Scalable High Throughput sélection à partir de bibliothèques d'anticorps synthétiques phage

L’objectif global de cette procédure évolutive est d’isoler des clones de phages fab spécifiques et de haute affinité à partir d’une bibliothèque de phages affichés à l’aide d’une approche à haut débit qui permet une sélection parallèle contre des centaines de domaines cibles antigéniques. Ceci est accompli en immobilisant d’abord les domaines antigéniques purifiés dans des plaques à micro-puits. Les prochaines étapes consistent à exposer, capturer, libérer et amplifier des clones de phages fabriqués qui se lient spécifiquement à l’antigène immobilisé sur microplaque lors de cycles successifs de sélection.

Au cours de ce processus, l’efficacité de la sélection est surveillée à l’aide de méthodes regroupées à chaque étape. La dernière étape consiste à évaluer la spécificité, l’affinité et/ou l’activité des clones de fabrication isolés. En fin de compte, des fragments spécifiques de fabrication de haute affinité contre un grand nombre d’antigènes sont isolés en parallèle, ce qui permet de générer des anticorps utiles à l’analyse de classes entières de protéines structurellement ou fonctionnellement apparentées.

L’importance de cette méthode réside dans le fait qu’elle offre une alternative qui peut aider à surmonter les limites et à accélérer le rythme des technologies conventionnelles de développement d’anticorps, que ce soit dans un laboratoire universitaire ou industriel. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques conventionnelles de développement d’anticorps telles que l’hybridome est qu’elle ne nécessite pas l’utilisation d’animaux. Il peut être utilisé pour pratiquement toutes les protéines, y compris les protéines toxiques et non immunogènes.

Comme nous le verrons, il est facilement parallélisé et produit finalement de l’ADN recombinant renouvelable codant pour un anticorps de haute affinité spécifique à un antigène particulier et des immunodosages fonctionnels et standard en aussi peu que six à huit semaines. Compte tenu de l’importance des anticorps dans la recherche en biomédecine, nous avons vu une opportunité d’adapter et d’adapter la génération d’antigènes, la sélection et l’identification des anticorps à une approche à haut débit tout en maintenant l’accessibilité à des laboratoires de tailles et de ressources disponibles variables. Le matin du jour de la sélection des phages, choisissez une seule colonie de cellules e coli résistantes aux phages.

Ajoutez-le à un millilitre de milieu à deux yt avec de la tétracycline à 50 microgrammes par millilitre. Laissez la colonie incuber en secouant à 200 tr/min dans un agitateur orbital de 2,5 centimètres. Une fois que la croissance de la culture est évidente visuellement, transférez les cellules dans le volume requis de milieu complété par de la tétracycline.

Il doit y en avoir assez pour 100 microlitres par sélection, soit environ 10 millilitres par 96. Boîte à puits étendre les aliquotes de la culture à la fois à la pénicilline de carbone et aux milieux supplémentés en canin. Ces cultures assurent la pré-infection dans les cellules à utiliser pour l’amplification.

Lorsque l’absorbance optique de la culture atteint 0,4 à 0,8 à 595 nanomètres. Après cinq à sept heures, les cellules sont prêtes à être appliquées sur les plaques d’antigène. Pour que ce protocole garantisse la couverture souhaitée de la banque, préparer suffisamment de plaques d’antigènes répliquées et de plaques de protéines de contrôle non spécifiques.

À l’aide du calcul affiché, les détails sont fournis dans le protocole texte. Après une nuit d’immobilisation des protéines cibles et des protéines témoins non spécifiques, retirer la solution protéique de la plaque. Ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage et bloquez pendant une heure en secouant et lavez la plaque quatre fois avant d’ajouter la bibliothèque de phages pendant que les cellules se développent.

Le jour de la sélection des phages, nous pré-éliminons les clones FAB non spécifiques ou spécifiques du phage de liaison spécifique de la bibliothèque en transférant 100 microlitres de la bibliothèque de phages sur les plaques de sélection négative pour une sélection négative supplémentaire. Supprimez le phage de liaison au marqueur en ajoutant un excès de marqueur d’affinité soluble. Pour ce faire, ajoutez une concentration finale de 10 micromolaires de GST soluble à chacun.

Ensuite, incubez les plaques pendant une à deux heures sur un shaker à température ambiante. Pour préparer la plaque protéique cible, aspirez la solution protéique de la plaque, ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage et bloquez pendant une heure en secouant et lavez quatre fois avant d’ajouter la bibliothèque de phages. Après l’incubation, prélevez le phage snat dans les plaques.

À l’aide d’un manipulateur de liquide à 96 canaux, transférez le supinate de phage dans des plaques enrobées d’antigène. Ensuite, incubez les plaques pendant une à deux heures sur un shaker à température ambiante. Après l’incubation, retirez le phage non lié en lavant les puits huit à 15 fois à l’aide d’un tampon PT.

Cela peut être fait manuellement ou avec un lave-plaques automatique. Ensuite, juste avant d’ajouter les cellules, retirez tout l’excès de tampon de lavage lorsque les cellules et les plaques d’antigène sont prêtes. Éluez le phage en ajoutant 100 microlitres de cellules en croissance dans chaque puits et laissez les plaques incuber à 37 degrés Celsius pendant une demi-heure.

