Name: Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Découvrez comment quantifier les mutations dans les cellules germinales mâles à l'aide d'un modèle de rongeurs transgéniques. Cette méthode permet d'évaluer directement l'impact des agents mutagènes sur la fréquence mutationnelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette recherche a été financée par les initiatives du Système de réglementation canadien en biotechnologie (SCRB) et du Plan de gestion des produits chimiques (PGPC).

<ol><li>Ahmadi, A., Ng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+ability+of+DNA-damaged+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa.</a> J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).</li>
<li>Crow, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins%2C+patterns+and+implications+of+human+spontaneous+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation.</a> Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).</li>
<li>Nelson, K., Holmes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malformations+due+to+presumed+spontaneous+mutations+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants.</a> N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).</li>
<li>Kong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+de+novo+mutations+and+the+importance+of+father%27s+age+to+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk.</a> Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).</li>
<li>Michaelson, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+in+autism+identifies+hot+spots+for+de+novo+germline+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation.</a> Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).</li>
<li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+decline+during+mouse+spermiogenesis+results+in+the+accumulation+of+heritable+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage.</a> DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).</li>
<li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+paternally-transmitted+chromosomal+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+C.+Embryo.+Today%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities.</a> Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).</li>
<li>Demarini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declaring+the+existence+of+human+germ-cell+mutagens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Declaring the existence of human germ-cell mutagens.</a> Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).</li>
<li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dominant-lethal+test+to+detect+genetic+activity+of+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health.+Perspect%22%5BJournal%5D)">Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals.</a> Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).</li>
<li>Russell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-induced+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray-induced mutations in mice.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).</li>
<li>Singer, T. M., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+mutagens%3A+Risk+assessment+challenges+in+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).</li>
<li>Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide%3A+A+cooking+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Acrylamide: A cooking carcinogen.</a> Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).</li>
<li>Witt, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+micronucleus+test+results+do+not+predict+the+germ+cell+mutagenicity+of+N-hydroxymethylacrylamide+in+the+mouse+dominant+lethal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).</li>
<li>Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sidestream+tobacco+smoke+is+a+male+germ+cell+mutagen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).</li>
<li>Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single+molecule+analysis+of+spontaneous+and+radiation-induced+mutation+at+a+mouse+tandem+repeat+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus.</a> Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).</li>
<li>Niwa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+mechanisms+of+genomic+instability+and+the+biological+significance+of+mutations+at+tandem+repeat+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).</li>
<li>Campbell, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+human+mutation+rate+using+autozygosity+in+a+founder+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population.</a> Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).</li>
<li>Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+for+quantifying+germline+mutation+frequency+in+humans+and+model+species%3A+Cautious+optimism%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism.</a> Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).</li>
<li>Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+MutaMouse+lambdagt10-lacZ+transgene%3A+Evidence+for+in+vivo+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements.</a> Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).</li>
<li>Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+review+of+transgenic+rodent+mutation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Detailed review of transgenic rodent mutation assays.</a> Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+the+testing+of+chemicals%3A+Transgenic+rodent+somatic+and+germ+cell+gene+mutation+assays%22">OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays</a>. , (2011).</li>
<li>Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testes+weight+reflect+ethylnitrosourea+induced+histopathology+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice.</a> Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).</li>
<li>Russell, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+male+germ-cell+stage+on+the+frequency%2C+nature%2C+and+spectrum+of+induced+specific-locus+mutations+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse.</a> Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+sperm+and+artificial+insemination+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting sperm and artificial insemination of mice.</a> J. Vis. Exp. (3), 184(2007).</li>
<li>Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+galactose-sensitive+E.+coli+strains+as+selective+hosts+for+LacZ-+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids.</a> Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254(1992).</li>
<li>Lemieux, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+benzo%5Ba%5Dpyrene-induced+pig-a+and+lacZ+mutations%2C+micronuclei+and+DNA+adducts+in+muta+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse.</a> Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).</li>
<li>Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+molecular+characteristics+of+mutations+induced+by+ethylnitrosourea+in+germ+cells+isolated+from+seminiferous+tubules+and+in+spermatozoa+of+lacZ+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).</li>
<li>Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose--response+curve+for+ethylnitrosourea-induced+specific-locus+mutations+in+mouse+spermatogonia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).</li>
<li>Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cII+locus+in+the+MutaMouse+system%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The cII locus in the MutaMouse system.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).</li>
<li>Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+induced+male+germline+mutation%3A+Correlations+and+comparisons+between+traditional+germline+mutation+assays%2C+transgenic+rodent+assays+and+expanded+simple+tandem+repeat+instability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Par rapport aux méthodes traditionnelles, le test de mutation des cellules germinales TGR fournit un moyen plus rapide, plus économique et plus sensibles de quantifier induit des mutations des cellules germinales in vivo. En évaluant transgène MF directement dans le sperme, par opposition à la descendance, le nombre d&#39;animaux, le temps et les ressources nécessaires pour évaluer le pouvoir mutagène de la lignée germinale d&#39;un seul composé est considérablement réduite. En termes de sensibilité, nous avons pu détecter une augmentation de 2,6 fois importante dans les cellules souches des spermatogonies MF après une exposition à 25 mg / kg FRA utilisant seulement 5 animaux par groupe de dose. En revanche, le test du locus spécifique a été incapable de détecter toute modification significative de MF à cette même dose en utilisant&gt; 3.000 souris dans le groupe exposé et&gt; 500 000 souris témoins 28. En plus de sa pertinence pour les deux enquêtes mécanistes et réglementaires, cette méthode donne l&#39;occasion à des études comparatives entre somatique et germinale ligne Mutatisur les taux. Des données récentes suggèrent que, pour certains agents mutations de cellules germinales peuvent être induites à une concentration inférieure à celle requise pour une mutation somatique. Par exemple, une exposition prolongée à la N-hydroxyméthylacrylamide, un métabolite de la acrylamide cancérigène alimentaire 12, augmente la fréquence des mutations des cellules germinales létales dominantes chez la souris sans affecter la fréquence de micronoyaux dans les cellules rouges du sang, une mesure traditionnelle de la cellule somatique dommages cytogénétiques 13. En outre, l&#39;exposition de souris à deux fréquences de mutation principale et secondaire du tabac la fumée de tabac élevés à répétition en tandem loci d&#39;ADN dans le sperme à des doses qui n&#39;augmentent pas la fréquence des micronoyaux dans le sang 14. Ces résultats remettent en question l&#39;hypothèse selon laquelle les tests de génotoxicité somatique est toujours protecteur de la lignée germinale, et renforcent la demande pour un moyen plus efficace et rentable pour quantifier germe fréquence de mutation cellulaire. Toutefois, la preuve pour préférentiels mutagènes des cellules germinales est encore faible, En grande partie en raison du manque de données disponibles pour comparer les taux de mutation dans les tissus des cellules somatiques et germinales. Le test de mutation TGR permet de tester en parallèle et la comparaison des taux de mutation induite dans plusieurs tissus utilisant le même transgène. Ainsi, le test de mutation comparative en utilisant le test TGR aiderait à combler les lacunes de données autour de la possibilité d&#39;effets sur les cellules germinales préférentiels. Évaluation simultanée de la mutation de cellules somatiques et germinales à des fins réglementaires permettrait également d&#39;améliorer l&#39;efficacité en réduisant le nombre d&#39;animaux nécessaires. La ligne directrice de l&#39;OCDE pour les mutations somatiques recommande un temps d&#39;administration de 28 jours, suivie d&#39;une période d&#39;échantillonnage de trois jours (28 + 3). Analyse de la queue des spermatozoïdes peut offrir une faible sensibilité à ce point de temps, car il cible les cellules exposées surtout pendant les spermatocytes et spermatides phases de la spermatogenèse (figure 3). Les cellules de ces phases ne synthétisent pas l&#39;ADN et perdent progressivement leur capacité de réparation de l&#39;ADN 6 &lt;/ Sup&gt;. En outre, l&#39;échantillonnage de la queue des spermatozoïdes à ce point dans le temps ne permettrait pas de détecter des mutations qui se produisent dans les cellules de spermatogonies et souches. Ainsi, pour l&#39;intégration dans la conception 28 + 3, la directrice de l&#39;OCDE recommande la collecte de cellules germinales à partir des tubules séminifères. Cette population mixte contient des cellules dérivées de la synthèse d&#39;ADN et de types de cellules de réparation compétent, notamment les cellules souches, et sont exposés à travers la majorité des phases spermatogenèse. Toutefois, en raison de la nature mixte de ces cellules, séminifère analyse de cellules de tubules ne fournit pas d&#39;information spécifique à la phase. En outre, il est à craindre que la présence de cellules non-cibles peuvent influencer le MF observé (par exemple faux positifs appels mutagène sur les cellules germinales en raison de la contamination de cellules somatiques mutés, ou dilution d&#39;un signal de cellules germinales muté à partir de cellules germinales réparation de l&#39;ADN déficientes) . Actuellement, il n&#39;existe pas de données suffisantes pour conclure si les résultats des cellules des tubules séminifères à 28 + 3 offre la même sensibilité et la spécificité d&#39;uns de la queue des spermatozoïdes à des moments ultérieurs. Notre laboratoire compare actuellement les CM induits dans les cellules des tubules séminifères et la queue des spermatozoïdes prélevés après différents temps d&#39;échantillonnage pour aborder cette question. Nous notons que la directrice de l&#39;OCDE suggère une période d&#39;échantillonnage de remplacement de 28 jours pour les tissus en division lente tels que le foie qui peut également être adapté à l&#39;analyse des cellules germinales. Néanmoins, les données disponibles sont encore insuffisantes et nous sommes actuellement pas en mesure de recommander un modèle expérimental unique pour l&#39;analyse simultanée de cellules somatiques et les cellules germinales en utilisant le test de mutation TGR à des fins réglementaires. Une des caractéristiques de cet essai qui devrait être noté est que les événements de mutation sont évalués sur un transgène non murin. Cependant, il ya suffisamment de preuves pour suggérer que le transgène répond aux agents mutagènes environnementaux d&#39;une manière similaire à des gènes endogènes 20. En outre, parce que les origines précises des événements mutationnels indépendants sont difficiles àrésoudre, les résultats sont généralement rapportées comme une fréquence de mutants (par opposition à une fréquence de mutation). La fréquence de mutation peut être effectivement résolu que si les résultats sont corrigés pour l&#39;expansion clonale (par exemple. La division et la multiplication d&#39;une cellule mutée qui peut contribuer à la fréquence observée des mutants transgéniques) par séquençage d&#39;ADN. Le séquençage des transgènes mutants peut être effectuée pour caractériser les mutations de lacZ, et identifier les mutants qui peuvent être dérivés à partir des événements de l&#39;expansion clonale, bien que cela augmente considérablement le temps et le coût de l&#39;analyse. En plus du gène lacZ, theλgt10 vecteur transgénique héberge un gène par mutation reporter alternatif dépendant de la température: une variante du gène λ du cil, ce qui est plus court (294 pb par rapport à la 3021 pb lacZ, figure 1) et plus facile à la séquence 29. Le séquençage permet également l&#39;analyse du spectre de mutation induite, donnant un aperçu de la mutatiomécanisme final du composé en question. Un exemple extrême de l&#39;expansion clonale est l&#39;apparition d&#39;un &quot;jackpot&quot; mutation (c&#39;est à dire., Mutations transgéniques à un stade très précoce du développement d&#39;un organe qui contribuent à une MF considérablement élevée, parfois des centaines de milliers de fois supérieures à fond). Animaux ou des tissus avec un &quot;jackpot&quot; mutation doivent être retirés de l&#39;analyse. Le test que nous avons décrit est largement applicable à d&#39;autres modèles, tels que la TGR BigBlue souris et le rat, la souris et le plasmide lacZ, qui abritent une mutation vecteurs rapporteurs similaires (passés en revue dans 20). La grande majorité des études sur les cellules germinales menées à ce jour qui emploient des méthodes similaires ont porté presque exclusivement sur ​​mutagènes bien caractérisées telles que FRA et le rayonnement (revue dans 30). Il est prévu que la récente publication de la ligne directrice d&#39;essai de l&#39;OCDE pour l&#39;essai TGR, ce test serade plus en plus populaire pour le dépistage chimique et évaluation réglementaire. L&#39;incorporation de la cellule germinale test de mutation TGR dans une batterie de test réglementaire comblera le vide existant en permettant une évaluation efficace de l&#39;induction de mutations dans les cellules germinales 11. De plus, ce dosage peut être utilisé pour mesurer MF dans pratiquement n&#39;importe quel tissu, en fournissant un moyen adapté pour comparer les sensibilités relatives des cellules somatiques et les cellules germinales à l&#39;induction de mutations par points de terminaison à des agents environnementaux génétiques identiques.

