Production d’ARN pour l’analyse transcriptomique à partir de corps cellulaires de motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser

L’objectif global de cette procédure est de récupérer de l’ARN de haute qualité à partir des motoneurones de la moelle épinière sans contamination par l’ARN des cellules voisines. Ceci est accompli en récupérant, divisant et enfonçant d’abord le cordon dans un milieu d’enrobage cryogénique et en le congelant à moins 160 degrés Celsius. La deuxième étape consiste à cryo-sectionner le cordon sur des lames à membrane d’enclos à moins 20 degrés Celsius.

Ensuite, les lames sont lavées à l’éthanol à 70 % et tachées à l’Azure B à l’éthanol à 70 %. La dernière étape est la micro-dissection par capture laser des corps cellulaires des motoneurones identifiés dans un tampon de lyse de thiocyanate de chine. En fin de compte, l’ARN total est préparé à partir des lysats combinés et testé pour découvrir des différences dans la transcription générale ou spécifique de l’ARN dans les neurones des animaux mutants par rapport aux animaux de type sauvage.

La microdissection par capture laser permet de récupérer les corps cellulaires des motoneurones à partir de sections de moelle épinière sans contamination par le Scalia plus nombreux et d’autres types de cellules. Offrant une chance de préparer l’ARN et de comparer la transcription entre les neurones d’un animal malade et d’un animal normal. L’aspect le plus difficile de la mise au point de cette procédure a été de trouver une méthode de coloration qui nous permettrait de détecter les motoneurones dans les sections de la moelle épinière tout en maintenant des niveaux élevés d’intégrité de l’ARN et de capacité d’extraction, avant et pendant la capture laser.

Nous avons constaté que les sections de coloration dans l’Azure B et l’éthanol à 70 % répondaient à ces critères lorsqu’elles étaient combinées à la collecte des corps cellulaires disséqués directement dans le tampon de lyse du thiocyanate de Guine, démontrant la procédure est ine Van Padia, postdoc dans notre laboratoire Pour les meilleurs résultats. Assurez-vous que tout l’équipement est nettoyé avec une solution décontaminante à base d’ARN suivie d’éthanol sans ARN à 70 % après euthanasie et perfusion transcardique. Isolez soigneusement la moelle épinière. Rincez le cordon pendant 10 secondes dans des ARN.

De l’eau gratuite pour éliminer tout sang résiduel et déposez-la sur une lame de verre sans ARN très doucement mais rapidement. Ensuite, divisez la moelle épinière transversalement à l’aide d’une lame de rasoir propre en neuf à 10 morceaux. Positionnez les pièces dans un moule cryogénique rempli d’OCT et alignez-les verticalement à l’aide d’une aiguille propre.

Placez le moule dans un plateau peu profond contenant deux pré-refroidissements au méthylbutane avec de l’azote liquide. Pour éviter la dégradation de l’ARN, placez le plateau dans un bain d’azote liquide. Pour congeler rapidement les morceaux de moelle épinière.

Stockez le bloc encastré OCT à moins 80 degrés Celsius jusqu’à six mois avant de sectionner. Lorsqu’il est prêt pour la position de sectionnement, l’OCT intègre le bloc dans un cryostat réfrigéré. Produisez des tranches de 20 microns contenant chacune neuf à 10 sections transversales de la moelle épinière.

Placez les sections sur la membrane du stylo libre d’ARN. Lames de deux microns maintenues initialement à température ambiante pour s’assurer de l’adhérence des sections. Eh bien, recongelez immédiatement la section sur une surface négative de 20 degrés Celsius à l’intérieur du cryostat.

Gardez les lames à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient utilisées sur une plage de support propre. Six tubes coniques de 50 millilitres remplis d’ARN sans 70 % d’éthanol. La profondeur doit être suffisante pour couvrir toutes les sections d’une diapositive lorsque la diapositive est immergée.

Placez ensuite 1 % de solution Azure B sur le même rack. Pour minimiser le temps entre les changements de solutions pendant le lavage ou les taches, gardez trois ou quatre lingettes de laboratoire devant le support pour évacuer rapidement l’excédent de solution. Lorsque vous êtes prêt, sortez les lames du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez-les sur de la glace sèche pour décongeler une lame en la plaçant sur une paume gantée.

Éliminez la majeure partie de l’humidité et de la condensation sur la lame en l’essuyant avec une lingette de laboratoire, en prenant soin de ne pas toucher les sections. Mettez la lame sur un dessiccant de gel de silice frais dans une boîte de Pétri pendant 30 à 40 secondes pour qu’elle sèche complètement. Une fois sèche, trempez la lame dans le premier tube d’ARN, libre à 70 % d’éthanol.

