Name: Lutilisation de la chromatographie en phase gazeuse pour lanalyse compositionnelle modifications des acides gras dans les tissus de foie de rat pendant la grossesse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Découvrez l'analyse de la composition en acides gras du foie par chromatographie en phase gazeuse chez le rat. Cette méthode permet d'étudier les modifications lipidiques induites par la grossesse et l'apport alimentaire.

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Les auteurs tiennent à souligner la contribution de Meritxell Romeu-Nadal à l&#39;étude chez le rat.

Une. Procédures animales <ol><li> Tous les travaux des animaux doit être effectué en conformité avec les bureaux à domicile des animaux (Scientific Procedures) Act (1986). </li><li> Compagnon de rats Wistar âgés de 10 semaines par reproduction monogame, et confirmer la grossesse par l&#39;apparition d&#39;un bouchon vaginal. Enregistrer ce que le jour 1 de la gestation, et commencer régime expérimental. Pour les femelles vierges, accueillir chaque rat individuel, et commencer régime expérimental. </li><li> Après avoir nourri les régimes expérimentaux pendant 20 jours euthanasier les rats par asphyxie au CO2, suivie par dislocation cervicale. </li><li> Utilisez une pince de dissection et ciseaux pour exposer la cavité abdominale et exciser le foie en coupant les ligaments qui relient le foie au diaphragme, paroi antérieure de l&#39;abdomen, l&#39;estomac et le duodénum. Lavez le foie dans du PBS et congeler dans l&#39;azote liquide avant de le ranger à -80 ° C. </li></ol> 2. Préparation d&#39;un lipide extrait total 9 <ol><li> Ajouter Molecultamis ar (à remplir 1/10 de récipient de solvant) à tous les solvants pour créer solvants «sèches». Effectuer tous les travaux solvant dans une hotte. </li><li> Couper environ 100 mg foie congelé et peser. Placez le tissu dans un tube dans un seau à glace et ajouter 0,8 ml de glace froide NaCl à 0,9%. Homogénéiser le tissu. </li><li> Ajouter étalons internes dissous dans 1 ml / mg de chloroforme anhydre et de methanol (2:1, v / v) contenant de l&#39;hydroxytoluène butylé (BHT, 50 mg / l) comme anti-oxydant. Pour 100 mg de foie de rat ajouter 100 ug de la norme CE (Cholesteryl heptadécanoate 17:00) Attention:. Chloroforme et le BHT sont dangereux. </li><li> Ajouter 5,0 ml de chloroforme sec: méthanol (2:1, v / v) contenant du BHT (50 mg / L). </li><li> Ajouter 1,0 ml de NaCl 1 M, bien mélanger au vortex jusqu&#39;à ce que le mélange ressemble uniforme. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine. </li><li> Centrifuger à 1000 g pendant 10 min, bas frein à la température ambiante. </li><li> Recueillir inférieurephase en utilisant une pipette Pasteur en verre, transférer dans un nouveau tube en verre avec bouchon à vis et sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine. </li></ol> 3. La séparation des classes de lipides par extraction en phase solide (SPE) 10 <ol><li> Connecter le réservoir SPE à une pompe à vide et placer aminopropyl cartouche de silice SPE sur le réservoir. </li><li> Placer le nouveau tube de verre à bouchon à vis TAG marqué CE et dans le rack de réservoir dans la colonne de recueillir première fraction. </li><li> Dissoudre l&#39;extrait total de lipides dans 1,0 ml de chloroforme sec et vortex. </li><li> Appliquer l&#39;échantillon à la colonne à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en verre et laisser couler à travers dans le tube à bouchon à vis par gravité. Si d&#39;autres gouttes tombent, retirer le liquide restant sous vide. </li><li> Éluer la fraction de TAG et CE sous vide, laver la colonne avec 2 x 1,0 ml lavages de chloroforme sec. </li><li> Lorsque tout le liquide est retiré, sécher le TAG et CE fractionnementn sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine. </li><li> Placer le nouveau bouchon à vis tube de verre PC marqué dans le bac du réservoir sous la colonne. </li><li> Éluer la fraction de PC sous vide avec addition de 2 x 1,0 ml de chloroforme sec: methanol (60:40, v / v) jusqu&#39;à ce que tout le liquide est enlevé de la colonne. </li><li> Retirez et fraction de PC sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine. </li><li> Placez un nouveau bouchon à vis tube de verre PE marqué dans le bac de réservoir et éluer la fraction de PE avec l&#39;addition de 1,0 ml de méthanol sec sous vide. </li><li> Retirez et fraction de PE sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine. </li><li> Placer le nouveau tube de verre à bouchon vissé marqué AGNE dans le bac de réservoir et éluer la fraction AGNE sous vide par l&#39;addition de 2 x 1,0 ml lavages de chloroforme sec: méthanol: acide acétique glacial. (100:2:2, v / v / v) Attention: L&#39;acide acétique glacial est dangereux. </li><li> Retirer fraction recueillie AGNE et sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine. </li><li> Placez une nouvelle cartouche SPE de silice aminopropylé sur le réservoir de SPE et placer un tube de verre à bouchon vissé dans le bac du réservoir sous la cartouche de collecte des déchets. </li><li> Laver la colonne avec 3 lavages d&#39;hexane sec sous vide, puis un lavage de 1,0 ml finale par gravité. Ne laissez pas la cartouche à devenir sec (tourner les chaînes de la colonne de la cartouche à une position fermée lorsque le niveau de l&#39;hexane est proche de la matrice de la cartouche). Attention: L&#39;hexane est dangereux. </li><li> Remplacer le tube de déchets avec le tube de verre nouvelle vis-bouchon de marquage CE. </li><li> Dissoudre le TAG et CE fraction séchée (préparé à l&#39;étape 3.6) dans 1,0 ml d&#39;hexane sec et vortex. Appliquer à la colonne en utilisant une pipette Pasteur en verre et laisser s&#39;égoutter à travers sous gravity. </li><li> Si d&#39;autres gouttes tombent, retirer le liquide restant sous vide. </li><li> Sous vide, laver la colonne avec 2 x 1,0 ml d&#39;hexane sec lavages pour éluer CE et fraction recueillie sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine. </li><li> Placer le nouveau tube de verre à bouchon à vis TAG marqué dans le bac de réservoir et élution TAG avec l&#39;ajout de 2 x 1,0 ml d&#39;hexane sec lavages: méthanol: acétate d&#39;éthyle (100:5:5) sous vide. </li><li> Fraction recueillie à sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C à ce stade pour une semaine. Attention: l&#39;acétate d&#39;éthyle est dangereux. </li></ol> 4. Préparation de FAME de CE 10 <ol><li> Ajouter 0,5 ml de toluène sec à la fraction de la CE séparé (recueillies à l&#39;étape 3.19) et vortex. Attention: Le toluène est dangereux. </li><li> Préparer le réactif de méthylation (méthanol sec avec 2% (v/ V) de H 2 SO 4), dont 1,0 ml est requis par échantillon. Distribuer le volume de méthanol sec en verre ou en matière plastique adéquate avec couvercle et ajouter la quantité requise de H 2 SO 4, goutte à goutte, puis mélanger par inversion. Attention: L&#39;acide sulfurique est dangereux. </li><li> Ajouter 1,0 ml de réactif de méthylation pour les échantillons dissous dans du toluène sec, boucher les tubes en toute sécurité, et mélanger doucement. </li><li> Chauffer les échantillons pendant 2 heures à 50 ° C. </li><li> Après 2 h retirer les tubes de la chaleur. Une fois ajouter fraîche 1,0 ml de solution (0,25 M KHCO3 0.5MK 2 CO 3) Attention neutralisants:. Bicarbonate de potassium et de carbonate de potassium sont dangereux. </li><li> Ajouter 1,0 ml d&#39;hexane sec et vortex. </li><li> Centrifuger à 250 g pendant 2 min, faible frein à la température ambiante. </li><li> Recueillir