On ne s’attend pas à ce que les premiers cycles de sélection produisent un enrichissement significatif, mais la quantification des titres de phages en sortie peut garantir l’illusion des concentrations minimales de phages nécessaires pour des sélections réussies. Pour ce faire, une aliquote de cellules peut être retirée avant l’ajout d’un phage auxiliaire afin de resserrer la production de phages en préparant et en plaquant des dilutions en série des cellules sur des plaques de gélose enrichies en antibiotiques. Après une demi-heure d’incubation, ajouter M 13 K oh sept phages auxiliaires dans chaque puits pour une concentration de 10 milliards d’unités formant colonies par millilitre.

Laissez les plaques incuber encore 45 minutes, cette fois en secouant à 200 tr/min. Ensuite, transférez les cellules dans un bloc de puits de 96 puits de profondeur avec un fond en V contenant 1,2 millilitre de deux milieux YT complétés par puits. Laissez les plaques à puits profonds incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit, en les secouant à 200 tr/min le lendemain.

Granulez les bactéries en faisant tourner les plaques à 4 000 GS pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, à partir de chaque plaque répétée, transférez des volumes égaux de surnageant contenant le phage dans un mini tube. Boîte bleue de microplaque à 96 puits à utiliser comme entrée pour les tours de sélection ultérieurs du phage regroupé, ajoutez un 10e volume de 10 XPBT et mélangez pour neutraliser.

Maintenant, répétez le processus de sélection à partir de la bibliothèque. Pré-élimination et incubation du phage antigénique trois à quatre fois à l’aide de phages amplifiés lors du tour de sélection précédent. Ainsi jusqu’à ce qu’un enrichissement de liaison cible soit observé par rapport à la liaison de protéines de contrôle non spécifiques par Eliza Micro : des plaques de puits codées avec deux microgrammes par millilitre, l’antigène ou la protéine de contrôle, comme décrit précédemment dans la pré-autorisation de la banque et l’incubation de l’antigène, des phages sont ensuite bloqués et lavés comme auparavant, des plaques enrobées d’antigène et de protéine de contrôle bloquées et lavées, appliquez 100 microlitres de supt de phage dilué dans les puits et laissez les plaques incuber en agitant pendant 15 minutes à température ambiante Après l’incubation, laver les plaques huit fois avec un tampon PT.

Ensuite, après les lavages, ajoutez 100 microlitres d’anticorps anti M 13 HRP à une lution de un à 5 000 dans PBT dans chaque puits d’incubation pendant une demi-heure pour permettre la liaison de l’anticorps au phage lié à l’antigène. Ensuite, lavez les plaques avec un tampon PT six fois et deux fois de plus avec du PBS droit, préparez, mélangez et appliquez 100 microlitres de substrat TMB un à un sur chacun des puits. Laissez-le réagir pendant cinq à 15 minutes, en arrêtant les réactions lorsqu’il y a un changement de couleur significatif.

Arrêtez les réactions en ajoutant 100 microlitres d’une molaire d’acide phosphorique. Maintenant, lisez l’absorbance dans les puits à 450 nanomètres et comparez les signaux de liaison cibles aux signaux de liaison des protéines de contrôle après enrichissement. Les clones individuels peuvent être isolés et caractérisés par séquençage du phage, conversion de l’ADN du phage lié à la fabrication libre et évaluation de la liaison directe à la cible à l’aide de FabuLisa clonale, comme expliqué dans la partie texte du protocole.

Pour les laboratoires dans lesquels un débit plus élevé est requis, cette méthodologie peut être mise à l’échelle et automatisée. Dans cet objectif, des robots personnalisés ont été développés pour étendre la capacité de sélection en automatisant tous les aspects de la procédure, y compris le blocage, le phage, la liaison, l’elucian et plus encore. Une approche pour obtenir un antigène à utiliser dans la sélection d’anticorps est l’utilisation de technologies de gènes synthétiques pour obtenir des constructions pour l’expression de domaines protéiques isolés.

Dans la plupart des cas, cela permet l’expression à haut débit et l’isolement de quantités adéquates d’antigène purifié suffisamment pur pour la sélection. Au cours des cycles successifs du processus de sélection, les concentrations de phages éludés et l’enrichissement des phages spécifiquement liés à l’antigène ont été surveillés soit par titrage des phages comme indiqué précédemment, soit par des pools de phages. Dans un test ELA, un rapport de liaison supérieur à deux indique généralement la présence de clones de liaison spécifiques.

À l’inverse, un rapport plus faible peut aider à déterminer la cause d’un échec de sélection. La caractérisation de la liaison d’un clone à l’aide d’un test amino colormétrique permet de comparer la liaison du phage fab ou fab à l’antigène immobilisé par rapport à la protéine témoin négative de liaison, ce qui permet d’obtenir une mesure de spécificité lors de la mise à l’échelle et de l’automatisation des sélections avec des unités robotisées de manipulation de liquides. L’utilisation de chromophores absorbants peut aider à détecter quand des canaux spécifiques dans la fluidique sont soit obstrués, soit ont perdu leur étanchéité, entraînant une livraison partielle de volume, et aider au dépannage lors de l’optimisation des procédures de lavage, l’utilisation de clones de liaison connus garantit que la liaison cible est maintenue pendant que la liaison d’arrière-plan est supprimée pendant les lavages.

De plus, des protocoles de décontamination efficaces garantissent l’absence de contamination croisée lors de cycles de sélection successifs ou de différentes procédures de sélection. En étendant cette technique à une application industrielle, nous espérons permettre aux chercheurs d’explorer des classes entières de protéines structurellement ou fonctionnellement apparentées en accélérant la sélection et l’identification d’anticorps renouvelables de haute affinité dans le but ultime d’obtenir une couverture maximale du protéome.