Name: 分析单个人类胚胎干细胞通过定量RT-PCR (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解如何使用定量RT-PCR技术对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析。该方法利用荧光激活细胞分选和单细胞裂解技术，揭示干细胞群体中的基因表达异质性。

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我们感谢李实验室成员对本文手稿提出的宝贵讨论。李实验室的工作得到了纽约干细胞基金会罗伯特森研究员奖和马里兰干细胞研究基金（TEDCO）资助项目的支持。

1. 96 孔板的制备
<ol>
	<li>将1 μl单细胞DNase1与9 μl单细胞裂解液混合。</li>
	<li>将10 μl混合液加入96孔PCR板的每个孔中。</li>
</ol>
2. 脱落 hESC 以进行 FACS 纯化
<ol>
	<li>用 1 ml Accutase 在 37 °C 下处理 60 mm 培养皿中的 OCT4::EGFP ES 细胞系 20 分钟，使其脱离，随后用人胚胎干细胞培养基中和。</li>
	<li>将细胞悬液加入 1 ml FACS 缓冲液中，调整细胞浓度至 1 × 106 个细胞/ml。</li>
	<li>用 35 μm 滤膜帽管过滤细胞样品。</li>
	<li>细胞分选前将样品管置于冰上保存。</li>
</ol>
3. 裂解96孔板中每个孔内经FACS纯化的单个细胞
<ol>
	<li>使用经过培训的操作员在细胞分选仪上对样本进行EGFP阳性细胞的分选。将单个细胞放入96孔PCR板中的单细胞裂解/DNase1溶液中。如有必要，含有样本的96孔板可在-80 °C超低温冰箱中保存不超过一个月。</li>
	<li>室温孵育5分钟，使细胞裂解。</li>
	<li>加入1 μl终止液以终止裂解反应。</li>
	<li>室温孵育2分钟。</li>
</ol>
4. 逆转录
<ol>
	<li>向每个样品中加入 0.5 μl 的 20 μM SMA-T15、SMA-A。</li>
	<li>向每个孔中加入 4 μl 5X 缓冲液、2 μl DTT、1 μl 逆转录酶和 1 μl dNTP。</li>
	<li>在热循环仪中进行逆转录反应。
	<ol>
		<li>将热循环程序设置为 42 °C × 90 分钟，然后在 85 °C × 5 分钟条件下使逆转录酶失活。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 扩增
<ol>
	<li>向每个反转录样品中加入 4 μl ExoSAP-IT 试剂。
	<ol>
		<li>将样品在 37 °C 下孵育 15 分钟，然后在 80 °C 下孵育 15 分钟，以灭活 ExoSAP-IT 试剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 SMA-p2（2 nM）配制 PCR 反应混合液</li>
	<li>向每个反转录样品中加入 10 μl PCR 反应混合液。</li>
	<li>进行扩增反应，包括 20 个循环的变性（94 °C 持续 30 秒）、退火（57 °C 持续 30 秒）和延伸（68 °C 持续 10 分钟）。</li>
</ol>
6. qRT-PCR 实验操作
<ol>
	<li>向每个孔中加入 10 μl 的 2X SYBR Green PCR 主混合液、1 μl 扩增的 cDNA、2 nM 引物以及 7 μl 水。
	<ol>
		<li>设置程序：95 °C 3 秒，60 °C 30 秒，循环 40 次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为避免技术误差，每个样本设置两个重复。</li>
</ol>

<ol><li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li>
<li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li>
<li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li>
<li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li>
<li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li>
<li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+template+switching%3A+A+SMART+%28TM%29+approach+for+full-length+cDNA+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li>
<li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li>
<li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