la phase supérieure, qui contient le FAME, et transférer dans un nouveau bouchon à vis tube non de verre jetable. </li><li> Sécher le FAME recueillis en vertu del&#39;azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine. </li></ol> 5. Retrait du cholestérol libre contamination de FAME CE 14 (Sans cholestérol peut contaminer l&#39;échantillon; voir la figure 1 pour les traces exemple de chromatographie avec et sans enlèvement de cholestérol). <ol><li> Placer un tube de déchets dans le réservoir de SPE et de placer une cartouche SPE de gel de silice sur le réservoir. </li><li> Laver la colonne avec 3 x 1 ml d&#39;hexane sec lavages sous vide et 1 x 1 ml par gravité. </li><li> Retirer lavages de déchets et ajouter nouveau tube de déchets dans le réservoir. </li><li> Dissoudre FAME CE dans 1 ml d&#39;hexane sec, vortex. </li><li> Appliquer à la colonne en utilisant une pipette Pasteur en verre et laisser s&#39;égoutter par gravité à travers. </li><li> Laver la colonne avec 3 x 1 ml d&#39;hexane lavages sous vide. </li><li> Retirer lavages de déchets et placez nouveau tube non bouchon à vis en réservoir de l&#39;étiquette FAME CE. </li><li> Éluer l&#39;FAME CE avec 2 x 1 ml d&#39;hexane sec: l&#39;éther éthylique (95:5 v / v) lavages. </li><li> Sécher sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C à ce stade pour une semaine. Attention: l&#39;éther de diéthyle est dangereux. </li></ol> 6. Transfert de FAME en GC Auto Sampler Vial <ol><li> Ajouter 75 ul hexane sec à déguster, vortex, et de les transférer à un GC échantillon automatique flacon. </li><li> Ajouter un autre 75 pi hexane sec à déguster, vortex et transférer à la même GC échantillon automatique flacon. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant un mois. </li></ol> 7. Analyse utilisant la chromatographie en phase gazeuse 14 <ol><li> Analyser FAME sur un chromatographe en phase gazeuse. Exemple mis en place: 30 mx 0,25 um x 0,25 mm BPX-70 fusionné colonne capillaire de silice avec un protocole de température: Température initiale de 115 ° C, maintenez 2 min, rampe de 10 ° C / min à 200 ° C, maintenez 18,5 min, rampe de 60 ° C / min à 245 ° C, hde 4 min. Colonne: hélium gaz, le taux de 1,0 débit, la pression et la vitesse de 14,6 29. Injecteur: Température = 300 ° C. Détecteur: flux d&#39;hydrogène 40.0, flux d&#39;air 184,0, maquillage hélium de gaz, débit 45,0, température = 300 ° C. </li><li> Réglez rapport de division, le cas échéant (par exemple 25:1 pour l&#39;analyse des FAME CE). </li><li> Déterminer l&#39;aire de chaque pic en utilisant un logiciel approprié et d&#39;identifier les points de gloire en comparaison avec les normes. Voir la figure 2 par exemple des chromatogrammes. </li><li> Utiliser l&#39;aire sous les pics de données pour calculer la contribution des acides gras individuels en tant que pourcentage des acides gras totaux. </li><li> Calculer les concentrations absolues des acides gras en divisant la surface de référence interne par la quantité ajoutée. Diviser la superficie de chaque acide gras par ce résultat pour obtenir des concentrations absolues de chaque acide gras à l&#39;intérieur de la quantité de tissu utilisé. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Chromatographie en phase gazeuse est une technique exacte à utiliser pour l&#39;analyse d&#39;acide gras, et sa reproductibilité élevée juge cette technique convient pour les analyses cliniques. Colonnes de CPG appropriées doivent être utilisées pour permettre l&#39;identification d&#39;acides gras d&#39;intérêt, avec des colonnes disponibles présentant des variations de la polarité de la phase stationnaire, la longueur de la colonne et le diamètre intérieur. L&#39;utilisation d&#39;une colonne capillaire en silice fond...