Mutations de l&#39;ADN sporadiques dans la lignée germinale peuvent conduire à la réussite de la reproduction réduite et, si hérité, peuvent provoquer une maladie génétique ou une prédisposition accrue au cancer chez les enfants 1-3. Preuve substantielle démontre qu&#39;une grande proportion de mutations de novo sont héritées de la lignée germinale paternelle 4, et que le nombre de mutations dans la descendance est positivement corrélée avec l&#39;âge du père au moment de la conception 5. La proportion plus élevée de mutations de sexe masculin est considéré comme un résultat de la différence d&#39;âge au cours de la gamétogenèse entre les sexes, le plus grand nombre de divisions cellulaires de la spermatogenèse par rapport au nombre de divisions cellulaires oogenic dans la lignée germinale femelle 2, et une diminution progressive de l&#39;ADN réparer l&#39;efficacité avec l&#39;âge chez les hommes. Tous ces facteurs contribuent à une probabilité accrue d&#39;erreurs de réplication dans la lignée germinale mâle 6. Cependant, l&#39;impact de l&#39;exposition paternelle à Envirofacteurs nnement sur ​​la fréquence des mutations de novo reste incertaine. Néanmoins, un grand nombre d&#39;agents d&#39;environnement sont connues pour induire des mutations germinales chez les rongeurs 7, et il existe des preuves croissantes que certains de ces agents peut aussi affecter la lignée germinale humaine 8. Malgré ces préoccupations, les produits chimiques sont régulièrement testés pour leur capacité à induire des mutations dans les cellules somatiques à des fins réglementaires et il est généralement admis que les tests somatiques sont suffisantes pour protéger la lignée germinale. Par conséquent, les produits chimiques ne sont que rarement évalués pour leur capacité à induire des mutations germinales. Tests de mutagénicité des cellules germinales Une raison a été largement omis de la réglementation processus de prise de décision est un manque de méthodes pratiques. Méthodes basées sur des rongeurs traditionnels, tels que les mortels 9 et 10 tests spécifiques locus dominantes, estiment les taux de mutation des cellules germinales en marquant phénotypes mutants dans des embryons ou des descendants deparents exposés. Ces tests nécessitent l&#39;utilisation d&#39;un très grand nombre d&#39;animaux, de temps et de ressources pour acquérir des résultats statistiquement significatifs. Bien que plusieurs méthodes modernes de quantification de mutation des cellules germinales ont récemment vu le jour, beaucoup souffrent de lacunes en termes de praticité, l&#39;efficacité et la pertinence biologique. Par exemple, répéter mutations de longueur à répétition en tandem simples (RETE) loci élargi peut être quantifiée dans les cellules germinales mâles utilisant une approche PCR de molécule unique 15. Toutefois, l&#39;exécution de cette méthode peut être techniquement difficile et laborieux, et contrairement à des mutations ponctuelles, la signification biologique et la santé des changements dans la longueur de répétition du RETE loci très instable restent peu claires 16. Technologies de séquençage du génome entier modernes peuvent fournir une foule de données biologiquement significative lorsqu&#39;elle est appliquée au problème de mutations héréditaires 4,17, mais le coût élevé, les taux d&#39;erreur élevés, validation associé requispour confirmer les mutations, et bioinformatiques défis limiter encore l&#39;application systématique de cette option à titre d&#39;essai réglementaire 18. Ici, nous décrivons une méthode pratique pour quantifier directement les mutations induites dans les cellules germinales de souris mâles transgéniques. Ce protocole est décrit par le modèle de MutaMouse transgénique, qui a de multiples copies d&#39;un vecteur concaténés λgt10 de phage recombinant contenant un gène rapporteur lacZ intégré Escherichia coli dans les deux copies du chromosome 3 19 (figure 1). Ce protocole est également s&#39;appliquer à d&#39;autres rongeurs transgéniques (TGR) modèles basés sur les mêmes principes (BigBlue souris et le rat, ou lacZ plasmide souris, etc.) Ou légèrement différents gènes rapporteurs (de la souris delta gpt et le rat, modèles TGR examinés en Lambert et . al 20). Cette méthode est basée sur l&#39;essai de mutation décrit dans l&#39;une TGR récemment publiéet révisée de l&#39;OCDE directrice pour l&#39;essai 21 et nous élaborons sur les considérations spéciales nécessaires pour accueillir évaluation des mutations dans la lignée germinale mâle en raison des caractéristiques uniques de la spermatogenèse. En bref, l&#39;essai consiste à exposer des souris mâles transgéniques à une substance mutagène, suivie par un temps d&#39;échantillonnage lorsque les lésions pré-mutation sont fixés à des mutations stables. A l&#39;instant d&#39;échantillonnage choisi, les souris sont euthanasiées et les cellules germinales sont recueillies à partir de l&#39;une ou l&#39;autre de la queue de l&#39;épididyme ou les tubes séminifères. Comme nous le verrons, des effets mutagènes à différents stades de la spermatogenèse peut être déterminé en sélectionnant le délai entre l&#39;exposition et la collecte de l&#39;échantillon. Inserts transgéniques, comprenant des copies multiples du génome du phage λ par cellule, sont isolés de l&#39;ADN génomique des cellules germinales et emballés dans des capsides vides de phage λ créant des particules de phage infectieux de λ qui sont ensuite utilisés pour infecter un E. hôte coli. Les bactéries infectées sont cultivées sur sélecmédias tives qui peuvent distinguer les cellules contenant un vecteur d&#39;une copie mutée de lacZ de cellules hébergeant de type sauvage lacZ. L&#39;effet mutagène de l&#39;exposition sur la lignée germinale mâle est déterminée en comparant la fréquence des transgènes mutantes entre le contrôle et les souris traitées (Figure 2, examinées dans Lambert et al. 20). Un grand nombre de cellules germinales peut être analysée à partir d&#39;une seule souris, ce qui donne une sensibilité supérieure ce dosage par rapport aux procédés traditionnels, tout en réduisant le nombre d&#39;animaux requis. Et parce que aucun équipement ou de formation spécialisée est nécessaire, ce test fournit une option pratique et efficace pour les tests de mutation des cellules germinales dans la plupart des laboratoires moléculaires modernes de la biologie de toxicologie /. Une condition essentielle pour l&#39;application effective de l&#39;essai de mutation des cellules germinales TGR est une compréhension du cycle de la spermatogenèse (Figure 3). Le temps pour les cellules germinales de souris au progrès de stcellules em dans les tubules séminifères à spermatogonies, spermatocytes, spermatides, et enfin à la maturité des spermatozoïdes dans l&#39;épididyme (c.