L'utilisation de la chromatographie en phase gazeuse pour l'analyse compositionnelle modifications des acides gras dans les tissus de foie de rat pendant la grossesse

L’objectif global de cette procédure est d’analyser la composition en acides gras du foie. Pour ce faire, il faut d’abord peser un échantillon de foie et l’homogénéiser. La deuxième étape consiste à extraire tous les lipides de l’échantillon de foie homogénéisé.

Ensuite, les différentes classes de lipides telles que les esters de cholestérol sont séparées par extraction en phase solide. La dernière étape est l’ification et la dérivitation des classes lipidiques en esters méthyliques d’acides gras. En fin de compte, la chromatographie en phase gazeuse est utilisée pour montrer comment la composition en acides gras des tissus peut changer à la suite d’une intervention nutritionnelle ou être influencée par des changements d’état physiologique tels que la grossesse.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la composition des acides gras dans les tissus, elle peut également être appliquée à d’autres types d’échantillons tels que l’huile, les graines et les aliments. En général, les utilisateurs novices dans cette technique peuvent avoir des difficultés car certaines parties du protocole nécessitent une dextérité manuelle et nécessitent de la pratique, comme la collecte répétitive des phases supérieure et inférieure. Hena, Fisk et Annette West, technicienne et doctorante de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Coupez d’abord environ 100 milligrammes de foie congelé et pesez le tissu. Placez le mouchoir dans un tube en plastique dans un seau à glace et ajoutez 0,5 millilitre de chlorure de sodium glacé à 0,9 %. Ensuite, homogénéisez le tissu et transférez-le dans un tube recouvert d’une vis de verre.

Utilisez 0,3 millilitre supplémentaire de chlorure de sodium à 0,9 % pour transférer tout tissu restant dans le tube à vis en verre. Ensuite, ajoutez 100 microgrammes de cholestérol heta dechen standard dissous dans deux à un, du chloroforme sec au méthanol dans le tube, suivi de cinq millilitres supplémentaires de la même solution de solvant contenant 50 milligrammes par litre d’hydroxy toluène butylé. Après avoir ajouté un millilitre d’une molaire de chlorure de sodium, bouchez le tube et mélangez soigneusement l’échantillon en tourbillonnant jusqu’à ce qu’il ait l’air uniforme.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 1000 fois G pendant 10 minutes avec une faible pause à température ambiante. Une fois terminé, prélevez la phase inférieure à l’aide d’un verre près de sa pipette et transférez-la dans un nouveau tube en verre à bouchon à vis. Ensuite, séchez l’échantillon sous azote à 40 degrés Celsius.

À ce stade, connectez le réservoir SPE à une pompe à vide et placez une cartouche SPE en silice amino-propylique sur le réservoir. Placez un nouveau tube en verre à bouchon à vis étiqueté TAG et CCE dans le support de réservoir sous la colonne pour recueillir la première fraction. Dissoudre l’extrait lipidique total dans un millilitre de chloroforme sec et mélanger l’échantillon par vortex.

Ensuite, transférez l’échantillon dans la colonne à l’aide d’une pipette à pâte de verre et laissez le liquide s’égoutter dans le tube à bouchon à vis sous l’effet de la gravité. Lorsque le liquide ne s’écoule plus de la colonne, retirez le liquide restant sous vide. Ensuite, éluez la fraction TAG et CE en lavant la colonne deux fois avec un millilitre de chloroforme sec sous vide.

Lorsque tout le liquide a fait allusion à la colonne, faites sécher la fraction TAG et CE sous l’azote à 40 degrés Celsius. Placez une nouvelle cartouche SPE en silice amino-propylique sur le réservoir SPE et placez un tube en verre à bouchon à vis dans le plateau du réservoir sous la cartouche pour collecter les déchets. Lavez la colonne avec un millilitre d’hexane sec trois fois sous vide.

Après avoir éteint l’aspirateur, lavez la colonne avec un dernier millilitre d’hexane H sous l’effet de la gravité. Après avoir remplacé le tube de déchets par un nouveau tube en verre à bouchon à vis étiqueté ce, dissolvez les fractions TAG et CE séchées dans un millilitre d’hexane sec et mélangez l’échantillon par vortex. Transférez ensuite l’échantillon dans la colonne à l’aide d’un laissez-passer en verre ou d’une pipette, et laissez le liquide s’égoutter à travers la colonne sous l’effet de la gravité.

Lorsque le liquide ne s’écoule plus de la colonne, retirez le liquide restant sous vide sous vide. Lavez la colonne deux fois avec un millilitre d’hexane sec pour éluer le CE et séchez la fraction collectée sous azote à 40 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de toluène sec à la fraction CE séparée et mélangez l’échantillon par vortex.