chromatographie en phase gazeuse (GC) est une technique bien établie utilisée pour identifier et quantifier l&#39;incorporation des acides gras dans les piscines de lipides et les membranes cellulaires 1,2 dans des conditions de supplémentation ou physiologiques tels que l&#39;obésité (et maladies apparentées telles que le diabète) ou la grossesse 3 - 5. Il est également adapté pour analyser les types et les quantités de matières grasses dans les aliments. Ceci est utile lors de la caractérisation des régimes expérimentaux, ainsi que veiller à ce que l&#39;industrie alimentaire conforme à la réglementation. Par exemple, GC peut être utilisée pour confirmer l&#39;identité et la quantité des acides gras dans un produit comme un complément alimentaire pour garantir que le marquage est correct et réglementations sont respectées à 6,7. Analyse des acides gras peut fournir des indications précieuses sur le métabolisme des lipides dans la santé et la maladie, l&#39;impact de la modification du régime alimentaire, et l&#39;effet des changements dans l&#39;état physiologique 8. L&#39;utilisation de GC à étudier des échantillons durant la grossesse a fourni importantedes informations sur les changements dans l&#39;acide gras et l&#39;homéostasie lipidique complexe 3. Avant la séparation chromatographique, les lipides sont généralement extraits de l&#39;échantillon en utilisant la solubilité des lipides dans des mélanges de solvants de chloroforme et de méthanol. Le chlorure de sodium est ajouté pour faciliter la séparation du mélange en lipides aqueuse et organique contenant 9,10 phases. Classes de lipides complexes d&#39;intérêt peuvent être séparées de l&#39;extrait lipidique total d&#39;une extraction en phase solide (SPE). Cette technique de séparation élue classes de lipides en fonction de leur polarité ou affinité de liaison. Triacylglycérols (TAG) et des esters de cholestérol (CE) sont éluées en premier en tant que fraction combinée, d&#39;autres catégories, la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), et les acides gras non estérifiés (AGNE) sont éluées en augmentant la polarité du solvant d&#39;élution . La séparation des TAG de CE exploite la liaison de TAG seulement à une SPE cartri fraisdge, permettant CE pour être élue. TAG peut ensuite être éluée en augmentant la polarité du solvant d&#39;élution 9,10. Cette méthode permet à plusieurs échantillons à séparer simultanément avec un rendement plus élevé que ce qui est réalisé par chromatographie sur couche mince, ce qui signifie que la taille des échantillons relativement petits (par exemple &lt;100 ul de plasma ou de sérum, &lt;100 mg de tissus) peuvent être analysées 11,12. GC est une technique bien établie décrite dans la première des années 1950, il a été suggéré que la phase mobile dans les systèmes ensuite liquide-liquide peut être remplacé par de la vapeur. Il a d&#39;abord été utilisée pour l&#39;analyse de pétrole mais s&#39;est rapidement développée dans d&#39;autres domaines tels que l&#39;analyse des acides aminés et la biochimie des lipides, qui est toujours d&#39;un grand intérêt. Les progrès de l&#39;équipement et de la technologie GC tels que le développement de colonnes capillaires des colonnes garnies utilisés précédemment a conduit à nos techniques actuelles dans laquelle les acides gras sont en mesure d&#39;êtreséparés de manière plus efficace à des températures inférieures résultant en GC est couramment utilisé pour identifier et quantifier les acides gras dans un large éventail d&#39;enquêtes 13. GC nécessite des acides gras pour être dérivé afin qu&#39;ils puissent devenir suffisamment volatil pour être élue à des températures raisonnables sans décomposition thermique. Cela implique généralement la substitution d&#39;un groupe fonctionnel contenant de l&#39;hydrogène pour former des esters, des thioesters ou amides d&#39;analyse. Les esters méthyliques sont couramment étudiés dérivés, qui sont produites par méthylation. Dans ce procédé, les liaisons ester dans les lipides complexes sont hydrolysés pour libérer les acides gras libres, qui sont transmethylated pour former des esters gras méthyliques d&#39;acide (EMAG). Le profil résultant de FAME, déterminé