Imagerie en temps réel de l'unité d'ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

L’objectif global de cette procédure est d’imager en temps réel des transcrits d’ARN uniques dans des cellules vivantes. Ceci est accompli en hybridant d’abord deux oligonucléotides qui ont été conçus pour former une sonde formant une épingle à cheveux connue sous le nom de métrique de rapport par balise moléculaire. La deuxième étape consiste à purifier le rapport métrique par des balises moléculaires par chromatographie d’exclusion stérique.

Ensuite, la métrique de rapport par des balises moléculaires est introduite dans des cellules exprimant la cible d’ARN modifiée via micro porion. La dernière étape consiste à voir les cellules dans une plaque à micropuits adaptée à la microscopie à cellules vivantes. En fin de compte, la microscopie à fluorescence est utilisée pour surveiller les mouvements des transcrits d’ARN individuels visualisés sous forme de points fluorescents brillants dans des cellules uniques.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des sondes synthétiques qui sont photo-stables brillantes et présentent un signal de fond élevé, ce qui ouvre la possibilité d’imager n’importe quel ARN endogène Commencez la préparation de la métrique de rapport par balises moléculaires ou RBM BS en mélangeant les réactifs suivants dans un tube. 20 microlitres de Rbm B un 30 microlitres de Rbm B deux six microlitres de 10 x tampon phosphate, et quatre microlitres d’ADN et d’ARN d’eau libre. C’est généralement suffisant pour environ 50 études.

Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant ce temps, préparez une colonne de chromatographie liquide pour éliminer tout oligonucléotide RBM B hybride UN. Utilisez 75 super decks de qualité préparatoire dans une colonne de chromatographie liquide de huit millilitres avec un volume de lit d’environ quatre millilitres à l’aide d’une pompe à seringue fonctionnant à un débit de 0,6 millilitre par minute.

Lavez et équilibrez le SUEx avec environ 50 millilitres d’un tampon x phosphate avant que tout le liquide n’entre dans le volume du lit. Arrêtez la pompe à seringue, détachez-la et laissez le liquide restant traverser la colonne par gravité. Ensuite, chargez le mélange RBMB sur la colonne de chromatographie.

Une fois que l’échantillon RBMB est complètement entré dans le lit, ajoutez lentement 250 microlitres supplémentaires d’un tampon x phosphate au sommet du lit pour vous assurer que l’échantillon entier est complètement entré dans la colonne. Remplissez la colonne jusqu’au bord avec un tampon x phosphate. Fermez le haut et démarrez le tire-seringue.

La seringue est remplie d’environ 50 millilitres d’un XPBS et fonctionne à un débit de 0,6 millilitre par minute. En règle générale, l’échantillon RBMB peut être facilement visualisé en raison de la couleur du colorant incorporé dans la sonde. Une fois que le RBMB s’approche du bas de la colonne, collectez le flux à raison de deux gouttes par microtube de centrifugation.

Arrêtez de prélever l’échantillon. Une fois que la couleur de l’échantillon à l’intérieur des microtubes de centrifugation devient claire, combinez les tubes contenant l’échantillon RBMB coloré, généralement cinq à six tubes, et chargez-les dans un dispositif de filtre centrifuge. Centrifugez l’échantillon à 10 000 RCF pendant 20 minutes ou jusqu’à ce que le volume souhaité soit atteint.

Cette vitesse et ce temps donneront généralement un volume final d’environ 30 microlitres. Dans ce protocole, une lignée cellulaire de fibro-sarcome humain a été conçue pour exprimer Q-F-P-R-N-A avec 96 répétitions en tandem de la séquence cible RBMB dans les trois premiers UTR, la lignée cellulaire de contrôle a été conçue pour exprimer le type sauvage Q-F-P-R-N-A un jour avant l’administration de cellules de plaque de sonde dans un flacon T 25 à 40 à 50 % de culture de fluidité co. Les cellules avec un milieu DMEM complété par 1 % de streptocoque et 10 % de sérum bovin fœtal et incubent à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone le lendemain.

Allumez le micro por et configurez les paramètres de microportation optimisés pour les cellules HT 10 80. Remplissez le tube micro porion avec quatre millilitres de tampon électrolytique et placez-le sur la station de micro préparation. Décongeler un échantillon de stock de RBMB purifié et diluer plusieurs microlitres jusqu’à une concentration finale de 12 micromolaires avec un tampon x phosphate.

Un microlitre est nécessaire pour chaque micro porion. Pour chaque réaction de micro-porion, pipetez un millilitre de milieu de culture avec FBS, mais sans antibiotiques, dans un tube de micro-centrifugeuse. Mettez-le de côté près de l’appareil micro porion.

Il sera utilisé plus tard pour suspendre les cellules immédiatement après la micro-préparation. Les antibiotiques ne sont pas utilisés car ils diminueraient la viabilité cellulaire après la micro-préparation. Les cellules HT 10 80 conçues la veille doivent maintenant être de 60 à 80 % de confluent.

