Modèles DNBS / TNBS colite: Fournir connaissances sur les maladies inflammatoires de l'intestin et des effets de graisses alimentaires

L'objectif général de cette procédure est de proposer une méthode alternative et peu coûteuse pour étudier la maladie inflammatoire de l'intestin, ou MII, à l'aide d'acide dinitrobenzène sulfonique, ou DNBS. Cela est réalisé en administrant d'abord du DNBS par voie intra-rectale grâce à une insertion douce par l'anus. Dans une deuxième étape, des sections de tissu du gros intestin sont prélevées afin d'effectuer un dépistage histologique et d'évaluer l'activité de la myéloperoxydase dans les tissus exposés au DNBS. Enfin, les effets des huiles alimentaires sur la perte de poids et la colite peuvent être évalués par des méthodes macroscopiques et microscopiques.

L'avantage principal de cette méthode par rapport à la méthode existante au sulfate de dextrane sodique est que la méthode DNBS est facile à réaliser, moins coûteuse et hautement reproductible. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les MICI, telles que quel est le rôle du stress et de la dépression dans la récidive des MICI, ou quelles sont les mécanismes sous-jacents aux lésions et à la réparation intestinales. Pour l'installation rectale de DNBS chez la souris, commencez par fixer une seringue d'un millilitre à une aiguille de calibre 19. Munissez-vous d'un cathéter en polyéthylène 50, puis aspirez le DNBS fraîchement préparé dans le cathéter.

Ensuite, appliquez un gel ophtalmique sur un souris anesthésiée et exercez une pression douce avec les doigts sur l'extrémité postérieure de l'animal afin d'éliminer toute matière fécale présente dans le côlon distal. Injectez maintenant une petite quantité de la solution de DNBS afin de lubrifier le côlon pour faciliter l'insertion, tout en insérant doucement le cathéter par voie intra-rectale à une profondeur d'environ trois à quatre centimètres. Une fois le cathéter en place, injectez 100 microlitres de DNBS ou un volume équivalent d'éthanol à 50 % pour les animaux témoins.

Ensuite, placer l'animal la tête en bas pendant 90 secondes afin d'éviter la perte des réactifs. Après l'administration de DNBS, nourrir les animaux avec de l'eau contenant 8 % de saccharose dans une solution saline à 0,2 % pour prévenir la déshydratation durant la première semaine. Surveiller attentivement chaque jour les animaux en quête de perte de poids, de déshydratation ou de détresse, et ce jusqu'au point temporel souhaité de l'expérience.

Après le défi au DNBS, ouvrez la cavité abdominale de l'animal euthanasié et retirez tout le gros intestin. Ensuite, ouvrez l'intestin longitudinalement. Des ulcères muqueux macroscopiques doivent être observés à environ deux à trois centimètres en direction proximale par rapport à l'extrémité distale du côlon.

Prélevez des sections de 0,5 centimètre en amont du site présentant les lésions macroscopiques maximales chez les animaux expérimentaux, ainsi que des segments du côlon provenant des emplacements anatomiques correspondants chez les animaux témoins. Ensuite, congeler rapidement dans l'azote liquide un échantillon de 0,5 centimètre provenant d'un témoin et d'une section traitée au NBS 1D pour l'évaluation de l'activité de la myéloperoxydase, et fixer les autres sections dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant la nuit pour une analyse histologique. Le lendemain matin, rincer les tissus fixés au formol avec de l'éthanol à 70 %, puis les placer dans une cassette afin de les envoyer à un laboratoire d'histologie pour être inclus dans de la paraffine et colorés à l'hématine et à l'éosine en vue d'une évaluation histologique.

Ensuite, observer au moins trois coupes de tissu par animal au microscope optique afin de déterminer les scores de dommages histologiques pour chaque groupe. Pour doser l'activité de la myéloperoxydase dans les tissus traités au DNBS, homogénéiser d'abord les tissus contrôles et expérimentaux congelés instantanément dans un tampon d'homogénéisation pour la myéloperoxydase, de manière à obtenir une suspension contenant 50 milligrammes de segment colique par millilitre de tampon d'homogénéisation. Puis répartir l'homogénat en aliquotes d'un millilitre et centrifuger pendant deux minutes à 10 000 ×g et à 4 °C.