par CPG, est désigné comme la composition en acides gras et peut être aisément comparé entre les différents groupes expérimentaux 9,10. La technique permet à la fois les proportions des indiLes acides gras UAL et leurs concentrations à mesurer. En plus de l&#39;utilisation de CG pour la détermination des acides gras dans les études de nutrition et de l&#39;industrie alimentaire, la technique peut être utilisée dans une large gamme de domaines d&#39;analyse. Par exemple, les analyses environnementales par GC comprennent la mesure de la contamination des eaux par les insecticides et les analyses de sol mesurer la teneur en chlorobenzène. En toxicologie, GC a également été utilisé pour identifier les substances illicites dans l&#39;urine et des échantillons de sang de personnes; une telle performance sportive amplificateurs 12 et la capacité à séparer des mélanges complexes d&#39;hydrocarbures rend cette technique populaire dans l&#39;industrie pétrolière pour l&#39;analyse de la pétrochimie 12. La grossesse est associée à des modifications importantes à la composition en acides gras des tissus maternels, en particulier dans la teneur en acides gras oméga-3 (n-3) et les acides gras oméga-6 (n-6) aci gras polyinsaturéds (AGPI) 3. Dans la présente étude, nous illustrons l&#39;utilisation de GC dans la mesure des acides gras en décrivant leur utilisation dans l&#39;analyse de la composition en acides gras des tissus du foie prélevé sur des rats vierges et enceintes recevant une ration faible et élevée de graisse avec différentes sources de pétrole. Les rations expérimentales fournies ici sont une base d&#39;huile bas régime de soja gras, un régime riche en graisses de soja à base d&#39;huile (130,9 g Lipides totaux / kg de matière grasse totale) ou un régime à base d&#39;huile de lin riche en graisses (130,9 g Lipides totaux / kg régime), prévue à 20 jours. La composition de ces régimes acide gras complet nutritif et ont été décrites précédemment 14. Les régimes alimentaires d&#39;huile de soja sont riches en acide linoléique (18:2 n-6) et contiennent un peu d&#39;acide α-linolénique (18:3 n-3) tandis que l&#39;alimentation de l&#39;huile de lin est riche en acide α-linolénique. Ces régimes riches en gras représentent les différentes rations de linoléiques à α-linolénique (rations de 08h01 et 01h01, respectivement). La méthode d&#39;isolement des classes de lipides individuels et l&#39;analyse par GC est nousll établi et validé, et a été publié antérieurement 10 mais sans la description technique détaillée trouvé ici.

<table><tbody><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17</td>' <td>Fumées 'ATTENTION' - Chlorforme de qualité HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>C/4966/17Fumées</td> <td>'ATTENTION' - Grade HPLC BHT</td></tr><tr><td></td><td>Sigma- Aldrich</td> <td>W218405'ATTENTION' Fumées de poussière - Anhydre</td><td></td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S9888</td><td>Hexane anhydre</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>H/0406/17</td>' <td>Fumées -</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td> de qualité HPLC <td>Sigma- Aldrich</td><td>695084'ATTENTION</td><td>' Brûlures - 99,85 %</td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>339741'ATTENTION</td><td>' Brûlures - 99.999 %Carbonate de</td></tr> <tr><td>potassium</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>209619</td><td>99 % ACS Bicarbonate</td></tr> de <tr><td>potassium</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>237205</td><td>99,7 % ACS</td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle</td> de qualité réasgente <td>Fisher Scientific</td><td>10204340</td>' <td>Fumées - 99+ % GLC Spécifié</td></tr><tr><td>Toluène</td><td>Fisher Scientific</td><td>T/2300/15</td><td>' Fumées</td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>309966'ATTENTION</td><td>' Fumées Bouteille d’azote</td></tr><tr><td>(sans oxygène)</td><td>BOC</td><td>44-w</td><td>'ATTENTION' Gaz comprimé - risque d’explosion</td></tr><tr><td>Cartouches SPE de silice aminopropylique</td><td>Agilent</td><td>12102014</td><td>Cartouche - Masse de billes 100 mg</td></tr><tr><td>Gel de silice Cartouches SPE</td><td>Agilent</td><td>14102010</td><td>Cartouche - Masse de billes 100 mg</td></tr><tr><td>Saisies moléculaires</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>334324</td><td>Pellets, AW-300, 1,6 mm</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50251</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de la chromatographie en phase gazeuse pour l&#39;analyse compositionnelle modifications des acides gras dans les tissus de foie de rat pendant la grossesse