-à-la spermatogenèse.) est d&#39;environ 49 jours. Mutation peut se produire à diverses étapes de ce cycle et est souvent spécifique composé. Deux caractéristiques clés qui revêtent un intérêt particulier à la mutagenèse dans les cellules germinales mâles sont l&#39;arrêt de la synthèse de l&#39;ADN lors de la méiose tôt, et la perte progressive de la capacité de réparation d&#39;ADN 6 à la fin de l&#39;après-méiose, deux processus qui sont nécessaires pour l&#39;induction et la fixation de la plupart des mutations. En raison de ces caractéristiques uniques de la spermatogenèse, il ya trois variables expérimentales critiques pour la conduite de la TGR mutation des cellules germinales essai: (1) le temps de l&#39;administration du composé d&#39;essai; (2) le temps d&#39;échantillonnage; et (3) la sélection de la population de cellules germinales de recueillir pour analyse (figure 3 et tableau 1). Le temps d&#39;administration est le experimeNTAL variables qui détermine la façon dont les cellules cibles longues sont exposées aux composés d&#39;essai. La longueur de la durée d&#39;administration peut également être utilisé pour cibler l&#39;exposition à des types cellulaires spécifiques ou des phases de la spermatogenèse. Par exemple, une administration quotidienne unique pourrait être utilisée pour déterminer les effets d&#39;une exposition de courte durée sur un type cellulaire particulier. De même, l&#39;exposition peut être porté à toute une phase de la spermatogenèse, par exemple en ciblant les spermatocytes seule division méiose, ou division mitotique des spermatogonies en utilisant un temps d&#39;administration de 2 semaine et un temps d&#39;échantillonnage approprié. Temps de l&#39;administration chronique et subchronique sont utilisées pour évaluer les effets de l&#39;exposition à long terme, pour assurer la distribution de pharmacocinétique du composé suffisante de test, ou de permettre une accumulation suffisante de mutations de mutagènes faibles (par exemple le temps d&#39;administration de 28 jours recommandé dans le test de l&#39;OCDE directive). Temps d&#39;échantillonnage est la variable critique pour déterminer à quila phase de la spermatogenèse les cellules cibles étaient dans au moment de l&#39;exposition. La période d&#39;échantillonnage dicte combien de temps, et donc combien plus loin le long du cycle de la spermatogenèse, les cellules passer après l&#39;exposition. Par exemple, pour étudier les effets dans les spermatogonies de cellules souches, un temps d&#39;échantillonnage&gt; 49 jours est nécessaire si la collecte de sperme en pleine maturité, ou&gt; 42 jours si la collecte de cellules germinales immatures à partir des tubules séminifères, afin de s&#39;assurer que toutes les cellules recueillies ont eu suffisamment de temps pour développer à partir de cellules exposées tiges. Il est important de noter que le temps d&#39;échantillonnage d&#39;au moins 70 jours serait préférable de démontrer un véritable effet sur les cellules souches à prévoir suffisamment de temps pour la distribution de pharmacocinétique de la substance toxique, pour l&#39;élimination des cellules exposées à des phases ultérieures de la spermatogenèse, et pour tenir compte de une période de stérilité temporaire qui peut se produire ~ 6 semaines après l&#39;exposition à des composés hautement mutagènes 22. De même, un temps d&#39;échantillonnage de 21 jours permettrait de garantir que les spermatozoïdes colleDirection exécutive de l&#39;épididyme de la queue de l&#39;auraient tout juste de terminer la méiose, le dernier jour de l&#39;exposition. Les cellules germinales peuvent être collectées comme spermatozoïdes matures de la queue de l&#39;épididyme, ou un mélange de différents types de tubes séminifères des cellules de la spermatogenèse. Sperme mûr dans le reste de la queue de ~ 3 jours, ce qui permet de déterminer avec précision par rapport au type de cellule ou de la phase de la spermatogenèse à partir de laquelle le sperme est issue de tout protocole expérimental donné. Ainsi, l&#39;analyse de la queue de sperme permis hautement recherches sur les effets de mutations spécifiques au stade ciblé. D&#39;autre part, les suspensions de cellules recueillies à partir des tubules séminifères contiennent un mélange de différents types de cellules germinales dans les différentes phases du développement, et offrent donc une moins bonne résolution de la phase de la spermatogenèse, dans lequel les mutations sont originaires. En outre, les suspensions de cellules récupérées à partir des tubules séminifères ont tendance à contenir une représentation des spermatides-dessus, suivie par les spermatocytes, et very peu spermatogonies et les cellules souches (ces proportions sont représentés par des barres blanches gradués sur la figure 3). En outre, les suspensions préparées à partir des tubules séminifères peuvent également contenir diverses cellules somatiques. Ainsi, en raison tant de types de cellules sont présentes, les effets de mutations peuvent être influencées par une variété de cellules non cibles. Toutefois, la collecte des échantillons de tubes séminifères offre une option économique pour le dépistage simultané de plusieurs types de cellules germinales, et une intégration facile de l&#39;analyse des cellules germinales dans le protocole d&#39;essai standard de l&#39;OCDE pour une mutation somatique. Pour réitérer, selon les besoins du chercheur, le temps d&#39;administration, la durée de l&#39;échantillonnage et de la population de cellules recueillies peuvent être ajustés pour interroger les effets de l&#39;exposition à divers types de cellules et à des phases différentes de la spermatogenèse. En choisissant soigneusement ces variables, les expériences peuvent être conçus pour des études mécanistiques ciblées, ou pour le test réglementaire plus généraliséefins ing. Pour atteindre la maîtrise de l&#39;analyse, nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;une administration orale aiguë de 100 mg / kg de N-éthyl-N-nitrosourée (FRA), suivie par une période d&#39;échantillonnage de 70 jours de contrôle positif. Analyse de la queue des spermatozoïdes vise ainsi les cellules souches des spermatogonies (figure 3), qui présentent généralement une multiplication par 4-5 dans la fréquence des mutants (MF) par rapport aux témoins suite à cette dose très mutagène de FRA. Il est à noter que cette dose est connue pour induire la stérilité six semaines après l&#39;exposition, ainsi il peut ne pas être une dose de commande approprié pour la réduction des temps d&#39;échantillonnage. Cette dose sera également produire une augmentation détectable dans la plupart des tissus MF 20 somatiques. Les résultats représentatifs présentés ci-dessous ont été recueillies à la suite d&#39;un régime d&#39;exposition aiguë +70 utilisant trois doses de FRA jusqu&#39;à et y compris 100 mg / kg.

