Imagerie en temps réel de l'unité d'ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

L'objectif général de cette procédure est d'imaginer en temps réel des transcrits d'ARN uniques dans des cellules vivantes. Cela est réalisé en hybridant d'abord deux oligonucléotides conçus pour former une sonde en épingle à cheveux appelée balise moléculaire rationnelle. La deuxième étape consiste à purifier les balises moléculaires rationnelles par chromatographie d'exclusion stérique.

Ensuite, les sondes moléculaires fondées sur un ratio sont introduites dans des cellules exprimant la cible d'ARN conçue par micro-injection. La dernière étape consiste à transférer les cellules dans une plaque de microplaques adaptée à la microscopie de cellules vivantes. Enfin, la microscopie de fluorescence est utilisée pour suivre les déplacements des transcrits d'ARN individuels, visualisés comme des points fluorescents brillants au sein de cellules uniques.

L'avantage principal de cette technique est qu'elle utilise des sondes synthétiques brillantes, photostables et présentant un rapport signal sur bruit élevé, ce qui permet d'envisager l'imagerie de tout ARN endogène. Commencez la préparation du rapport métrique à l'aide de sondes moléculaires ou RBM BS en mélangeant les réactifs suivants dans un tube : 20 microlitres de Rbm B un, 30 microlitres de Rbm B deux, six microlitres de tampon phosphate 10 x, et quatre microlitres d'eau exempte d'ADN et d'ARN. Ce mélange est généralement suffisant pour environ 50 études.

Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant ce temps, préparer une colonne de chromatographie liquide pour éliminer tous les oligonucléotides RBM B deux non hybridés à UN. Utiliser 75 super decks de qualité préparative dans une colonne de chromatographie liquide de huit millilitres avec un volume de lit d'environ quatre millilitres, à l’aide d’une pompe à seringue fonctionnant à un débit de 0,6 millilitre par minute.

Lavez et équilibrez le SUEx avec environ 50 millilitres de tampon phosphate 1 x avant que tout le liquide n'entre dans le volume de la colonne. Arrêtez la pompe à seringue, détachez-la, et laissez le liquide restant s'écouler à travers la colonne par gravité. Ensuite, chargez le mélange RBMB sur la colonne de chromatographie.

Une fois que l'échantillon de RBMB est entièrement entré dans la colonne, ajouter lentement encore 250 microlitres de tampon phosphate à 1 x au sommet de la colonne afin de s'assurer que tout l'échantillon est complètement entré. Remplir la colonne jusqu'au bord avec du tampon phosphate à 1 x. Fermer le haut et démarrer la pompe de seringue.

La seringue est remplie d'environ 50 millilitres d'une XPBS et fonctionne à un débit de 0,6 millilitre par minute. Généralement, l'échantillon de RBMB peut être facilement visualisé en raison de la couleur du colorant incorporé dans la sonde. Une fois que le RBMB approche du bas de la colonne, recueillez l'écoulement dans des tubes microcentrifugeurs à raison de deux gouttes par tube.

Arrêtez de collecter l'échantillon. Une fois que la couleur de l'échantillon dans les tubes de microcentrifugation devient claire, combinez les tubes contenant l'échantillon coloré de RBMB, généralement cinq à six tubes, et chargez-les dans un dispositif de filtration centrifuge. Centrifugez l'échantillon à 10 000 RCF pendant 20 minutes ou jusqu'au volume souhaité.

Cette vitesse et cette durée donneront généralement un volume final d'environ 30 microlitres. Dans ce protocole, une lignée cellulaire de fibro-sarcome humain a été modifiée pour exprimer Q-F-P-R-N-A avec 96 répétitions en tandem de la séquence cible RBMB dans la région UTR trois prime, tandis que la lignée cellulaire témoin a été modifiée pour exprimer la forme sauvage de Q-F-P-R-N-A un jour avant la livraison de la sonde. Les cellules ont été cultivées dans un flacon T25 à une densité de 40 à 50 % de confluence. Les cellules ont été mises en culture dans un milieu DMEM complété avec 1 % de pen-strep et 10 % de sérum de veau fœtal, puis incubées à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone le jour suivant.

Activez le micro por et configurez les paramètres de microportionnement optimisés pour les cellules HT 10 80. Remplissez le tube de microportionnement avec quatre millilitres de tampon électrolytique et placez-le sur la station de micropréparation. Décongelez un échantillon témoin de RBMB purifié et diluez plusieurs microlitres à une concentration finale de 12 micromolaire avec du tampon phosphate 1 x.

Un microlitre est nécessaire pour chaque microportion. Pour chaque réaction de microportion, pipeter un millilitre de milieu de culture contenant du FBS, mais sans antibiotiques, dans un tube microcentrifuge. Le mettre de côté près du dispositif de microportion.

Il sera utilisé ultérieurement pour resuspendre les cellules immédiatement après la micropréparation. Les antibiotiques ne sont pas utilisés car ils réduiraient la viabilité cellulaire après la micropréparation. Les cellules HT 1080 modifiées génétiquement, ensemencées la veille, doivent maintenant être confluentes à 60 à 80 %.

Retirer le milieu de culture cellulaire et laver les cellules une fois avec un millilitre de DPBS sans calcium ni magnésium. Incuber avec un millilitre de trypsine pendant une à deux minutes. Arrêter la trypsine en ajoutant un millilitre de milieu DMEM complété avec 10 % de sérum fœtal bovin, sans antibiotiques ni rouge de phénol, puis transférer les cellules dans deux tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre. Centrifuger les cellules dans les tubes microcentrifugeurs à 200 × g pendant cinq minutes.