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

chromatographie en phase gazeuse (GC) est une méthode très sensible utilisée pour identifier et quantifier la teneur en acides gras des lipides des tissus, de cellules et de plasma / sérum, donnant des résultats avec une grande précision et une reproductibilité élevée. Dans les études métaboliques et nutrition GC permet l&#39;évaluation des changements dans les concentrations d&#39;acides gras suivants interventions ou lors des changements de l&#39;état physiologique comme la grossesse. Extraction en phase solide (SPE) à l&#39;aide aminopropyliques cartouches de silice permet la séparation des principales classes de lipides, y compris les triglycérides, différents phospholipides et esters de cholestérol (CE). GC combinés avec SPE a été utilisé pour analyser les variations de la composition en acides gras de la fraction CE dans le foie des rats gravides vierges et qui avaient été nourris avec des régimes différents de haute et basse en matières grasses. Il ya des effets d&#39;interaction alimentation / grossesse importantes sur la teneur en acides gras oméga-3 et oméga-6 gras de foie CE, indiquant que les femmes enceintes ont une réponse différente à manipula alimentaireion de s&#39;observe chez les femelles vierges.

Le succès de ce procédé dépend de la suite du protocole de précision et de nettoyage utilisant des solvants et des réactifs de façon à réduire le «bruit» et la contamination qui peut apparaître sur un chromatogramme. Les échantillons contaminés sont plus difficiles à analyser, ce qui réduit la précision de l&#39;aire sous la courbe de calculs. Si le protocole est suivi avec succès un chromatogramme avec des pics symétriques, claires et bien définies, avec un bruit de fond minimal doit être obtenue, comme illustré sur <s...

Grossesse conduit à d&#39;importants changements à la composition en acides gras des tissus maternels. profils lipidiques peuvent être obtenus par chromatographie en phase gazeuse pour permettre l&#39;identification et la quantification des acides gras dans les classes de lipides individuels entre les rats nourris avec des régimes différents de graisse haute et basse pendant la grossesse.

L&#39;utilisation de la chromatographie en phase gazeuse pour l&#39;analyse compositionnelle modifications des acides gras dans les tissus de foie de rat pendant la grossesse

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

L'objectif général de cette procédure est d'analyser la composition en acides gras du foie. Cela est réalisé en pesant d'abord un échantillon de foie et en l'homogénéisant. La deuxième étape consiste à extraire tous les lipides de l'échantillon de foie homogénéisé.Ensuite, les différentes classes de lipides, telles que les esters de cholestérol, sont séparées à l’aide d’une extraction en phase solide. La dernière étape consiste en l’identification et la dérivation des classes de lipides en esters méthyliques d’acides gras. Enfin, la chromatographie en phase gazeuse est utilisée pour montrer comment la composition en acides gras des tissus peut évoluer suite à une intervention nutritionnelle ou être influencée par des changements de l’état physiologique, comme la grossesse.