Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de purifier des sous-populations de cellules précurseurs multipotentes issues de vaisseaux sanguins humains à partir d'une seule biopsie de muscle squelettique. Tout d'abord, dissocier la biopsie musculaire et la digérer à l'aide d'une combinaison de collagénase de type un, deux et quatre. Ensuite, marquer la suspension monocellulaire avec des anticorps conjugués à des fluorochromes qui reconnaissent une combinaison de marqueurs spécifiques de surface cellulaire. Puis, effectuer un tri cellulaire activé par fluorescence par cytométrie en flux.

Visualisez et développez les sous-types cellulaires triés dans des conditions de culture spécifiques et à des densités optimales. En fin de compte, l'analyse post-tri des cellules purifiées, ainsi que les analyses ultérieures par cytométrie en flux et RT-PCR des sous-ensembles cellulaires cultivés, permettent de démontrer la pureté de ces sous-ensembles homogènes de BVSE. Oui, cette méthode permet effectivement de répondre à la question suivante : quelle est l'origine de ces cellules souches mésenchymateuses ?

Vous savez, parce que de nombreuses personnes ont découvert différents types de cellules souches dans divers tissus. Je pense donc que cela peut permettre de comprendre l'origine de ces cellules souches, ainsi que le rôle joué par les cellules périvercutaires et toute autre cellule dérivée des vaisseaux sanguins dans la régénération et la réparation tissulaires. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, tout comme la biopsie musculaire.

Les étapes de dissociation peuvent être difficiles à apprendre. Les détails techniques et l'optimisation de la digestion par la collagénase sont très critiques pour le rendement et la purification des cellules cibles. Transporter la biopsie de muscle squelettique humain sur de la glace.

Dans du DM M supplémenté avec 5 % FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine, en conditions stériles. Laver l'échantillon deux fois avec du PBS contenant 2 % d'antibiotique-antifongique, puis dans du DMS, supplémenté avec 2 % d'aa. Retirer les tissus adipeux et conjonctif attachés.

Retirer également les gros vaisseaux sanguins au microscope stéréoscopique. Découper ensuite l'échantillon musculaire en petits morceaux. Transférer les échantillons dans 20 millilitres de milieu de conservation pour un stockage à quatre degrés Celsius pendant cinq jours au maximum.

Le jour de l'isolement cellulaire, retirez les morceaux de muscle et lavez-les deux fois dans du PBS contenant 2 % de pen strip. Pour préparer la solution de digestion, ajoutez 100 milligrammes par millilitre de chacun des collagénases de type I, de type II et de type IV dans du PM.

Enfin, hachez et broyez mécaniquement les morceaux de muscle avec une petite quantité de pm. Faites passer la solution à travers une pipette serologique de 10 millilitres en surveillant l'absence de coagulation. Éliminez les résidus de tissu adipeux et conjonctif au cours de cette étape.

Ensuite, transférez la moitié de l'échantillon adulte dans 20 millilitres ou la totalité de l'échantillon fœtal dans 10 millilitres de la solution de digestion. Incubez l'échantillon 50 à 60 minutes à 37 degrés Celsius sur un agitateur orbital à 70 à 80 tr/min. Observez l'état de la digestion toutes les 15 à 20 minutes.

Optimisez le rendement cellulaire et la préservation des antigènes de surface en ajustant le temps de digestion et/ou la vitesse d'agitation en fonction de la quantité de tissu ; lorsque la turbidité s'éclaircit presque complètement, pipetez vigoureusement le tissu digestif trois à cinq fois. Ajoutez une quantité égale de PM pour arrêter la réaction, puis centrifugez à 400 Gs pendant quatre minutes. Retirez soigneusement le surnageant, lavez le culot et resuspendez-le dans 10 millilitres de PM. Filtrez à l’aide d’un tamis cellulaire de 100 microns, centrifugez à 400 Gs pendant quatre minutes, puis retirez soigneusement le surnageant.

Ensuite, reprenez le culot dans un tampon de lyse des érythrocytes et filtrez à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 microns pour obtenir une suspension monocellulaire. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, filtrez la suspension à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres. Si un précipité est observé, centrifugez pour récupérer le culot cellulaire.

Suspendre dans 0,5 millilitre de PBS et dénombrer le nombre de cellules pour la coloration. Diluer la suspension monocellulaire à moins de 5 millions de cellules par millilitre avec une aliquote de PBS, de 50 à cent microlitres de la suspension cellulaire, et répartir dans 11 tubes pour le témoin non coloré, les contrôles négatifs et les contrôles positifs monocolorés. Si nécessaire, bloquer la suspension monocellulaire pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans du sérum de souris.