<table><tbody><tr><td>MutaMouse</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (lacZ-/galE-)</td><td>Covance-Voir</td><td></td> <td>référence 25 dans le manuscrit</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Caledon</td><td>3001-2-40</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,5 M, pH 8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03690 FLUKA</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isoamylique</td><td>Caledon</td><td>2/10/7900</td><td></td></tr><tr><td>Lennon LB base de bouillon</td><td>Invitrogen</td><td>12780-029</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à mailles en acier inoxydable</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3770</td><td></td></tr><tr><td>Extrait d’emballage Transpack</td><td>Agilent Technologies</td><td>200220</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique anhydre (EtOH)</td><td>Alcools</td> <td>commerciaux-Ampiciline</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco</td><td>11593-027</td><td>préparer 20 mg/ml dans dH2O</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gibco</td><td>11815-024</td><td>préparer 5 mg/ml dans dH2O</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15509-097</td><td>Saturer dans 0,1 M Tris-HCl selon les instructions du fabricant</td></tr><tr><td>Phényl-&bêta ;-D-galactopyranoside (P-Gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6501</td><td>dissoudre 3 g pour 10 ml de diméthylformamide</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530-031</td><td>préparer une solution de 60 mg/ml dH2O juste avant l’utilisation, 20 &micro ; l par échantillon</td></tr><tr><td>Acétate de sodium (NaAc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td>préparer une solution de 3 M, pH 5,2</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>préparer une solution à 10 % dans dH2O</td></tr><tr><td>1 M MgSO4</td><td></td><td></td><td>24,6 g de MgSO4&middot ; 7H2O par 100 ml dH2O, autoclave, conserver à température ambiante jusqu’à 1 an</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td></td><td></td><td>5,0 g LB base, 6,4 g de NaCl par 1 L dH2O. Autoclave et</td></tr><tr><td>citrate de sodium salin (SSC) froid150</td><td></td><td></td> <td>mM NaCl, 15 mM de citrate trisodique, pH 7,0</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> SM <td>5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4&middot ; 7H2O, 50 ml 1 M de Tris-HCl (pH 7,5), 5,0 ml de gélatine (2 % p/v), par 1 L de dH2O, autoclave, stocker à température ambiante jusqu’à 1 an</td></tr><tr><td>tampon</td><td></td><td></td> TE <td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td></tr></tbody></table>