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la composition en acides gras des tissus, elle peut également être appliquée à d'autres types d'échantillons tels que les huiles, les graines et les aliments. En général, les utilisateurs novices de cette technique peuvent éprouver des difficultés, car certaines parties du protocole exigent une dextérité manuelle et nécessitent de la pratique, comme la collecte répétée des phases supérieure et inférieure. La procédure sera démontrée par Hena, Fisk et Annette West, une technicienne et une étudiante au doctorat de notre laboratoire.Prélevez d'abord environ 100 milligrammes de foie congelé et pesez le tissu. Placez le tissu dans un tube en plastique placé dans un seau à glace et ajoutez 0,5 millilitre de chlorure de sodium à 0,9 % glacé. Homogénéisez ensuite le tissu et transférez-le dans un tube en verre à vis. Utilisez encore 0,3 millilitre de chlorure de sodium à 0,9 % pour transférer les tissus restants dans le tube en verre à vis. Ensuite, ajoutez 100 microgrammes d'étalon de cholestérol hétadécène dissous dans un mélange sec de chloroforme et de méthanol en rapport de deux pour un, puis ajoutez cinq millilitres supplémentaires de la même solution solvant contenant 50 milligrammes par litre de butylhydroxytoluène. Après avoir ajouté un millilitre de chlorure de sodium un molaire, fermez le tube et mélangez soigneusement l'échantillon par vortexage jusqu'à obtention d'un aspect homogène.Ensuite, centrifuger l'échantillon à 1000 ×g pendant 10 minutes avec une décélération faible à température ambiante. Une fois terminé, recueillir la phase inférieure à l'aide d'une pipette en verre Pasteur et la transférer dans un nouveau tube en verre à bouchon vissé. Puis sécher l'échantillon sous azote à 40 degrés Celsius.À ce stade, connectez le réservoir SPE à une pompe à vide et placez une cartouche SPE en silice aminopropyle sur le réservoir. Placez un nouveau tube en verre à visser étiqueté TAG et CCE dans le support du réservoir, sous la colonne, afin de recueillir la première fraction. Dissolvez l'extrait lipidique total dans un millilitre de chloroforme anhydre et mélangez l'échantillon par vortexage.Ensuite, transférez l'échantillon sur la colonne à l’aide d’une pipette en verre et laissez le liquide s’écouler par gravité dans l’ampoule à vis. Lorsque le liquide cesse de goutter depuis la colonne, éliminez le liquide résiduel sous vide. Puis, éluerez la fraction TAG et CE en lavant la colonne deux fois avec un millilitre de chloroforme anhydre sous vide.Lorsque tout le liquide a été élué de la colonne, séchez la fraction TAG et CE sous azote à 40 degrés Celsius. Placez une nouvelle cartouche SPE en silice aminopropyle sur le réservoir SPE et positionnez un tube en verre à bouchon vissé dans le plateau du réservoir sous la cartouche pour recueillir les déchets. Lavez la colonne avec un millilitre d'hexane anhydre, trois fois sous vide.Après avoir éteint le vide, lavez la colonne avec un millilitre final d’hexane H par gravité. Après avoir remplacé le tube de rebut par un nouveau tube en verre à visser étiqueté ce, dissolvez la fraction de TAG et de CE séchée dans un millilitre d’hexane anhydre et mélangez l’échantillon par vortexage. Transférez ensuite l’échantillon sur la colonne à l’aide d’un verre passant ou d’une pipette, et laissez le liquide s’écouler à travers la colonne par gravité.Lorsque le liquide ne coule plus de la colonne, éliminer le liquide résiduel sous vide. Laver la colonne deux fois avec un millilitre d'hexane anhydre pour éluer les CE et sécher la fraction recueillie sous courant d'azote à 40 degrés Celsius. Ensuite, ajouter 0,5 millilitre de toluène anhydre à la fraction CE séparée et mélanger l'échantillon par vortexage.Ajoutez un millilitre d'un réactif de méthylation préparé au préalable au prélèvement dissous dans du toluène anhydre. Ensuite, fermez hermétiquement le tube et mélangez. Chauffez doucement le prélèvement pendant deux heures à 50 degrés Celsius. Une fois les prélèvements refroidis à température ambiante, ajoutez un millilitre de solution neutralisante.Ensuite, ajoutez un volume de hexane sec à l'échantillon. Après agitation au vortex, centrifugez les échantillons à 250 ×g pendant deux minutes avec freinage doux à température ambiante. Une fois terminé, récupérez la phase supérieure de l'éther et transférez-la dans un nouveau tube en verre jetable sans bouchon à vis. Sèchez l'échantillon d'éther recueilli sous flux d'azote à 40 degrés Celsius.Après avoir placé un tube de déchets dans le réservoir de SPE et une cartouche de gel de silice sur le réservoir, lavez la colonne trois fois avec un millilitre d'hexane sec sous vide et un millilitre d'hexane sec sous gravité. Après élimination des lavages de déchets, ajoutez un nouveau tube de déchets dans le réservoir, puis dissolvez l'échantillon de CE fame dans un millilitre d'hexane sec.Après avoir mélangé l'échantillon par vortexage, transférez-le sur la colonne à l’aide d’une pipette en verre ou d’une pipette automatique. Une fois que le liquide a traversé la colonne par gravité, lavez la colonne trois fois avec un millilitre d’hexane sous vide. Ensuite, éliminez les lavages usagés et placez un nouveau tube à visser étiqueté CE fame dans le réservoir.