée jusqu’au début de la capture laser. Placez la lame séchée à l’air, retournée, sur la platine du microscope de sorte que la face du membrane soit orientée vers le bas et que la section soit alignée avec le trou.

Avec la lame en place, focalisez sur une section de la moelle épinière avec l'objectif cinq x, puis passez à l'objectif 20 x pour la dissection. Commencez par marquer une région témoin à l’aide du stylet lumineux et laissez le laser la découper sans la récupérer. Cela détend la membrane et permet de marquer et de découper plusieurs régions successivement.

Ensuite, recentrez et identifiez les motoneurones dans la région du cornet ventral. Ces neurones sont reconnaissables à leur emplacement, leur morphologie caractéristique, leur grande taille et leur coloration bleu foncé avec l’Azure B. À l’aide du stylet lumineux, sélectionnez l’outil de dessin et tracez le long du contour des motoneurones afin d’en faire un tracé complet. Essayez de réaliser un contour aussi proche que possible du motoneurone afin d’éviter toute contamination par d’autres cellules.

Plusieurs cellules peuvent être marquées avant la découpe, car le logiciel mémorisera les positions lorsque la découpe sera prête, placera le capuchon sous la position de découpe, puis il faudra cliquer sur le bouton de démarrage pour initier la dissection des motoneurones au laser. Réunir tous les motoneurones provenant de toutes les sections d'une lame dans le capuchon d'un même tube microfuge. Une fois le prélèvement terminé, retirer le tube microfuge du support en sortant le plateau et en extrayant délicatement le tube, puis dissoudre complètement les motoneurones et le tampon en aspirant et en redistribuant la solution plusieurs fois à l’aide d’une pipette.

Transférez la solution dans la partie inférieure du tube par centrifugation, puis congélez immédiatement l'échantillon dans de la glace sèche et stockez-le à moins 80 degrés Celsius après la coloration à l'Azure B. Les motoneurones apparaissent comme de grands corps cellulaires fortement colorés. Ils sont confirmés par la coloration aux anticorps anti-CHATT et se distinguent facilement des cellules voisines plus petites. Dans cet exemple, les corps cellulaires des motoneurones ont été délimités au stylet lumineux et numérotés par le logiciel.

Ici, les corps cellulaires ont été découpés au laser et sont tombés dans le tube de collecte, les contours ayant été désactivés. L'importance des dommages causés par le laser aux régions voisines est apparente. Les résultats typiques d'une analyse électrophorétique de l'intégrité de l'ARN d'un échantillon provenant d'environ 4 000 corps cellulaires de motoneurones de souris collectés par microdissection laser (LMD) sont présentés ici.

Remarquez les pics prononcés d'ARN ribosomique. Ce processus, allant de la coloration de la lame jusqu'à la dissection des motoneurones, doit être réalisé en moins de 30 minutes pour toutes les sections d'une même lame afin de minimiser la dégradation de l'ARN. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler aussi rapidement que possible, tant lors de la dissection initiale et de l'encapsulation de la moelle, que lors des étapes finales de coloration et de microdissection au laser des motoneurones.