rongeurs transgéniques test pour quantifier homme cellules germinales mutant fréquence

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Les mutations de novo apparaissent principalement dans la lignée germinale masculine et peuvent contribuer à des problèmes de santé dans les générations suivantes. Les méthodes traditionnelles d’évaluation de l’induction de mutations des cellules germinales nécessitent l’utilisation d’un grand nombre d’animaux, ce qui les rend peu pratiques. En tant que telle, la mutagénicité des cellules germinales est rarement évaluée lors des tests chimiques et de l’évaluation des risques. Nous décrivons ici un essai in vivo de mutation de cellules germinales mâles à l’aide d’un modèle de rongeur transgénique basé sur une ligne directrice d’essai récemment approuvée par l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE). Cette méthode utilise un test de sélection positive in vitro pour mesurer les mutations in vivo induites dans un vecteur λgt10 transgénique porteur d’un gène rapporteur directement dans les cellules germinales des mâles exposés. Nous décrivons en outre comment la détection de mutations dans le transgène récupéré dans les cellules germinales peut être utilisée pour caractériser la sensibilité spécifique au stade des différents types de cellules spermatogènes à l’exposition aux mutagènes en contrôlant trois paramètres expérimentaux : la durée de l’exposition (temps d’administration), le temps entre l’exposition et le prélèvement de l’échantillon (temps d’échantillonnage) et la population cellulaire recueillie pour l’analyse. Parce qu’un grand nombre de cellules germinales peuvent être analysées à partir d’un seul mâle, cette méthode a une sensibilité supérieure à celle des méthodes traditionnelles, nécessite moins d’animaux et donc beaucoup moins de temps et de ressources.

