Super-résolution d'imagerie de neurones vésicules à cœur dense

L'objectif général de la procédure suivante est d'obtenir des images de fluorescence en super-résolution qui mettent en évidence des aspects importants de l'organisation des vésicules à une résolution autrement inaccessible par microscopie de fluorescence. Cela est réalisé en transfectant d'abord des neurones hippocampiques avec de l'ADN codant pour des chimères photoconvertibles de cargaison vésiculaire. Dans la deuxième étape, des images brutes échantillonnées de manière clairsemée sont acquises à l'aide du système de microscopie en super-résolution.

Ensuite, les images brutes sont traitées pour produire une image en super-résolution. Dans la dernière étape, les données sont quantifiées afin d'élucider l'organisation des vésicules. En définitive, des profils linéaires de l'intensité des points peuvent être utilisés pour comparer la séparation des vésicules à leur largeur, permettant ainsi de déterminer si les vésicules sont suffisamment proches pour former un agrégat à l'aide de cette procédure.

La microscopie de localisation photoactivable monocouleur, ou PALM, peut être utilisée pour étudier l'organisation des organites dans la plupart des types de cellules en culture. Pour démarrer le système d'imagerie super-résolution en vue de l'acquisition d'images, commencez par allumer l'alimentation de la lampe à arc. Ensuite, activez l'ordinateur du système et les interrupteurs des composants à l'aide de la télécommande d'alimentation.

Passer à l'état activé une fois que la tablette de commande du microscope est allumée, allumer l'ordinateur et lancer le logiciel. Étendre la fenêtre d'état du démarrage pour vérifier que le système se charge normalement, puis choisir l'option démarrer le système dans la fenêtre de connexion. Pour positionner l'échantillon en vue de son observation, ouvrir les panneaux avant et supérieur de l'enceinte de sécurité laser et incliner le bras de lumière transmise afin d'accéder à la platine et aux objectifs.

Ensuite, appliquez de l'huile sur l'objectif alpha plan APO Chromat 100 x pour la réflexion totale interne, la fluorescence ou l'objectif turf. Choisissez ensuite un objectif de faible grossissement pour l'étape initiale de mise au point. Placez maintenant l'échantillon sur la platine et remontez l'objectif vers l'échantillon.

Surveiller la position de l'objectif à l'aide des fonctions X, Y, Z de la tablette de commande. Arrêter lorsque l'objectif est approximativement au point de focalisation. Pour visualiser l'échantillon et affiner le réglage de mise au point.

Abaissez le bras de lumière et fermez complètement les panneaux d'accès. Ensuite, dans l'onglet localisation, cliquez sur le symbole d'expansion oculaire pour afficher un schéma du trajet de la lumière, sélectionnez « trans » et vérifiez que le schéma montre la lumière transmise provenant de l'ampoule atteignant l'échantillon. Regardez dans les oculaires et mettez les cellules au point en utilisant la tablette de commande comme guide.

Ensuite, pour identifier les cellules exprimant le DRA deux, choisissez la lumière réfléchie et le filtre approprié pour observer l'émission verte provenant du den deux. Parcourez la lame à l'aide d'une lumière réfléchie de faible intensité jusqu'à ce qu'une cellule saine et brillante soit trouvée, puis configurez le logiciel pour acquérir les données palm. Passez à l'onglet d'acquisition et utilisez le gestionnaire d'expériences pour charger la configuration d'acquisition palm expérimentale appropriée.

Lorsqu'un menu contextuel apparaît avec une demande concernant l'activation des lasers, cliquez sur oui, puis mettez au point l'image de la cellule sur le plan de la caméra. Sélectionnez uniquement la piste 488. Ajustez les paramètres d'acquisition tels que le gain E-M-C-C-D, puis choisissez l'acquisition continue.

Ensuite, ajustez l'affichage à la luminosité souhaitée et déplacez l'objectif jusqu'à ce que l'image à l'écran soit nette. Puis, pour acquérir une image classique en champ large, cliquez sur le bouton de capture et enregistrez l'image. Pour configurer l'illumination en turf sur la voie 488, sélectionnez turf sur le bouton épi-turf.

Pour optimiser l'éclairage basé sur la lame, choisissez l'acquisition continue et ajustez l'angle de la lame vers une luminosité plus faible jusqu'à ce que le fond s'assombrisse soudainement et que l'échantillon puisse être mis au point sur un seul plan. Passez à la piste 561 en désactivant le laser à 405 nanomètres. Réglez le gain E-M-C-C-D à environ 200 et le temps d'exposition à environ 50 millisecondes.