Retirez le milieu de culture cellulaire et lavez les cellules une fois avec un millilitre de DPBS sans calcium ni magnésium, incubez avec un millilitre de trypsine pendant une à deux minutes. Arrêtez la trypsine en ajoutant un millilitre de milieu DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal sans antibiotiques et rouge de phénol et transférez les cellules dans deux microtubes de centrifugation de 1,5 millilitre. Faites tourner les cellules du microtube à centrifuger à 200 fois G pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant, remettez en suspension et combinez les granules de cellules dans un volume final d’un millilitre de DPBS. Retirez 10 microlitres de la suspension cellulaire bien mélangée pour compter les cellules, pipetez les cellules de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer qu’elles sont bien dispersées et transférez 300 000 cellules avec DPBS dans un nouveau microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Faites tourner à 200 fois G pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille cellulaire. Remettez la pastille en suspension dans 11 microlitres de suspension Resus, tamponnez et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer que les cellules sont bien dispersées. Assurez-vous de ne pas générer de bulles d’air.

Ajoutez un microlitre de RBMB dilué et mélangez bien en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Encore une fois, veillez à ne pas générer de bulles d’air. Il est essentiel d’éviter d’introduire une bulle d’air dans la suspension de vente RBMB, car les bulles d’air provoqueront une étincelle pendant le micro-fonctionnement et entraîneront une mauvaise livraison de RBMB et des morts cellulaires.

À l’aide de la pipette de micro-préparation, aspirez 10 microlitres du mélange de cellules RBMB et insérez la pipette dans le tube de micro-préparation. Appuyez sur le bouton de démarrage pour démarrer la micro-entreprise. Il ne doit pas y avoir de bulles d’air visibles dans la pointe lorsque l’écran du micro por indique l’achèvement.

Retirez la pipette de la station et expulsez le mélange de 10 microlitres dans le tube de micro-centrifugeuse préalablement préparé contenant un millilitre de milieu de culture avec FBS, mais sans antibiotiques, mélangé doucement en balançant le tube d’un côté à l’autre plusieurs fois. Faites tourner les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes. Lavez les cellules deux fois dans un millilitre de milieu de culture sans rouge de phénol avec FBS, mais sans antibiotiques pour éliminer toutes les BS rbm qui n’ont pas été délivrées dans les cellules.

Après le deuxième lavage. Resus suspend les cellules dans 400 microlitres de milieu de culture sans rouge de phénol avec FBS, mais sans antibiotiques. Plaquez les cellules micro au prorata dans un verre de couverture à huit chambres préalablement enduit de poly de lysine à 200 microlitres par puits ou à la fluidité souhaitée.

Placez le verre de couverture dans un incubateur de culture cellulaire. L’imagerie peut être réalisée dès 30 minutes après la micro-préparation. Pour commencer cette procédure, allumez le système d’incubation par le haut de l’étage de cellules vivantes et équilibrez-le jusqu’à ce qu’il atteigne 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 75 % d’humidité.

Allumez le microscope et la source de lumière fluorescente et ouvrez le logiciel d’acquisition d’images métamorphes. Appliquez de l’huile immersive sur l’objectif. Transférez le verre de couverture chambré avec des cellules à micropores à l’étage de la cellule vivante.

Système d’incubation par le haut. Incuber le système supérieur de la scène jusqu’à ce que la température et les niveaux de dioxyde de carbone soient stabilisés. Ouvrez l’onglet d’acquisition dans le logiciel de métamorphose.

Cliquez sur le bouton Afficher en direct pour trouver le champ. Ajustez la mise au point sous une lumière blanche et cliquez sur le bouton d’arrêt en direct. Sous l’onglet acquérir.

Cliquez et ouvrez le bouton contextuel d’acquisition de flux et configurez les paramètres d’acquisition de films souhaités. Acquérez 150 images à l’aide du filtre SCI five CF six 40 R. Enregistrez les images sur le disque dur.

Voici des images représentatives de 10 cellules HT 80 exprimant de manière stable l’ARN avec 96 répétitions en tandem, ou quatre répétitions en tandem du site de liaison RBMB dans les trois premiers UTR. Suite à l’administration intracellulaire de mbs. La présence de 96 répétitions en tandem permet aux transcrits d’ARN individuels d’apparaître comme des points fluorescents brillants.

En revanche, les ARN ne contenant que quatre répétitions en tandem apparaissent sous forme de taches fluorescentes très faibles et ne sont souvent détectables que dans des zones où le bruit de fond est exceptionnellement bas. L’acquisition d’images en continu permet d’imager en temps réel les transcrits d’ARN individuels. Les transcrits individuels de l’ARN peuvent être facilement observés dans le cytoplasme et le noyau des cellules subissant des mouvements browniens ou subdiffusifs.

Dans de rares cas, un ARN subissant un transport dirigé sera observé comme illustré ici. Les transcrits d’ARN soumis à un transport dirigé se déplacent généralement rapidement le long d’un chemin droit. Dans ce montage, la trajectoire de la transcription de l’ARN est superposée sur une seule image de la série chronologique.

Les mouvements dirigés de l’ARN sont cohérents avec le transport de l’ARN le long des microtubules et des microfilaments. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer et de purifier la métrique raciale par des balises moléculaires. Introduisez des données métriques raciales par des balises moléculaires dans les cellules via des micro-parions et imagez les transcrits d’ARN uniques au microscope fluorescent.