Avec un nombre de plages moyenne de 200 000 plaques par animal, on observe généralement un fond moyenne MF d&#39;environ 2,8 x 10 -5 dans les cellules germinales mâles avec une déviation standard de 1,7 x 10 -5 dans nos groupes de contrôle (basé sur les données de huit indépendant expériences). Avec ce nombre de plaque, le niveau de fond et de la variance, les groupes de dose avec n = 5 animaux chacun sont suffisants pour détecter une augmentation de 2 fois dans MF avec une puissance&gt; 0,8. Les résultats sont généralement signalées dans les tableaux ou graphiques formats. Tableau 2 et figure 6 montrent des résultats représentatifs de la queue des spermatozoïdes des hommes MutaMouse (n = 5 par groupe) exposés à une dose unique orale aiguë de 0, 25, 50 et 100 mg / kg N-éthyl-N-nitrosourée (ENU), suivie par un temps d&#39;échantillonnage de 70 jours. Cette période de 70 jours permet de mesurer des événements mutationnels qui ont eu lieu dans les spermatozoïdes qui sont des cellules souches des spermatogonies au moment de l&#39;exposition (Figure 3). La densité de la plaque sur des plaques typiques mutantes et titrage sont présentés sur la figure 7. Comme représenté dans le tableau 2 et figure 6, une exposition de courte durée ENU induit une augmentation dose-dépendante significative de la MF de cellules souches des spermatogonies. La faible dose a induit une augmentation significative de 2,6 fois par rapport aux témoins, ce qui a une ligne de base MF de 2,6 x 10 -5. Induction maximale a eu lieu dans la dose élevée, ce qui a provoqué une augmentation d&#39;un facteur 4,4 par rapport aux témoins. Un exemple de cette analyse effectuée sur les cellules des tubules germinales séminifères se trouve à Douglas et al. 27, où MF a été déterminée dans des cellules de tubule germinales à différents intervalles de temps après une répétition de l&#39;injection intra-péritonéale de 5 jours de 50 mg / kg ENU. Dans cette étude, la proportion de mutants dans les cellules séminifères ont augmenté jusqu&#39;à 15 jours après le traitement et sont restées constantes par la suite. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr tr=""><td> Expoque le régime </td><td> Des tissus prélevés </td><td> Type de cellules recueillies (cellule cible) </td><td> Phase de cellule cible au début de l&#39;exposition </td><td> Phases passés lors de l&#39;exposition </td></tr><tr><td> Aiguë + 70 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> les cellules souches </td><td> les cellules souches </td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> Spermatogonies </td><td> Spermatide </td></tr><tr><td> 14 + 35 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> les cellules souches </td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td> + 28 3 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> Spermatocyte </td><td> Spermatocyte Spermatide Spermatozoïdes matures </td></tr><tr><td></td><td> Tubules </td><td> les cellules souches </td><td> les cellules souches </td><td> les cellules souches </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatogonies </td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatogonies </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatocyte </td><td></td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatide </td><td></td><td> Spermatide </td></tr><tr><td> 28 + 49 </td><td> Cauda </td><td> Spermatozoïdes matures </td><td> cel souches </td><td> les cellules souches </td></tr><tr><td></td><td> Tubules </td><td> les cellules souches Spermatogonies Spermatocyte Spermatide </td><td> les cellules souches </td><td> les cellules souches </td></tr></tbody></table> Tableau 1 Les types de cellules et les phases de la spermatogenèse qui sont ciblés par le transgénique essai rongeur de mutation par divers modèles expérimentaux. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Groupe dose </td><td> Animaux # </td><td> Mutant PFU </td><td> Total des PFU </td><td> MF (x10 -5) </td><td> Moyenne MF (x 10 -5) </td><td> Facteur de changement </td><td> p-valeur </td></tr><tr><td> Contrôle </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 137835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 431396 </td><td> 0,5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 mg / kg </td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162353 </td><td> 10.5 </td><td> 6.9 </td><td> 2.6 </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mg / kg </td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155727 </td><td> 10,9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0,0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193499 </td><td> 12,9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133859 &lt;/ Td&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 mg / kg </td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170968 </td><td> 15.2 </td><td> 11,5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0,0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234584 </td><td> 11,9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145289 </td><td> 6.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292236 </td><td> 12,0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190848 </td><td> 11,5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Le tableau 2 de la fréquence de mutants de la queue du sperme dans lacZ mâle transgénique de mglace exposée aiguë à FRA quand ils étaient les spermatogonies souches (de temps d&#39;administration = 1 journée, le temps d&#39;échantillonnage = 70 jours). PFU = plaque forming unit, MF = fréquence des mutants. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> Figure 1: Une représentation schématique de la construction du phage λgt10. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> Figure 2: Un aperçu du rongeur germe test de mutation des cellules transgéniques. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> Figure 3 Une vue schématique de la spermatogenèse chez la souris et les types de cellules et de phases qui sont ciblés par le transgénique essai rongeur de mutation par différents modèles expérimentaux. Remarque: Les barres blanches diplômés représentent la proportion relative des types de cellules présentes dans les suspensions cellulaires préparées à partir des tubules séminifères (c. spermatides&gt; Spermatocytes&gt; spermatogonies&gt; cellules souches). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> Figure 4 Collection de la queue de l&#39;épididyme de souris. A) Faire une incision dans l&#39;abdomen vers le scrotum. B) Identifier le coussinet adipeux de l&#39;épididyme. C) Tirez doucement sur ​​le coussinet adipeux de faire ressortir les testicules et de l&#39;épididyme. D) Recherchez et exciser la queue de l&#39;épididyme. Figure 5 Préparation de la suspension de cellules germinales à partir des tubules séminifères. A) Une incision est faite dans la capsule épithéliale du testicule, de l&#39;exposition des tubes séminifères. B) Les tubes séminifères sont pressés hors de la capsule. C) un rouleau de tissu est délicatement passé sur les tubes à un angle de 5-10 ° par rapport à libérer les cellules germinales contiennent. D) La suspension de cellules germinales sont collectées pour un autre traitement. <img alt="Figure 6" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> Figure 6 Représentation graphique de la fréquence des mutations de lacZ dans MutaMouse sperme exposé aiguë que les cellules souches de FRA (n = 5). Chaquetriangle représente la MF d&#39;un animal. * p &lt;0,05 comme déterminé par régression de Poisson. <img alt="Figure 7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> Figure 7 plaques d&#39;agar représentatifs de l&#39;essai de mutation de rongeurs transgéniques avec des plaques formées sur une pelouse de E. coli bactéries hôtes. A) Les plaques &quot;mutants&quot; auront très peu de plaques (marqués par des flèches), en particulier dans les groupes de dose de contrôle, qui de temps en temps avoir zéro plaques sur des plaques. B) Les plaques &quot;de titre&quot; peuvent avoir des centaines de plaques.

Les mutations de novo dans la lignée germinale masculine peuvent contribuer à des problèmes de santé dans les générations suivantes. Nous décrivons ici un protocole pour l’utilisation d’un modèle de rongeur transgénique pour quantifier les mutations dans les cellules germinales mâles induites par des agents environnementaux.

Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la fréquence des mutations induites dans un gène rapporteur récupéré à partir des cellules germinales de souris mâles transgéniques après exposition à un mutagène chimique ou physique. Cela est réalisé en exposant d'abord des souris mâles à un mutagène soupçonné d'affecter les cellules germinales. La deuxième étape consiste à recueillir les cellules germinales après qu'elles ont progressé à travers les stades souhaités de la spermatogenèse.Ensuite, l'ADN contenant le transgène rapporteur de mutation est récupéré à partir des cellules germinales. La dernière étape consiste à encapsuler les gènes rapporteurs récupérés dans des particules de bactériophage lambda. Enfin, un dosage de sélection positive in vitro est utilisé pour mesurer la proportion de gènes rapporteurs récupérés à partir des cellules germinales qui ont subi une mutation.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test du locus spécifique ou le test domino little, est que les mutations sont mesurées directement dans les cellules germinales, plutôt que d’analyser la descendance mutante. Un grand nombre de cellules germinales peut être analysé à partir d’un seul mâle, ce qui améliore la sensibilité du test par rapport aux méthodes traditionnelles, tout en réduisant considérablement le nombre d’animaux utilisés, les ressources et le temps. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la toxicologie génétique et de la mutagénèse, telles que l’identification d’agents mutagènes pour les cellules germinales et l’élucidation de leurs modes d’action.Bien que nous décrivions la méthode pour le modèle murin Muta, elle peut être facilement appliquée à d'autres systèmes de rongeurs transgéniques porteurs de vecteurs rapporteurs de mutations bactériophages. De plus, bien que la méthode décrive le processus pour les cellules germinales mâles, elle est généralement applicable aux tissus somatiques, et surtout, elle est couverte par une ligne directrice d'essai harmonisée au niveau international publiée par l'OCDE. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés avec le chronométrage de la partie in vitro du test, car plusieurs étapes comportent de longues périodes d'attente.Les étapes doivent être soigneusement planifiées et coordonnées afin de mener cette méthode à bien dans les délais. La procédure sera démontrée par John Gingrich et Linda Soper, biologistes dans mon laboratoire, avant le début de l'expérience. Trois variables expérimentales critiques doivent être choisies : le moment d'administration, le moment d'échantillonnage et la population de cellules germinales collectée.Ces variables peuvent être ajustées afin d'étudier les effets de l'exposition sur divers types de cellules germinales et à différentes phases de la spermatogenèse. Pour commencer cette procédure, répartir aléatoirement des souris mâles transgéniques âgées de huit à douze semaines en un groupe témoin et des groupes de traitement, avec un minimum de cinq souris par groupe. Ensuite, traiter les souris avec un composé testé et un témoin approprié selon une voie d'exposition adaptée pendant la durée d'administration choisie.Ensuite, choisissez le moment d'échantillonnage approprié en fonction du type de cellule métagénique spermatique d'intérêt. Une fois le moment d'échantillonnage atteint, euthanasiez les souris par dislocation cervicale sous anesthésie à l'isoflurane. Pour retirer les testicules, pratiquez une incision dans l'abdomen, localisez le bourrelet adipeux épidermique.Tirer délicatement le bourrelet adipeux pour extraire les testicules et l'épididyme du scrotum. Ensuite, dissectionner la queue de l'épididyme. Congeler la queue de l'épididyme dans de l'azote liquide et conserver à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.Lorsque vous êtes prêt à traiter le sperme de Cota, décongelez l'épididyme de Cota sur de la glace, puis transférez le Cota décongelé dans une boîte de Pétri. Ensuite, utilisez un scalpel ou une lame de rasoir pour hacher finement l'épididyme de Coda, puis pipetez 700 microlitres de DPBS à température ambiante dans la boîte de Pétri. Utilisez ensuite une pipette large orifice de 1000 microlitres pour libérer les spermatozoïdes de l'épididyme en aspirant et en rejetant la suspension environ 10 fois, ou jusqu'à ce que le DPBS devienne trouble en raison de la présence de spermatozoïdes. Filtrez la suspension spermatique à travers un filtre en maille d'acier inoxydable dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, puis centrifugez le tube à 11 000 × g pendant trois minutes.Versez soigneusement le surnageant hors du tube sans perturber le culot. Ensuite, ajoutez un millilitre de chlorure de sodium et citrate de sodium froid à 1 x, et vortexez le tube jusqu'à ce que le culot soit complètement resuspendu. Puis, ajoutez 15 microlitres de SDS à 10 % dans le tube et agitez vigoureusement le tube pendant 30 secondes pour lyser les cellules non spermatozoïdes.Ensuite, centrifuger le tube à 11 000 ×g pendant deux minutes. Après la centrifugation, verser soigneusement le surnageant hors du tube et ajouter 940 microlitres de chlorure de sodium citrate froid à 0,2 x, puis vortexer à nouveau le tube jusqu'à ce que le culot soit resuspendu. Ajouter 120 microlitres de béta-mercaptoéthanol, 100 microlitres de SDS à 10 %, 20 microlitres d'EDTA 0,5 molaire à pH 8 et 20 microlitres de 60 milligrammes par millilitre.Protéinase K ajoutée aux spermatozoïdes resuspendus. Bien mélanger la solution, puis placer le tube sur un agitateur rotatif toute la nuit à 37 degrés Celsius pour la digestion. Après la digestion nocturne, extraire l'ADN des spermatozoïdes en suivant les étapes décrites dans le protocole textuel pour réaliser une extraction au phénol-chloroforme. Après l'extraction, procéder aux étapes suivantes.Dissoudre le précipité d'ADN dans 40 à 100 microlitres de tampon tris EDTA pH huit et conserver à quatre degrés Celsius. Prévoir plusieurs jours pour que l'ADN se dissolve complètement avant de passer à l'étape suivante le jour même. Avant de réaliser le test de mutation LAX Z, préparer et stériliser à l'autoclave une quantité suffisante d'agarose inférieure pour le nombre d'échantillons à traiter.Ensuite, verser de manière aseptique l'agar dans des boîtes de Pétri de 90 millimètres et laisser l'agar durcir dans un tube de 50 millilitres. Ajouter 10 millilitres de bouillon LB, 100 microlitres de solution de maltose à 20 %, 25 microlitres d'ampicilline à 20 milligrammes par millilitre et 20 microlitres de solution à cinq milligrammes par millilitre de canamycine. Puis ensemencer le tube avec des E. coli LAX Z négatif GAL e négatif, et faire croître la culture toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation à 240 tr/min. Le premier jour du dosage, repiquer les cellules en préparant une dilution au 1/100 de la culture de nuit dans du LB frais sans antibiotiques.Incuber la culture à 37 degrés Celsius avec agitation à 240 tr/min pendant environ trois heures ou jusqu'à ce que l'OD 600 atteigne un. Une fois que l'OD 600 atteint un, diviser la suspension cellulaire uniformément dans des tubes de 50 millilitres et centrifuger à 1 300 ×g à 15 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans la moitié du volume initial de LB contenant du sulfate de magnésium à 10 millimolaire.Mettre les cellules de côté pendant la préparation des autres réactifs. Emballer l'ADN dans des particules de bactériophage Lambda en pipetant d'abord. Quatre microlitres de l'ADN extrait du sperme de coda à l'aide d'une pipette à large orifice dans un tube de 1,5 millilitre.Décongelez le premier tube d'un kit d'extrait d'emballage de phage à température ambiante, puis pipetez 4,8 microlitres de l'extrait d'emballage dans le tube contenant l'ADN. Ensuite, mélangez délicatement la solution à l'aide de la pointe de pipette, puis incubez le tube dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Ensuite, décongelez le deuxième tube d'extrait d'emballage et, à nouveau, pipetez 4,8 microlitres dans le tube contenant l'ADN.Agiter doucement la solution à l’aide de la pointe de pipette, puis incuber le tube dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Resuspendre les particules de bactériophages encapsulées dans 500 microlitres de tampon salin au magnésium, et placer les tubes sur un agitateur rotatif pendant 30 minutes à 20 tr/min. Après agitation, vortexer brièvement les échantillons, puis centrifuger à 11 000 ×g pendant 30 secondes afin de ramener les échantillons au fond des tubes.Les particules de bactériophages sont désormais prêtes pour l'infection. Ensuite, préparez huit millilitres d'agar supérieur pour chaque plaque de titrage et chaque plaque mutante. Maintenez l'agar supérieur à 50 degrés Celsius avant d'ajouter du sulfate de magnésium à 10 millimolaire, et ajoutez trois grammes par litre de l'agent sélectif PGAL pour la sélection des mutants.Utiliser uniquement la tarière supérieure avant l'infection des cellules. Étiqueter deux tubes de 50 millilitres par échantillon, en indiquant l'un comme mutant et l'autre comme titrage. Puis étiqueter huit plaques de tarière par échantillon, quatre pour le mutant et quatre pour le titrage.Ensuite, pipetez deux millilitres de cellules resuspendues dans chaque tube de 50 millilitres. Ajoutez 500 microlitres de particules de phage conditionnées dans un tube de 50 millilitres étiqueté mutant. Mélangez doucement le tube et laissez les particules de phage infecter les cellules pendant 30 minutes à température ambiante.Après une incubation de 30 minutes, vortexer brièvement les cellules infectées, puis transférer 15 microlitres des cellules infectées dans le tube de titrage de 50 millilitres correspondant. Ajouter 30 millilitres d'agar top de titrage à 50 degrés Celsius dans le tube de titrage de 50 millilitres. Répartir immédiatement le mélange d'agar et de cellules entre les quatre plaques de titrage.Veillez à ce que trois grammes par litre de P gal aient été ajoutés à la vis sans fin de sélection des mutants à 50 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de la vis sans fin de sélection des mutants contenant PGAL au tube mutant de 50 millilitres. Puis répartissez immédiatement le mélange de vis sans fin et de cellules entre les quatre plaques mutantes.Laisser durcir les boîtes, puis les retourner et les incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après l'incubation nocturne, compter le nombre de plaques sur les boîtes de mutants et de titrage. Ensuite, estimer la fréquence des mutants en divisant le nombre total de plaques de mutants comptées, sur les quatre boîtes de mutants, par le nombre total estimé d'unités formant des plaques dans le volume total de cellules infectées, déterminé à partir des boîtes de titrage.Un essai typique de mutation des cellules germinales chez des rongeurs transgéniques donne très peu de plaques sur les géloses sélectives pour les mutants, particulièrement dans les groupes témoins. En revanche, des centaines de plaques sont détectées sur les géloses de titrage. L'exposition de mâles de souris mutt à une dose orale aiguë unique de 0, 25, 50 et 100 milligrammes par kilogramme d'ENU, suivie d'un temps d'échantillonnage de 70 jours, a permis la mesure des événements mutationnels dans les cellules souches spermatogoniales.La faible dose d'ENU a induit une augmentation de 2,6 fois la fréquence des mutants par rapport aux témoins, et la dose maximale a provoqué une augmentation de 4,4 fois. Lors de la conception d'expériences utilisant cette procédure, il est important de toujours tenir compte du moment auquel elle est réalisée. Le cycle métagénique des spermatozoïdes, le moment d'administration, le moment d'échantillonnage et le type de cellules collectées doivent être soigneusement choisis afin d'observer les effets provenant du type cellulaire métagénique spermatique souhaité.Après cette procédure, un séquençage de l'ADN peut être effectué sur les plaques mutantes afin de caractériser les mutations et d'identifier les mutants pouvant provenir d'événements d'expansion clonale. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la toxicologie génétique pour identifier des mutagènes susceptibles de cibler la lignée germinale. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer la fréquence de mutants induits dans les cellules germinales ou chez des souris mâles transgéniques exposées à un mutagène.Ce test présente des applications potentielles dans les essais réglementaires des mutagènes des cellules germinales, ainsi que dans des études mécanistiques plus ciblées.