Ensuite, transférez 100 microlitres de chaque aliquote dans des cuvettes individuelles et ajoutez 2,9 millilitres de PBS supplémenté en IDE, en dichlorhydrate et en peroxyde d'hydrogène en mélangeant vigoureusement. Enfin, mesurez la vitesse d'absorbance à l'aide d'un spectrophotomètre à 460 nanomètres. Suite à une administration intrarectale de DNBS comme vient de l'être démontré.

Une perte de poids significative est observée après 48 heures chez les rats supplémentés en huile de poisson ou en huile de canola, et après 72 heures chez les rats supplémentés en huile de carthame. La perte de poids maximale observée se produit après 48 heures chez les rats supplémentés en huile de poisson, et après 72 heures chez les rats supplémentés en huile de canola ou en huile de carthame.

La prise de poids a repris après 72 heures et, cinq jours après l'administration de DNBS, les groupes traités à l'huile de poisson et à l'huile de carthame présentaient des masses corporelles similaires à leurs valeurs de base. Les rats témoins supplémentés avec les huiles alimentaires et soumis à de l'éthanol intra-rectal ont régulièrement pris du poids pendant toute la durée de l'étude, soit cinq jours. Les lésions intestinales provoquées par le DNBS peuvent être généralisées.

Cependant, la zone de dommages maximaux est généralement localisée dans les six centimètres distaux du côlon chez le rat et dans les trois centimètres distaux chez la souris. Lors d’un examen histologique approfondi, on observe des lésions épithéliales étendues, incluant la formation d’ulcères, une infiltration de neutrophiles et de lymphocytes, une diminution du mucus et un œdème. Bien que ces signes histologiques d’inflammation et de lésion tissulaire soient présents dans les trois groupes supplémentés en huiles alimentaires après exposition au DNBS, les dommages les plus sévères sont observés dans le groupe traité à l’huile de carthame, suivi du groupe traité à l’huile de canola.

Alors que les rats du groupe huile de poisson présentent des lésions épithéliales minimes et une infiltration limitée de cellules inflammatoires dans la muqueuse, les différences de dommages histologiques entre les échantillons peuvent être quantifiées afin de permettre une meilleure comparaison entre les groupes. Le graphique illustre les scores de dommages histologiques pour les trois groupes alimentaires en huile durant la colite induite par le DNBS.

Comme on l'observe sur les coupes colorées à l'hématoxyline et à l'éosine, le groupe supplémenté en huile de carthame présente le degré de lésion le plus élevé, suivi du groupe recevant l'huile de colza. Bien que le groupe traité à l'huile de poisson présente la moindre quantité de lésions, l'importance de l'infiltrat cellulaire inflammatoire, en particulier des neutrophiles, peut être approfondie par un dosage de l'activité de la myéloperoxydase. Ceci correspond aux scores de lésions histologiques attendus.

L'évaluation de l'activité de la myéloperoxydase dans les côlons de rats au cinquième jour suivant l'exposition au DNBS révèle une augmentation de l'activité dans les trois groupes, l'activité de la myéloperoxydase étant la plus élevée dans le groupe traité à l'huile de carthame, suivie par le groupe traité à l'huile de colza et le groupe traité à l'huile de poisson. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'anesthésier légèrement les souris et d'optimiser les doses de DNBS après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies inflammatoires de l'intestin pour explorer les mécanismes contrôlant l'inflammation intestinale dans des modèles animaux de MICI.

N'oubliez pas que le travail avec le DNBS peut être extrêmement dangereux ; des précautions telles que des vêtements de protection, des gants, des lunettes de protection et une protection faciale doivent toujours être portées lors de la préparation de la solution.