Retirer le surnageant, resuspendre et combiner les culots cellulaires dans un volume final d'un millilitre de DPBS. Prélever 10 microlitres de la suspension cellulaire bien mélangée pour compter les cellules, puis aspirer et expulser les cellules plusieurs fois à la pipette afin de s'assurer qu'elles sont bien dispersées. Transférer 300 000 cellules avec du DPBS dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Centrifuger à 200 × g pendant cinq minutes.

Éliminer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire. Resuspendre le culot dans 11 microlitres de tampon de resuspension Resus et pipeter plusieurs fois de haut en bas pour s'assurer que les cellules sont bien dispersées. Veiller à ne pas générer de bulles d'air.

Ajoutez un microlitre de RBMB dilué et mélangez soigneusement en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Encore une fois, faites attention de ne pas générer de bulles d'air. Il est essentiel d'éviter l'introduction de bulles d'air dans la suspension de cellules RBMB, car les bulles d'air provoqueraient une étincelle lors de l'opération microscopique et entraîneraient une mauvaise livraison des RBMB ainsi que la mort des cellules.

À l’aide de la pipette de micropréparation, aspirez 10 microlitres du mélange cellulaire RBMB et insérez la pipette dans le tube de micropréparation. Appuyez sur le bouton de démarrage pour lancer la micro-corporation. Il ne doit y avoir aucune bulle d’air visible dans l’embout lorsque l’écran du micro por affiche la fin du processus.

Retirer la pipette de la station et expulser le mélange de 10 microlitres dans le tube de microcentrifugation préparé auparavant contenant un millilitre de milieu de culture avec du FBS, mais sans antibiotiques, en mélangeant délicatement par des mouvements de basculement latéral du tube plusieurs fois. Centrifuger les cellules à 200 ×g pendant cinq minutes. Laver les cellules deux fois dans un millilitre de milieu de culture sans rouge de phénol, avec du FBS mais sans antibiotiques, afin d’éliminer tout le rbm BS qui n’aurait pas été introduit dans les cellules.

Après le deuxième lavage, resuspendre les cellules dans 400 microlitres de milieu de culture sans rouge de phénol, contenant du FBS mais sans antibiotiques. Placer les cellules micro-proratées dans une lamelle à huit puits préalablement préparée et revêtue de poly-L-lysine, en ajoutant 200 microlitres par puit ou à la confluence souhaitée.

Placer la lame à chambre dans une étuve à culture cellulaire. L'observation en microscopie peut être effectuée dès 30 minutes après la préparation de la microscopie. Pour commencer cette procédure, allumer le système d'incubation en surface pour cellules vivantes et l'équilibrer jusqu'à ce qu'il atteigne 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 75 % d'humidité.

Allumez le microscope et la source de lumière fluorescente, puis ouvrez le logiciel d'acquisition d'images Metamorph. Appliquez de l'huile à immersion sur l'objectif. Transférez la lame à chambre contenant les cellules micro-percées vers le plateau de cellules vivantes.

Système d'incubation supérieur. Incubez le système à plateau chauffant jusqu'à ce que la température et les niveaux de dioxyde de carbone soient stabilisés. Ouvrez l'onglet d'acquisition dans le logiciel MetaMorph.

Cliquez sur le bouton afficher l’image en direct pour localiser le champ. Ajustez la mise au point en lumière blanche, puis cliquez sur le bouton arrêter l’image en direct. Sous l’onglet acquérir.

Cliquez sur le bouton d’ouverture de la fenêtre contextuelle d’acquisition de flux et configurez les paramètres souhaités d’acquisition de film. Acquérez 150 images à l’aide du filtre SCI cinq CF six 40 R. Enregistrez les images sur le disque dur.

Voici des images représentatives de cellules HT 1080 exprimant de façon stable un ARN contenant 96 répétitions en tandem, ou quatre répétitions en tandem du site de liaison RBMB dans la région UTR trois prime. Après la livraison intracellulaire des mbs. La présence de 96 répétitions en tandem permet aux transcrits d'ARN individuels d'apparaître sous forme de points fluorescents intenses.

En revanche, les ARN ne contenant que quatre répétitions en tandem apparaissent comme des points fluorescents très faibles et ne sont souvent détectables que dans des zones présentant un fond exceptionnellement bas. L'acquisition d'images en flux permet d'observer individuellement les transcrits d'ARN en temps réel. Les transcrits d'ARN individuels peuvent être facilement observés dans le cytoplasme et le noyau des cellules, effectuant des mouvements browniens ou sous-diffusifs.

Dans de rares cas, un ARN en cours de transport dirigé sera observé comme illustré ici. Les transcrits d'ARN en cours de transport dirigé se déplacent généralement rapidement le long d'un trajet rectiligne. Dans ce montage, la trajectoire du transcrit d'ARN est superposée à une image unique de la série temporelle.

Les mouvements dirigés des ARN sont compatibles avec le transport des ARN le long des microtubules et des microfilaments. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation et de la purification de la racial metric à l’aide de sondes moléculaires. Introduire la racial metric à l’aide de sondes moléculaires dans les cellules par micro-parion et imager les transcrits d’ARN individuels au microscope fluorescent.