Ajoutez les solutions d'anticorps selon le plan expérimental et incubez pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez les cellules par centrifugation et lavez chaque culot une fois dans du PM dilué à une concentration finale de 5 millions de cellules par millilitre pour l'exclusion des cellules mortes, à une dilution de un à 100 de seven a a d, puis incubez pendant 15 minutes à température ambiante pour le témoin négatif et les témoins positifs monocolorés. Resuspendez les culots cellulaires dans 0,5 millilitre de PM dilué.

Transférez toutes les suspensions cellulaires dans des tubes cylindriques en polystyrène pour cytométrie en flux. Préparez maintenant des tubes de collecte de cellules contenant 500 microlitres du milieu de culture approprié. Transportez les suspensions cellulaires sur glace jusqu'à la cellule.

Triez rapidement les suspensions cellulaires sur le cytomètre en flux, dans l'ordre suivant : contrôle non coloré, contrôles négatifs, contrôles positifs monocolorés et suspension cellulaire principale, tout en ajustant rigoureusement l'intensité des lasers, la compensation des canaux et la sélection des populations cellulaires afin de maximiser la pureté cellulaire. Récupérez les populations cellulaires souhaitées dans les tubes de collecte appropriés. Conservez les cellules recueillies à quatre degrés Celsius.

Si la mise en culture n'est pas effectuée immédiatement. Ensemencer fraîchement triées. Des cellules endothéliales myogéniques dans du MPM sur des plaques pré-enduites de collagène de type I pour l'ensemencement ultérieur des cellules ECS.

3 500 à 4 000 cellules par centimètre carré en MPM sur des plaques ou des flacons pré-enrobés de collagène de type I. Parasites fraîchement triés en milieu e gm deux sur des plaques fraîchement enrobées de gélatine à 0,2 % pour le premier et le deuxième passage. Diviser les cellules selon un rapport de un à trois en milieu PC sur une culture en polystyrène ordinaire.

Plaques à partir du passage trois. Observer les cellules à une densité de 6 500 à 7 000 cellules par centimètre carré dans le milieu PC sur des plaques de culture en polystyrène ordinaire. Pour les flacons, observer les cellules fraîchement triées issues du tissu adventice dans le milieu AC sur des plaques de culture en polystyrène ordinaire, puis procéder à l'ensemencement ultérieur des cellules souches ACS à une densité de 6 000 à 7 000 cellules par centimètre carré dans le milieu AC sur des plaques de culture en polystyrène ordinaire.

Les paramètres des faits de flacon sont d'abord corrigés en fonction des données obtenues à partir du témoin non marqué, des contrôles négatifs et des contrôles positifs monocolorés, après élimination des cellules mortes. La suspension cellulaire marquée de façon fluorescente est ensuite soumise à une série de sélections négatives et positives de marqueurs de surface cellulaire. Tout d'abord, les cellules positives pour CD45 sont sélectionnées. Ensuite, les cellules positives pour CD56 et les cellules négatives pour CD56 sont séparées à partir de la fraction négative pour CD45.

La fraction positive pour le CD 56 est ensuite soumise à une sélection par le CD 34 et le CD 1 44, où seules les cellules doublement positives sont identifiées comme des cellules endothéliales myogéniques et collectées par la suite. De même, la fraction négative pour le CD 56 est soumise à une sélection par le CD 34 et le CD 1 46, où seules les cellules négatives pour le CD 34 et positives pour le CD 1 46 sont marquées comme des parasites et collectées ; la fraction positive pour le CD 34 et négative pour le CD 1 46 fait l'objet d'une sélection supplémentaire négative par le CD 31 afin d'exclure les cellules endothéliales, et seul le sous-ensemble positif pour le CD 34 et négatif pour le CD 31 est identifié comme des cellules adv pour la collecte. Ici, le CD 1 44 peut être utilisé à la place du CD 31 pour l'exclusion des cellules endothéliales (EC).

Ces sous-populations de C-S-V-P-H ont été purifiées à partir de biopsies musculaires d'un donneur unique. Contrairement aux cellules souches musculaires habituellement hétérogènes, les cultures de sous-populations de cellules souches dérivées des vaisseaux sanguins humains restent homogènes, même après une expansion à long terme. Comme vous le savez, je pense qu'il est très important pour les chercheurs en auto-recherche d'utiliser la même technique pour isoler, vous savez, ces cellules souches dérivées des vaisseaux sanguins que nous avons décrites dans nos laboratoires.

Nous pensons donc que cette technique, utilisée de manière comparative, permettra aux chercheurs de reproduire nos résultats et de comparer efficacement les résultats obtenus par différentes équipes. N'oubliez pas que le travail avec des tissus humains frais peut présenter des risques extrêmement élevés. Des précautions telles que le port de gants en nitrile et de protections oculaires doivent être prises lors de la réalisation de cette procédure.