Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la fréquence des mutations induites dans un gène rapporteur récupéré dans les cellules germinales de souris transgéniques mâles après une exposition à un mutagène chimique ou physique. Ceci est accompli en exposant d’abord des souris mâles à un mutagène germinal suspecté. La deuxième étape consiste à collecter les cellules germinales après qu’elles aient progressé à travers les étapes souhaitées de la spermatogenèse.

Ensuite, l’ADN contenant le transgène rapporteur de mutation est récupéré dans les cellules germinales. La dernière étape consiste à emballer les gènes rapporteurs récupérés dans des particules de phage lambda. En fin de compte, un test de sélection positive in vitro est utilisé pour mesurer la proportion de gènes rapporteurs récupérés dans les cellules germinales qui ont été mutées.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le test de locus spécifique ou le test domino-petit, est que les mutations sont mesurées directement dans les cellules germinales plutôt que de noter la progéniture mutante. Un grand nombre de cellules germinales peuvent être étudiées à partir d’un seul mâle, ce qui améliore la sensibilité du test par rapport aux méthodes traditionnelles, tout en réduisant considérablement le nombre de ressources animales et le temps. Cette méthode peut résoudre des problèmes clés dans le domaine de la toxicologie génétique et de la mutagénèse, tels que l’identification d’agents mutagènes pour les cellules germinales et l’élucidation de leurs modes d’action.

Bien que nous décrivions la méthode pour le modèle de souris Muta, elle peut être facilement appliquée à d’autres systèmes de rongeurs transgéniques qui portent des vecteurs de mutation de phage de bactéries. De plus, bien que la méthode décrive le processus pour les cellules germinales mâles, elle a une applicabilité générale aux tissus somatiques et, surtout, elle est couverte par une ligne directrice d’essai harmonisée au niveau international publiée par l’OCDE. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à s’adapter au moment de la partie in vitro de l’essai, car plusieurs des étapes ont de longues périodes d’attente.

Les étapes doivent être soigneusement planifiées et coordonnées pour mener à bien cette méthode en temps opportun. John Gingrich et Linda Soper, biologistes dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avant de commencer l’expérience. Trois variables expérimentales critiques doivent être sélectionnées, soit le temps d’administration, le temps d’échantillonnage et la population de cellules germinales recueillies.

Ces variables peuvent être ajustées pour interroger les effets de l’exposition dans divers types de cellules germinales et à différentes phases de la spermatogenèse. Pour commencer cette procédure, répartissez au hasard des souris mâles transgéniques âgées de huit à 12 semaines dans un groupe témoin et des groupes de traitement avec un minimum de cinq par groupe. Traitez ensuite les souris avec un composé d’essai et un témoin approprié via une voie d’exposition appropriée pour le temps d’administration choisi.

Ensuite, choisissez le moment d’échantillonnage approprié en fonction du type de cellule métagénique de spermatozoïde d’intérêt. Ensuite, après que le temps d’échantillonnage ait eu lieu, euthanasier les souris par luxation cervicale sous anesthésie au fluor. Pour retirer les testicules, faites une incision dans l’abdomen, localisez le coussinet adipeux de l’épiderme.

Tirez délicatement sur le coussinet adipeux pour extraire les testicules et l’épididyme du scrotum. Épicise ensuite la cote épididyme. Congelez la Cota epididymus dans de l’azote liquide et conservez-la à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.

Lorsque vous êtes prêt à traiter le sperme de Cota, décongelez le Cota epididymus sur de la glace, puis transférez le Cota décongelé dans une boîte de Pétri. Ensuite, à l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir, hachez soigneusement la pipette coda Epididymus de 700 microlitres de DPBS à température ambiante dans la boîte de Pétri. Ensuite, utilisez une pointe de pipette de 1000 microlitres à large alésage pour libérer les spermatozoïdes de la coda en tirant et en relâchant la suspension environ 10 fois ou jusqu’à ce que le DPBS devienne trouble avec des spermatozoïdes, filtrez la suspension de spermatozoïdes à travers un filtre à mailles en acier inoxydable dans un tube frais de 1,5 millilitre, puis centrifugez le tube à 11, 000 fois G pendant trois minutes.