Ajouter un millilitre d’un réactif de méthylation préalablement préparé à l’échantillon dissous dans du toluène sec. Ensuite, fermez solidement le tube et mélangez : chauffez doucement l’échantillon pendant deux heures à 50 degrés Celsius. Une fois que les échantillons ont refroidi à température ambiante, ajoutez un millilitre de solution neutralisante.

Ensuite, ajoutez un verre d’hexane sec à l’échantillon. Après avoir vortex, centrifugez les échantillons à 250 fois G pendant deux minutes avec une faible pause à température ambiante. Une fois terminé, récupérez la phase de renommée supérieure et transférez-la dans un nouveau tube en verre jetable sans bouchon à vis. Faites sécher l’échantillon de renommée collecté sous azote à 40 degrés Celsius.

Après avoir placé un tube de déchets dans le réservoir SPE et une cartouche de gel de silice ou SPE sur le réservoir, lavez la colonne trois fois avec un millilitre d’hexane sec sous vide et un millilitre d’hexane sec sous gravité. Après l’enlèvement des lavages de déchets. Ajoutez un nouveau tube de déchets dans le réservoir, puis dissolvez l’échantillon CE fame dans un millilitre d’hexane sec.

Après avoir mélangé l’échantillon par vortex, transférez-le dans la colonne à l’aide d’un laissez-passer en verre ou d’une pipette. Une fois que le liquide s’est écoulé à travers la colonne sous l’effet de la gravité, lavez la colonne trois fois avec un millilitre d’hexane sous vide. Ensuite, retirez les déchets de lavage et placez un nouveau tube à bouchon à vis étiqueté CE fame dans le réservoir.

Éluer la fraction de renommée CE avec deux un millilitre de 95 à cinq hexane sec pour d éther éthylique. Ensuite, séchez la fraction collectée sous azote à 40 degrés Celsius, dissolvez la fraction séchée dans 75 microlitres d’hexane sec et mélangez l’échantillon par vortex après que l’échantillon ait été mélangé par vortex. Transférez-le dans un flacon d’échantillon automatique GC après avoir répété l’étape précédente.

Analysez l’échantillon sur un chromatographe en phase gazeuse si le protocole est suivi avec succès. Un chromatogramme avec des pics symétriques clairs et bien définis et avec un bruit de fond minimal doit être obtenu, comme illustré ici. En cas de contamination, le chromatogramme montrera des pics supplémentaires et présentera des pics non symétriques ou asymétriques, comme illustré ici.

La contamination par le cholestérol libre se produira lors de l’exécution de la renommée dérivée de l’EC, à moins que le cholestérol ne soit éliminé. L’utilisation d’un mélange d’étalonnage préparé permet d’identifier la renommée dans l’échantillon. Le mixage d’étalonnage est effectué à l’aide des mêmes paramètres d’instrument que les échantillons, de sorte que le chromatogramme peut être comparé à l’échantillon et que les pics peuvent être identifiés en fonction de leurs temps de rétention, comme illustré ici.

Le pic zéro 16 est mis en évidence ici pour illustrer la comparaison des temps de rétention entre le mélange d’étalonnage dans le chromatogramme supérieur et les acides gras. Dans la trace de l’échantillon inférieur, il est permis de marquer correctement la surface du pic d’acides gras pour calculer le pourcentage d’acides gras spécifiques dans le total. Une fois les données collectées, il est utile de les inspecter pour détecter les valeurs aberrantes, comme illustré ici.

Les échantillons aberrants peuvent ensuite être étudiés plus en détail et l’extraction et/ou l’analyse répétées si nécessaire. Comme indiqué ici, la renommée dans l’EC hépatique du rat est décrite comme un pourcentage des acides gras totaux dans l’EC hépatique. Ces données décrivent les acides gras CE dans le foie de rats vierges ou gravides nourris pendant 20 jours avec l’un des trois régimes différents.

L’analyse statistique à l’aide de deux facteurs Innova révèle des effets significatifs de l’alimentation et de la grossesse sur la proportion de plusieurs acides gras, ainsi que des interactions significatives entre le régime alimentaire et la grossesse. À titre d’illustration, la teneur en acide onique du CE hépatique chez les rates gravides est plus influencée par l’alimentation que celle des femelles vierges. Cette technique permet de prélever 20 échantillons par jour du début à la fin si elle est effectuée correctement.

Une fois maîtrisé, le dosage des échantillons peut augmenter le débit et doubler la quantité traitée en une semaine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser la composition en acides gras de différentes classes de lipides à l’aide de l’extraction en phase solide et de la chromatographie en phase gazeuse. N’oubliez pas que travailler avec des solvants peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler dans des hottes et porter un EPI approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.