FIBS-permis non invasive au profil métabolique

L'objectif général de cette procédure est de surveiller de manière non invasive le niveau de glucose ou de glutamine intracellulaire à l'aide de biocapteurs protéiques à base de protéines génétiquement codées. Cela est réalisé en transfectant d'abord les cellules d'intérêt avec un plasmide contenant le gène du biocapteur, puis en sélectionnant les cellules exprimant ce biocapteur. Dans une deuxième étape, des échantillons de culture cellulaire sont prélevés à partir de cultures en lot ou en lot alimenté, et leurs rapports FRET sont mesurés.

La concentration intracellulaire de glucose ou de glutamine des échantillons peut ensuite être déterminée par un dosage indépendant. En fin de compte, le rapport FRET des échantillons peut être utilisé pour calculer de manière non invasive et en temps réel la concentration intracellulaire de glucose ou de glutamine. Les implications de cette technique s'étendent à l'amélioration des bioprocédés, car il s'agit d'une méthode fiable permettant d'obtenir des informations métaboliques en temps réel, utilisables pour l'optimisation et le contrôle en ligne.

Bien que la méthode puisse être utilisée pour fournir des informations sur les procédés biotechnologiques, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, notamment la détection de marqueurs de maladies. Commencez par remettre en culture des cellules CHO dans neuf millilitres de milieu de croissance complet. Ensuite, centrifugez les cellules, resuspendez le culot dans 10 millilitres de milieu de croissance frais et comptez les cellules par exclusion au bleu de trypan.

Ensuite, initier une culture à une densité d'ensemencement de trois fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre dans 125 millilitres. Incuber les fioles agitées à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 sur une plateforme d'agitation orbitale. Avec une rotation de 125 tr/min, repiquer les cellules tous les trois à quatre jours dans un milieu de croissance complet à une densité d'ensemencement de deux fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre pour la transfection cellulaire.

Conserver les cellules à 37 degrés Celsius et 5 %CO2 pendant 12 à 24 heures avant la transfection afin de s'assurer qu'elles se divisent activement. Ensuite, après avoir préparé l'ADN plasmidique, compter les cellules par exclusion au trypan bleu et diluer les cellules jusqu'à un volume de travail de 20 millilitres de milieu de culture cellulaire, dans un flacon agité de 125 millilitres, à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre.

Utilisez un kit de transfection adapté à la lignée cellulaire utilisée, en incluant au moins un puits témoin négatif contenant des cellules mais aucun ADN. Incubez les cellules transfectées pendant quatre jours en mode statique. Ajoutez ensuite l'antibiotique approprié pour la sélection du plasmide à une concentration adaptée, déterminée à l'aide d'une courbe de mortalité.

Par exemple, dans cette étude, du zin a été ajouté à une concentration finale de 400 grammes par millilitre afin de sélectionner les cellules transfectées, puis les cultures ont été transférées sur une plateforme agitée tournant à 125 tr/min. Changer le milieu à des intervalles de temps appropriés selon la lignée cellulaire, en ajoutant un antibiotique à chaque changement, jusqu'à ce que les cellules du puits témoin soient mortes. Utiliser les puits les plus confluents pour passer aux cultures agitées.

Ensuite, congeler les cellules dans des fioles cryogéniques contenant dix millions de cellules viables par millilitre de mélange de congélation afin de générer des courbes de croissance par lots et par lots alimentés. Premièrement, établir des cultures cellulaires triplicates de cellules CHO transfectées dans des flacons agités de 250 millilitres avec un volume de travail de 50 millilitres. Puis placer les cultures dans un incubateur cellulaire humidifié sous agitation et prélever des échantillons de 4,1 millilitre de chaque culture en croissance à des intervalles de 24 heures. Pour les cultures en lot alimenté, supplémenter les cellules avec la quantité appropriée de glucose ou de glutamine au jour six afin de rétablir leurs concentrations à leurs valeurs initiales.