transgenic-rodent-assay-for-quantifying-male-germ-cell-mutant

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Protocoles pour la transplantation de cellules germinales et xénogreffe de tissus testiculaires sont décrits. Les résultats des cellules germinales de transplantation dans les pays donateurs dérivé spermatogenèse dans les testicules bénéficiaires et représente un test fonctionnel pour la reconstitution d'identification des cellules souches des spermatogonies (SSC). Tissu testiculaire xénogreffe reproduit le développement des testicules et de la spermatogenèse des espèces des différents...

Transplantation des cellules germinales et de tissus testiculaire xénogreffe chez la souris

Nous décrivons ici un test in vivo de mutagenèse dans des petits nombres de cellules hématopoïétiques purifiées en utilisant le modèle de souris transgénique LacI. Le gène Lacl peut être isolé afin de déterminer la fréquence, le lieu et le type de mutants d'ADN spontanément surgi ou après l'exposition à génotoxines.

Identifier ADN mutations dans purifié hématopoïétiques cellules souches / progénitrices

Nous décrivons les étapes détaillées d’un dosage chimique à haut débit chez le nématode Caenorhabditis elegans utilisé pour évaluer la toxicité germinale. Dans cet essai, la perturbation de la fonction germinale suite à une exposition à un produit chimique est surveillée à l’aide d’un rapporteur fluorescent spécifique aux embryons aneuploïdes.

Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

La résistance au stress est l'une des caractéristiques de longévité et est connu pour être génétiquement régie. Ici, nous avons développé une méthode à haut débit impartiale pour le dépistage de mutations qui confèrent la résistance au stress dans des cellules ES avec laquelle de développer des modèles de souris pour les études de longévité.

Approche génétique de l&#39;avant pour découvrir les gènes de résistance au stress chez la souris - un écran haute-débit dans les cellules ES

Ce travail décrit la standardisation d'une méthode pour obtenir des populations de cellules germinales purifiées à partir d'un tissu testiculaire de différentes espèces de mammifères. C'est un protocole simple qui combine la dissociation des testicules mécaniques, la coloration avec Hoechst-33342 et l'iodure de propidium, et le triage FACS, avec de larges applications dans des études comparatives de la biologie de la reproduction masculine.

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I

Beaucoup de traitements et de mutations génétiques incidence sur le calendrier de la maturité sexuelle et la fertilité. Ce protocole décrit une méthode non invasive d’évaluation début pubertaire chez les souris et les rats avant la mise en place d’une étude de fertilité chez des animaux sexuellement matures.

Détermination de la compétence reproduction en confirmant début pubertaire et effectuer un test de fertilité chez des Rats et des souris

Cet article décrit comment effectuer des tests de comportement sexuel chez les souris mâles.

Évaluation du comportement sexuel des souris mâles

Cet article vise à fournir la méthodologie pour la transgenèse lentivirale chez les embryons de rats à l’aide d’injections multiples d’une suspension de virus dans l’espace périvitelline zygote. Les rats femelles qui sont accouplés avec une souche masculine fertile avec une couleur de fourrure dominante différente est employée pour générer des mères adoptives pseudo-enceintes.

Génération de rats transgéniques utilisant une approche vectorielle lentivirale

Ici, nous décrivons l’immunoprécipitation des ribosomes et de l’ARN associé de populations choisies de cellules mâles adultes de germe de souris utilisant le système de RiboTag. La reproduction stratégique et l’immunoprécipitation soigneuse donnent des résultats propres et reproductibles qui informent sur le translatome des cellules germinales et donnent un aperçu des mécanismes des phénotypes mutants.

Immunoprécipitation de RiboTag dans les cellules germinales de la souris mâle

Ici, nous présentons une méthode d’injection de spermatides rondes (ROSI) chez la souris, une technique aux applications cliniques prometteuses et utile pour étudier les mécanismes sous-jacents au développement embryonnaire.

Injection ronde de spermatide de souris

Découvrez comment quantifier les mutations dans les cellules germinales mâles à l'aide d'un modèle de rongeurs transgéniques. Cette méthode permet d'évaluer directement l'impact des agents mutagènes sur la fréquence mutationnelle.

Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence

Explorer plus de vidéos