单细胞基因表达谱分析可能成为预测单个细胞或整个细胞群体功能的重要工具。由于技术限制，全基因表达谱分析一直局限于群体平均水平。个体细胞之间以及亚群之间的基因表达模式和水平的差异可能导致错误的解释。这种细胞异质性在人胚胎干细胞（hESCs）中尤为明显，其异质性导致维持多能性及命运决定过程的能力存在细微差异。
我们开发并验证了单细胞定量RT-PCR方法，该方法为单个细胞中基因表达的研究提供了一种简单但稳健的技术。为验证本方案，我们将经FACS纯化的单细胞裂解液均分为两份，并应用该方法检测其准确性。单细胞实验结果与系列稀释的总RNA样本结果一致，且每份细胞裂解液的两部分之间也显示出一致的结果（图4）。然而，本方案仍存在一些局限性。我们能够检测超过40个基因的表达水平，但某些特定的转录信息（例如 非多聚腺苷酸化mRNA、miRNA、未知转录本等）可能无法检测。此外，针对目标基因的引物仍有优化空间。通常接受的引物长度为18-22个碱基对，引物的退火温度一般在50-60 °C范围内。引物的GC含量可能影响其退火能力。本文中，我们在qPCR中省略...

大多数高等真核生物群体具有异质性，因此在分析混合群体时，常常难以准确解读其细胞特征。群体内的单个细胞可能存在细微差异，而这些差异可能对整个群体的性质和功能产生重要影响1,2。特别是人类胚胎干细胞（hESCs）已知具有异质性，这导致其在多能性水平以及向不同谱系分化的潜能方面表现出精细而多样的差异3,4。例如，不同的细胞表面抗原可用于对未分化的多能干细胞进行分类5，而Austin Smith研究组则根据形态、分化倾向以及信号通路依赖性，提出了小鼠胚胎干细胞中存在不同层次的多能性状态6。这一现象也被推测存在于人类胚胎干细胞中7。然而，迄今为止的大多数研究是在不同的干细胞系之间进行的，而非针对单个细胞；因此，在单细胞水平上分析多能性的不同层次，可能对理解其向所有体细胞谱系分化的潜能具有重要意义。
细胞和分子异质性可通过转录谱分析来确定，这一方法被称为“单细胞转录组”，强调了定量基因表达水平的新策略8-10。为了在单个细胞中分析基因表达水平，我们开发了一种简单但稳健的单细胞定量RT-PCR方案。通过比较单个细胞裂解液的两半部分以及人胚胎干细胞（hESCs）总RNA的连续稀释样本，验证了该方案的有效性和可行性，结果显示技术变异和差异极小。此外，我们利用基因报告细胞系，通过基因靶向系统分离出高度均一的hESCs群体。&#160;靶向OCT4位点的供体质粒（OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro构建体）和一对TALEN质粒被使用11。通过我们的核转染、克隆筛选方案将供体质粒和一对TALEN质粒导入hESCs（H9，WA09），并依据常规方案进行hESCs的培养与维持12。我们证实该基因报告细胞系在OCT4::EGFP hESCs中可表达EGFP以反映OCT4的表达情况。
我们的结果表明，单个hESC（通过OCT4::EGFP强阳性细胞分选获得）具有高水平的OCT4表达，但NANOG表达水平各不相同。因此，我们的单细胞基因表达检测方法可用于研究多能干细胞群体的异质性。

<table><tbody><tr><td>96孔PCR板</td><td>USA scientific</td><td>1402-8900</td><td></td></tr><tr><td>Ambion细胞裂解试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>4458235</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe逆转录酶</td><td>Clonetech</td><td>639536</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>USB</td><td>78200</td><td></td></tr><tr><td>Platinum高保真DNA聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>11304</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP混合液，PCR级</td><td>Invitrogen</td><td>18427</td><td></td></tr><tr><td>SYBR通用2X预混液</td><td>Kapa biosystem</td><td>KR0389</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>S-1100-1</td><td></td></tr><tr><td>FACS缓冲液</td><td></td><td></td><td>45 ml PBS，5 ml a-MEM，100 &amp;mu;l DNase，过滤除菌</td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m细胞滤网带盖离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

通过定量rt-pcr对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

干细胞群体的异质性阻碍了对干细胞生物学特性的深入理解，例如其向不同谱系分化的倾向。单细胞转录组分析可为解析个体差异提供一种新方法。我们已开发出单细胞qRT-PCR技术，并证实该方法在多个基因表达谱中均具有良好效果。在单细胞水平上，通过OCT4::EGFP阳性细胞分选得到的每个人类胚胎干细胞均表现出高水平的OCT4表达，但NANOG的表达水平各不相同。我们的单细胞基因表达检测技术应有助于深入探究群体异质性。

