FIBS-permis non invasive au profil métabolique

L’objectif global de cette procédure est de surveiller le niveau de glucose ou de glutamine intracellulaire de manière non invasive à l’aide de biocapteurs à base de protéines génétiquement codées. Pour ce faire, il faut d’abord transecter les cellules d’intérêt avec le gène du biocapteur contenant le plasmide et sélectionner les cellules exprimant le biocapteur. Dans un deuxième temps, des échantillons de culture cellulaire sont prélevés à partir de cultures discontinues ou nourries par lots et leurs rapports de frette sont mesurés.

La concentration intracellulaire de glucose ou de glutamine des échantillons peut ensuite être déterminée par un test indépendant. En fin de compte, le rapport de frette des échantillons peut être utilisé pour calculer la concentration intracellulaire de glucose ou de glutamine de manière non invasive et en temps réel. Les implications de cette technique s’étendent à l’amélioration des bioprocédés, car il s’agit d’une méthode fiable pour obtenir des informations métaboliques en temps réel qui peuvent être utilisées pour l’optimisation et le contrôle en ligne.

Bien que la méthode puisse être utilisée pour fournir des informations sur les bioprocédés, elle peut également être utilisée dans d’autres systèmes, y compris la détection de marqueurs de maladies. Commencez par raviver les cellules CHO dans neuf millilitres de milieu de croissance complet. Ensuite, faites tourner les cellules, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de croissance fraîche, milieu, et comptez les cellules par tripes en exclusion de matrice bleue.

Ensuite, lancez une culture à une densité d’ensemencement de trois fois 10 à la cinquième cellules par millilitre dans 125 millilitres. Fioles agitatrices à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 sur une plate-forme d’agitation orbitale. Avec une rotation de 125 tr/min, sous-cultivez les cellules tous les trois à quatre jours dans le milieu de croissance complet à une densité de deux fois 10 à la cinquième cellule par millilitre pour la transfection cellulaire.

Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 12 à 24 heures avant la transfection pour vous assurer que les cellules se divisent activement. Ensuite, après avoir préparé l’ADN plasmidique, comptez les cellules par exclusion des tripes et des matrices bleues et diluez les cellules à un volume de travail de 20 millilitres de milieu de culture cellulaire. Dans une bouteille de 125 millilitres, agiter le ballon à une concentration de une fois 10 à six cellules par millilitre.

Utilisez un kit de transfection adapté à la lignée cellulaire utilisée, comprenant au moins un puits de contrôle négatif contenant des cellules, mais pas d’ADN. Incuber les cellules transfectées pendant quatre jours en mode statique. Ajoutez maintenant l’antibiotique approprié pour la sélection du plasmide à une concentration appropriée déterminée par une courbe de destruction.

Par exemple, dans cette étude, le zin a été ajouté à une concentration finale de 400 grammes par millilitre pour la sélection des cellules transfectées, puis transfert des cultures sur une plate-forme d’agitation tournant à 125 tr/min. Changez le milieu à un intervalle de temps approprié pour la lignée cellulaire, en ajoutant un antibiotique à chaque fois jusqu’à ce que les cellules du puits de contrôle soient mortes. Utilisez les puits les plus confluents pour progresser vers les cultures tremblantes.

Ensuite, congelez les cellules dans des flacons cryogéniques contenant une fois 10 à 10 à sept cellules viables dans un millilitre de mélange de congélation pour générer des courbes de croissance de lot et de lot nourri. Tout d’abord, établissez des cultures cellulaires en trois exemplaires des cellules CHO transfectées dans des flacons agités de 250 millilitres d’un volume de travail de 50 millilitres. Ensuite, placez les cultures dans un incubateur cellulaire humidifié en secouant et prélevez des échantillons de 4,1 millilitres de chaque culture en croissance à des intervalles de 24 heures. Pour les cultures par lots Fed, complétez les cellules avec la quantité appropriée de glucose ou de glutamine le sixième jour pour rétablir leurs concentrations à leurs valeurs initiales.