Faites tremper la lame pendant 30 secondes, puis rincez l’OCT en le plongeant de haut en bas pendant 45 secondes à une minute. Ensuite, retirez la lame de la solution et égouttez l’excès de liquide sur des lingettes de laboratoire. Répétez ce processus en trempant la lame dans le deuxième tube d’éthanol à 70 %.

Si l’OCT reste autour des sections de la moelle épinière, répétez le lavage dans le troisième tube. Après avoir vidé l’excès de liquide, immergez la lame dans une solution à 1 % d’Azure B dans 70 % d’ARN, de l’éthanol libre pendant 30 à 45 secondes. Égouttez l’excès d’Azure B sur une lingette de laboratoire.

À ce stade, toute la diapositive sera bleue. Immergez la lame dans le tube suivant d’éthanol à 70 % et plongez-la rapidement de haut en bas, trois à quatre fois pour éliminer l’excès de colorant et rendre visible la coloration spécifique des motoneurones. Si les sections ont l’air très foncées, répétez l’étape de coloration dans un tube frais d’éthanol à 70 %.

Si la coloration semble trop légère, retournez la lame dans la solution Azure B pendant 32 autres minutes et répétez la coloration. Si la coloration est satisfaisante, laissez la lame sécher brièvement à l’air libre et passez à l’étape suivante. Après la coloration et le séchage du DES, la matière grise sera bleu clair et les motoneurones colorés en bleu profond seront facilement visibles.

Démarrez la dissection immédiatement après avoir allumé le microscope. Déchargez le support de tube pour fixer le capuchon d’un micro-tube de fuge de 0,6 millimètre. Pour le prélèvement d’échantillons, mettez 30 microlitres de tampon de lyse de guine et de thiocyanate dans le capuchon et couvrez la surface en étalant la solution.

À l’aide d’une pointe de pipette, alignez le capuchon avec le trou et l’objectif. Avec l’usure du logiciel du microscope, maintenez le capuchon en position couverte jusqu’au début de la capture laser. Placez la lame séchée à l’air à l’envers sur la platine du microscope de sorte que le côté de la membrane soit orienté vers le bas et que la section soit alignée avec le trou.

Une fois la diapositive en place, concentrez-vous sur une section de la moelle épinière avec l’objectif cinq x, puis passez à l’objectif 20 x pour la dissection. Tout d’abord, marquez une région factice avec le stylo laser et laissez le laser la découper sans la collecter. Cela détend la membrane et permet de marquer et de couper successivement plusieurs régions.

Ensuite, recentrez et identifiez les motoneurones dans la région de la corne ventrale. Ces neurones sont reconnaissables à leur emplacement, à leur morphologie parmale, à leur grande taille et à leur coloration bleu foncé avec Azure B.À l’aide du stylo lumineux, sélectionnez l’outil de dessin et marquez le long du bord des motoneurones en faisant un contour complet. Essayez de faire le contour aussi près que possible du motoneurone pour éviter la contamination par d’autres cellules.

Plusieurs cellules peuvent être marquées avant la coupe puisque le logiciel se souviendra des positions lorsqu’il sera prêt à couper, amènera le capuchon sous la position de coupe et cliquera sur le bouton de démarrage pour lancer la dissection du motoneurone avec le laser. Collectez tous les motoneurones de toutes les sections sur une seule diapositive dans le capuchon d’un tube de micro-fuge. Une fois la collecte terminée, sortez le tube de micro-fuge du support en déchargeant le plateau et en délogeant doucement le tube, dissolvez complètement les motoneurones et tamponnez en pipetant la solution de haut en bas.

Déplacez la solution dans le corps du tube par centrifugation, congelez immédiatement l’échantillon dans de la glace sèche et stockez-le à moins 80 degrés Celsius après coloration avec Azure B. Les motoneurones apparaissent sous la forme de grands corps cellulaires colorés de noir. Ils sont confirmés par des anticorps anti-CHATT, des colorants et sont facilement différenciés des cellules voisines plus petites. Dans cet exemple, les corps cellulaires des motoneurones ont été décrits à l’aide d’un stylo laser et numérotés par le logiciel.

Ici, les corps cellulaires ont été découpés avec le laser et déposés dans le tube de collecte avec les contours éteints. L’étendue des dommages causés par le laser aux régions voisines est évidente. Les résultats typiques d’une analyse électrophorétique de l’intégrité de l’ARN d’un échantillon d’environ 4 000 corps cellulaires de motoneurones de souris collectés par LMD sont présentés ici.

Notez les pics proéminents d’ARN ribosomique. Ce processus, de la coloration de la lame à la dissection des motoneurones, doit être terminé en 30 minutes pour toutes les sections d’une seule lame afin de minimiser la dégradation de l’ARN. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler de travailler le plus rapidement possible, à la fois dans la dissection initiale et l’intégration du cordon, ainsi que dans les étapes finales de coloration et de microdissection par capture laser des motoneurones.