Éluer la fraction CE fame avec deux millilitres d'hexane anhydre au diéthyl éther (95:5). Ensuite, sécher la fraction recueillie sous azote à 40 degrés Celsius, dissoudre la fraction sèche dans 75 microlitres d'hexane anhydre, et mélanger l'échantillon par vortexage après que l'échantillon ait été mélangé par vortexage. Le transférer dans un flacon d'auto-échantillonnage pour GC après avoir répété l'étape précédente.Analysez l'échantillon sur un chromatographe en phase gazeuse si le protocole est suivi correctement. Un chromatogramme présentant des pics clairs, symétriques et bien définis, avec un bruit de fond minimal, doit être obtenu, comme illustré ici. Si une contamination s'est produite, le chromatogramme affichera des pics supplémentaires et présentera des pics non symétriques ou asymétriques, comme indiqué ici.Une contamination par le cholestérol libre se produira lors de l'analyse de FAME provenant de CE si le cholestérol n'est pas éliminé. L'utilisation d'un mélange étalon préparé permet l'identification des FAME présents dans l'échantillon. Le mélange étalon est analysé avec les mêmes paramètres instrumentaux que les échantillons afin que le chromatogramme puisse être comparé à celui de l'échantillon et que les pics soient identifiés selon leurs temps de rétention, comme illustré ici.Le pic zéro 16 est mis en évidence ici afin d'illustrer la comparaison des temps de rétention provenant du mélange d'étalonnage dans le chromatogramme supérieur avec ceux des acides gras. Sur le tracé échantillon inférieur, la surface des pics d'acides gras est utilisée pour calculer le pourcentage d'acides gras spécifiques par rapport au total, permettant ainsi une étiquetage correct. Une fois les données recueillies, il est utile de les examiner afin d'identifier les valeurs aberrantes, comme illustré ici.Les échantillons aberrants peuvent ensuite faire l'objet d'une analyse approfondie, et l'extraction et/ou l'analyse peuvent être répétées si nécessaire. Comme illustré ici, la teneur en acides gras dans les CE du foie de rat est exprimée en pourcentage du total des acides gras présents dans les CE hépatiques. Ces données décrivent les acides gras des CE hépatiques chez des rats vierges ou gestantes nourries pendant 20 jours avec l'un des trois régimes alimentaires différents.L'analyse statistique à l'aide de deux facteurs Innova révèle des effets significatifs de l'alimentation et de la grossesse sur la proportion de plusieurs acides gras, ainsi que des interactions significatives entre l'alimentation et la grossesse. À titre d'illustration, la teneur en acide onique des CE hépatiques chez les rats gestantes est plus influencée par l'alimentation que chez les femelles vierges. Cette technique permet de traiter 20 échantillons par jour du début à la fin si elle est correctement réalisée.Une fois maîtrisée, la mise en lots des échantillons peut augmenter le débit et doubler la quantité traitée en une semaine. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser la composition en acides gras de classes lipidiques individuelles à l’aide de l’extraction en phase solide et de la chromatographie en phase gazeuse. N’oubliez pas que l’utilisation de solvants peut être extrêmement dangereuse et que des précautions telles que le travail sous hotte et le port d’équipements de protection individuelle adaptés doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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L'utilisation de la chromatographie en phase gazeuse pour l'analyse compositionnelle modifications des acides gras dans les tissus de foie de rat pendant la grossesse

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