高效且稳健的单细胞RNA扩增
为了最大限度减少人胚胎干细胞（hESCs）间的转录差异，我们采用 OCT4::EGFP 人胚胎干细胞克隆进行荧光激活细胞分选（FACS）纯化。将 OCT4::EGFP 阳性细胞分选至96孔板后，每个细胞在裂解缓冲液中裂解，并利用SMA-T15（GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT）引物和SMA-A（ACATGTATCCGGATGTGGG）锚定，通过SMART模板转换技术将poly(A)+ RNA逆转录为全长cDNA。过量的寡核苷酸使用ExoSAP-IT试剂消化，随后对cDNA进行18–20个循环的PCR扩增，所用引物为SMA-p2（GACATGTATCCGGATGT）13。我们将扩增得到的cDNA作为模板用于qRT-PCR分析（图1）。已有若干研究利用少量细胞或单细胞进行全长RNA测序及RNA变异性的测定3,14,15<...

单细胞基因表达检测对于理解干细胞异质性至关重要。

通过定量RT-PCR对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

干细胞群体的异质性阻碍了对干细胞生物学的深入理解，例如其向不同谱系分化的倾向性……

本实验的总体目标是利用单细胞定量反转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）对单个人类胚胎干细胞的基因表达水平进行分析。该目标首先通过荧光激活细胞分选技术，将单个细胞分选至含有细胞裂解缓冲液的96孔板的各个孔中来实现。第二步是将RNA反转录，以从单细胞裂解物中生成cDNA。接下来，通过聚合酶链式反应对cDNA进行扩增。最后一步是对扩增后的cDNA进行定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）。该检测方法最终可用于研究人类胚胎干细胞等异质性细胞群体中的基因表达。与现有的单细胞定量人工血管技术相比，该方法的主要优势在于其结合了脑电图（EEG）技术，并且在 Fax 纯化之前具有更高的稳健性。将 OCT4-EGFP 人胚胎干细胞或 Hess 从 60 毫米培养皿上分离，移除所有培养基，加入 1 毫升 Accutase，于 37°C 孵育 20 分钟。弃去上清后，加入1毫升人ES培养基，通过离心收集细胞，用FACS缓冲液重悬细胞，并将细胞浓度调整至每毫升1×10⁶个细胞。接着，将细胞样品通过35微米带滤网帽的细胞筛。细胞分选前将样品管置于冰上保存。开始本实验前，需配制主混合液，其中包含1 µL单细胞DNA酶1和9 µL单细胞裂解液。针对每个样本，将10 µL该混合液转移至96孔PCR板的每个孔中，用于后续的fax分析程序。随后，使用细胞分选仪将EGFP阳性单细胞分选至96孔PCR板的各孔中。细胞分选完成后，在室温下孵育5分钟以实现细胞裂解。为终止裂解反应，向每孔加入1 µL终止液，并在室温下继续孵育2分钟。开始此实验步骤时，首先向96孔板的每个孔中加入0.5微升浓度为20微摩尔的SMAT 15和SMAA引物Eloqua。将样品在80摄氏度下加热5分钟。然后加入4微升5倍缓冲液、2微升DTT、1微升逆转录酶以及1微升dNTPs。在每个孔中使用热循环仪进行逆转录反应。将热循环程序设置为42摄氏度反应90分钟，随后85摄氏度反应5分钟。逆转录完成后，为灭活逆转录酶，向每个cDNA样品中加入4 µL exo试剂，在37摄氏度孵育15分钟以消化过量的寡核苷酸引物，随后在80摄氏度反应15分钟。为了灭活外切酶试剂，使用2纳米浓度的SMAP2引物制备PCR反应体系。向每份逆转录样品中加入10微升PCR反应混合液。进行扩增反应，包括20个循环的变性、退火和延伸。在完成样品扩增后，在两个独立的96孔板中分别进行两组定量R-T-P-C-R反应，以确认R-T-P-C-R结果。向每个96孔板的每孔中加入10微升（µL）2×SYBR Green PCR预混液、1微升扩增后的cDNA、两种引物以及7微升水。将程序设定为95°C持续3秒，随后60°C持续30秒。经过40个循环，去除了一步退火步骤以减少引物误差。在本研究中，将Hess的总RNA微克量稀释至纳克和皮克水平，以评估低浓度总RNA下技术重复

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