Choisissez le filtre d'émission qui transmet dans le rouge et réglez l'intensité du laser à environ 40 %. Vérifiez soigneusement l'angle du prisme pour la piste 561. Pour réduire le fond, illuminez l'échantillon jusqu'à ce que le fond s'estompe. Utilisez la piste 561 avec uniquement le laser 561 activé.

Pour collecter les données palm, allumez le laser de 405 nanomètres pour la piste 561 et réglez l'intensité du laser 405 à environ 0,01 %. Pour surveiller l'image palm calculée pendant l'acquisition, développez le menu des options de traitement en ligne et cochez le traitement palm en ligne pour un traitement avec les paramètres par défaut. Cliquez sur démarrer l'expérience pour commencer l'acquisition ; pendant la collecte des données, surveillez visuellement la photoconversion et augmentez l'intensité du laser de photoconversion de 405 nanomètres lorsque la photoconversion commence à diminuer.

Lorsque la conversion photochimique cesse d'augmenter après une augmentation de l'intensité laser, cliquez sur terminer l'étape en cours. Pour mettre fin à l'expérience, enregistrez le fichier. Pour traiter les images enregistrées, cliquez sur l'onglet traitement, développez le menu méthode, puis développez le sous-menu palm.

Choisissez à nouveau palm parmi les quatre sous-options. Sélectionnez l'image appropriée afin qu'elle apparaisse dans la fenêtre de visualisation. Développez les paramètres de la méthode et cliquez sur sélectionner pour importer l'image, puis développez le champ des paramètres et choisissez par défaut pour exécuter la détection des pics et la localisation avec les options par défaut.

Appuyez sur Appliquer dans l'onglet de traitement pour calculer l'image palm, qui apparaîtra dans un onglet séparé de la fenêtre de visualisation afin de filtrer les composants mal échantillonnés dans les données. Utilisez le théorème d'échantillonnage de Nyquist et l'outil de suppression des valeurs aberrantes palm pour supprimer les pics dans les régions où l'espacement moyen entre les pics, d minuscule, est trop grand pour résoudre une vésicule de diamètre D majuscule. Avec l'image palm dans la fenêtre de visualisation, cliquez sur Sélectionner pour importer l'image, puis cliquez sur Appliquer. La nouvelle image apparaîtra dans un onglet séparé de la fenêtre de visualisation afin de filtrer toute flore mal localisée.Fours.

Accédez à l'onglet filtre PAL et limitez la flore acceptée. Quatre précisions de localisation avec un écart-type inférieur à 35 nanomètres. Pour choisir un mode d'affichage de l'image PAL, rendez-vous dans l'onglet rendu PAL, sélectionnez une résolution en pixels et le mode d'affichage souhaité.

Dans cette image, un produit final représentatif de la paume, obtenu par imagerie et traitement d'une vésicule à noyau dense neuronale ou VND, est montré en rouge. Les coordonnées latérales des flores localisées en quadruplant, en blanc, sont affichées à l'aide du mode d'affichage Centro, et l'image de super-résolution de la vésicule associée est affichée à l'aide du mode d'affichage Gaussien. Dans cette deuxième figure, des images analogues en champ large en vert et en paume en rouge du soma et des prolongements proximaux d'un neurone hippocampique cultivé in vitro pendant huit jours exprimant tpa, un danger deux, sont présentées.

Les caractéristiques importantes des images incluent la correspondance étendue un-à-un et le recouvrement en jaune entre les points et les images conventionnelles et palm. La taille nettement plus petite des points palm et la résolution occasionnelle d'un point en champ large unique en plusieurs points palm. Ici, une image palm de D cvs le long d'une partie d'un prolongement d'un deuxième neurone hippocampique exprimant tpa.

DENDRA deux est présenté. Remarquez le petit diamètre et l'aspect homogène des points, ainsi que l'observation rare de points très proches les uns des autres, qui représentent des agrégats putatifs de VDC. Dans cette dernière figure, une méthode quantitative simple permettant de déterminer si deux VDC ou plus sont suffisamment proches pour former un agrégat est décrite.

Des profils en ligne des intensités des points sont générés comme illustré dans les graphiques, ce qui permet ensuite de quantifier la séparation des vésicules de sécrétion dense (DCV) et la largeur des DCV. Si la séparation dépasse largement la largeur, les DCV ne sont pas en contact les uns avec les autres. En revanche, si la séparation est approximativement égale à la largeur, les DCV peuvent être en contact. Selon ces critères, les DCV de cette image ont été classés comme n'étant pas en contact, tandis que les DCV de cette autre image ont été classés comme étant en contact, suite à cette procédure.

D'autres méthodes, comme la paume à deux couleurs, peuvent être utilisées pour étudier la localisation relative de structures distinctes.