En nourrissant les cultures témoins avec le même volume d’eau pure, utilisez 100 microlitres des échantillons de 4,1 millilitres de 4,2 par jour pour compter les cellules par déclenchement et exclusion de la matrice bleue jusqu’à ce que la concentration de cellules viables soit réduite à zéro. Pour déterminer les mesures du rapport de frette, centrifugez deux millilitres des échantillons quotidiens et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de PBS glacé, transférez la moitié de la suspension cellulaire dans une plaque à six puits et ajoutez un échantillon vierge ne contenant aucune cellule à un. Eh bien, mesurez immédiatement les niveaux de fluorescence bleue et jaune à une longueur d’onde d’excitation de 430 avec une bande passante de 35 nanomètres et une longueur d’onde de mission de 465 avec une bande passante de 35 nanomètres et 520 avec une bande passante de 10 nanomètres pour la fluorescence bleue et jaune respectivement.

Calculez les rapports des frettes en déterminant le rapport de la fluorescence jaune détectée à celle de la fluorescence bleue. Maintenant, essorez les deux derniers millilitres d’échantillons quotidiens, puis lavez le granulé deux fois dans du PBS glacé après le deuxième lavage. Soniquez l’échantillon cinq fois pendant trois minutes, à chaque fois à une impulsion de 15 secondes de marche et de 15 secondes d’arrêt.

Enfin, effectuez les dosages de métabolites selon les instructions du fabricant et utilisez les courbes standard résultantes pour calculer les niveaux intracellulaires de glucose ou de glutamine, le cas échéant. Dans cette expérience représentative, des cultures de deux lignées cellulaires ont été maintenues, comme nous venons de le démontrer, avec des échantillons quotidiens utilisés pour l’étalonnage in vivo de chaque fib. Ce graphique démontre un profil représentatif de croissance cellulaire viable des deux lignées cellulaires en fonction de leurs taux intracellulaires de glucose ou de glutamine, et les mesures de frettes correspondantes et les concentrations de métabolites intracellulaires déterminées par les essais enzymatiques sont présentées dans ce tableau.

Il a été déterminé que le faible nombre de cellules présentes au cours des quatre premiers jours de culture entraînait un signal de frette peu fiable. De même, le niveau élevé de lysat cellulaire présent après le huitième jour de culture a produit une grande quantité de diffusion de la lumière. Par conséquent, seules les données des jours quatre à huit sont utilisées pour construire les courbes d’étalonnage des fibonaccis de glucose et de glutamine.

Les résultats indiquent que le signal FIB produit une corrélation fiable avec les concentrations intracellulaires entre un et cinq millimolaires pour le glucose et 0,3 et deux millimolaires pour la glutamine. Pour valider les résultats de la fibs, des cultures envahies par la végétation des deux lignées cellulaires ont été effectuées. Un aliment contenant une concentration élevée de substrat a été complété le sixième jour de la culture cellulaire pour augmenter les concentrations extracellulaires du substrat.

Comme le décrivent les greffons, les rapports de frettes de chaque jour montrent une réponse claire à l’alimentation. En inversant la tendance, ils ont suivi jusqu’au sixième jour. Par exemple, dans les cultures nourries au glucose, la concentration de glucose extracellulaire a augmenté jusqu’à 36 millimolaires.

Alors que dans les cultures nourries à la glutamine, la concentration de glutamine a augmenté à quatre millimolaires. Dans l’expérience sur le glucose, le rapport de frette pour les fibonaccis de glucose choisis a diminué le septième jour en réponse à l’ajout de glucose. Puisque les fibonaccis de glucose suivent l’APO lors de la configuration.

De même, dans l’expérience de la glutamine, le rapport de frette pour les fibrillations de glutamine choisies a augmenté en réponse à l’ajout de glutamine conformément au principe des capteurs APO off. Ces mesures de frettes ont finalement été utilisées pour calculer les concentrations intracellulaires de glucose et de glutamine correspondantes sur la base des courbes d’étalonnage susmentionnées. Ils sont comparés aux concentrations intracellulaires réelles de ces substrats, telles que déterminées avec les dosages enzymatiques du glucose et de la glutamine, et montrent une concordance adéquate après son développement.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’exploration de l’effet de différentes formulations de milieux sur la productivité des protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller les concentrations de métabolites intracellulaires.