Alimenter les cultures témoins avec le même volume d'eau pure, prélever 100 microlitres des échantillons de 4,1 millilitres de 4,2 chaque jour pour compter les cellules par exclusion au bleu de trypan jusqu'à ce que la concentration de cellules viables soit réduite à zéro. Pour déterminer les mesures du rapport FRET, centrifuger deux millilitres des échantillons quotidiens et remettre en suspension le culot dans deux millilitres de PBS glacé ; transférer la moitié de la suspension cellulaire dans une plaque à six puits et ajouter un échantillon témoin sans cellules à l'un des puits. Ensuite, mesurer immédiatement les niveaux de fluorescence bleue et jaune à une longueur d'onde d'excitation de 430 nanomètres avec une largeur de bande de 35 nanomètres, et des longueurs d'onde d'émission de 465 nanomètres avec une largeur de bande de 35 nanomètres et de 520 nanomètres avec une largeur de bande de 10 nanomètres, respectivement pour la fluorescence bleue et jaune.

Calculez les rapports de transfert d'énergie par résonance (FRET) en déterminant le rapport entre la fluorescence jaune détectée et la fluorescence bleue. Faites ensuite centrifuger les deux derniers millilitres des échantillons quotidiens, puis lavez le culot deux fois dans du PBS glacé ; après le deuxième lavage, soniquez l'échantillon cinq fois pendant trois minutes à chaque fois, avec des impulsions de 15 secondes activées suivies de 15 secondes désactivées.

Enfin, réalisez les dosages des métabolites conformément aux instructions du fabricant, et utilisez les courbes standards obtenues pour calculer les concentrations intracellulaires de glucose ou de glutamine, selon le cas. Dans cette expérience représentative, des cultures en surcroissance par lots de deux lignées cellulaires ont été maintenues comme vient d'être démontré, avec des prélèvements quotidiens utilisés pour l'étalonnage in vivo de chaque fibs. Un profil représentatif de croissance cellulaire viable des deux lignées cellulaires, en relation avec leurs concentrations intracellulaires de glucose ou de glutamine, est illustré dans ce graphique, et les mesures de fret correspondantes ainsi que les concentrations intracellulaires de métabolites déterminées par les dosages enzymatiques sont présentées dans ce tableau.

Il a été déterminé que le faible nombre de cellules présent au cours des quatre premiers jours de culture conduisait à un signal FRET peu fiable. De même, le niveau élevé de lysat cellulaire présent après huit jours de culture produisait une forte diffusion de la lumière. Par conséquent, seules les données des jours quatre à huit sont utilisées pour établir les courbes de calibration des fibres de glucose et de glutamine.

Les résultats indiquent que le signal FIB produit une corrélation fiable avec les concentrations intracellulaires comprises entre un et cinq millimolaire pour le glucose et entre 0,3 et deux millimolaire pour la glutamine. Afin de valider les résultats des fibs, des cultures surabondantes en milieu renouvelé des deux lignées cellulaires ont été réalisées. Un milieu contenant une concentration élevée de substrat a été ajouté au sixième jour de la culture cellulaire afin d'augmenter les concentrations extracellulaires du substrat.

Comme le montrent les greffes, les rapports de fret chaque jour présentent une réponse claire à l'alimentation. En inversant la tendance qu'ils suivaient jusqu'au jour six. Par exemple, dans les cultures alimentées en glucose, la concentration extracellulaire de glucose a augmenté de nouveau jusqu'à 36 millimolaire.

Alors que dans les cultures alimentées en glutamine, la concentration en glutamine a augmenté jusqu'à quatre millimolaire. Dans l'expérience au glucose, le rapport FRET pour la lignée cellulaire glucose fibs a diminué le jour sept en réponse à l'ajout de glucose. Puisque les glucose fibs suivent la configuration APO.

De même, dans l'expérience avec la glutamine, le rapport FRET pour la lignée cellulaire de fibroblastes sensible à la glutamine a augmenté suite à l'ajout de glutamine, conformément au principe des capteurs APO off. Ces mesures de FRET ont finalement été utilisées pour calculer les concentrations intracellulaires correspondantes de glucose et de glutamine, en se basant sur les courbes de calibration mentionnées précédemment. Elles sont comparées aux concentrations intracellulaires réelles de ces substrats, telles que déterminées par les dosages enzymatiques du glucose et de la glutamine, et montrent un accord satisfaisant après leur développement.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine pour explorer l'effet de différentes formulations de milieux sur la productivité des protéines. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller les concentrations intracellulaires de métabolites.