Décantez soigneusement le surnageant hors du tube sans déranger la pastille. Ajoutez ensuite un millilitre de froid, un x citrate de sodium salin et agitez le tube jusqu’à ce que la pastille soit complètement remise en suspension. Ensuite, ajoutez 15 microlitres de 10 % SDS dans le tube et secouez vigoureusement le tube pendant 30 secondes pour perturber les cellules non spermatozoïdes.

Ensuite, centrifugez le tube à 11 000 fois G pendant deux minutes. Après la centrifugation, décantez soigneusement le surnageant hors du tube et ajoutez 940 microlitres de 0,2 x citrate de sodium salin froid, et agitez à nouveau le tube jusqu’à ce que la pastille soit remise en suspension. Ajoutez 120 microlitres d’éthanol, 100 microlitres de 10 % SDS, 20 microlitres de 0,5 molaire, EDTA pH huit et 20 microlitres de 60 milligrammes par millilitre.

Protéinase K aux spermatozoïdes remis en suspension. Mélangez bien la solution, puis placez le tube sur un rotateur pendant la nuit à 37 degrés Celsius pour digérer après la digestion de la nuit. Extrayez l’ADN du spermatozoïde de la coda en suivant les étapes décrites dans le protocole textuel pour effectuer une extraction de phénol chloroforme après extraction.

Dissoudre le précipité d’ADN dans 40 à 100 microlitres de tampon tris EDTA PH huit et stocker à quatre degrés Celsius. Attendez plusieurs jours pour que l’ADN se dissolve complètement avant de passer à l’étape suivante de la journée. Avant d’effectuer le test de mutation LAX Z, préparez et autoclavez une quantité suffisante de vis sans fin inférieure pour le nombre d’échantillons traités.

Ensuite, de manière aseptique, versez la tarière dans des boîtes de Pétri de 90 millimètres et laissez la tarière se solidifier dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de bouillon LB, 100 microlitres de solution de maltose à 20 %, 25 microlitres de 20 milligrammes par millilitre d’ampicilline et 20 microlitres de cinq milligrammes par millilitre. Peut mycin puis inoculer le tube avec LAX Z négatif GAL e négatif e coli, et croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en secouant à 240 RPM le premier jour de la sous-culture de test les cellules en préparant une dilution de un à 100 de la culture de nuit dans du LB frais sans antibiotiques.

Incuber la culture à 37 degrés Celsius en secouant à 240 tr/min pendant environ trois heures ou jusqu’à ce que la DO 600 soit égale à un. Une fois que l’OD 600 atteint un, divisez uniformément la suspension cellulaire dans des tubes de 50 millilitres et centrifugez à 1, 300 fois G à 15 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans la moitié du volume original de LB contenant 10 millimolaires de sulfate de magnésium

Mettez les cellules de côté pendant que les autres réactifs sont préparés. Empaquetez l’ADN dans des particules de phages Lambda par pipetage préalable. Quatre microlitres d’ADN extraits du sperme de la coda à l’aide d’une pipette de large calibre dans un tube de 1,5 millilitre.

Décongelez le premier tube d’un kit d’extraction d’emballage de phage à température ambiante, puis pipetez 4,8 microlitres d’extrait d’emballage dans le tube contenant l’ADN. Ensuite, remuez doucement la solution avec la pointe de la pipette, puis incubez le tube dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Ensuite, décongelez le deuxième tube d’extraction de l’emballage et à nouveau, pipetez 4,8 microlitres dans le tube contenant l’ADN.

Mélangez doucement la solution avec la pointe de la pipette, puis incubez le tube dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant 1,5 heure. Remettez en suspension les particules de phage emballées dans 500 microlitres de tampon salin de magnésium et placez les tubes sur un rotateur pendant 30 minutes à 20 tr/min. Après la rotation, vortex brièvement les échantillons, puis centrifugez à 11 000 fois G pendant 30 secondes pour collecter les échantillons au fond du tube.

Les particules de phages sont maintenant prêtes pour l’infection. Ensuite, préparez huit millilitres de vis sans fin supérieure pour chaque titre et plaque mutante. Maintenez les vis supérieures à 50 degrés Celsius avant d’ajouter du sulfate de magnésium à 10 millimolaires et ajoutez trois grammes par litre de l’agent sélectif PGAL à la sélection mutante.

Vis supérieure seulement avant l’infection des cellules. Étiquetez deux tubes de 50 millilitres par échantillon, étiquetez un mutant et un titre. Étiquetez ensuite huit plaques de tarière par échantillon, quatre mutantes et quatre titres.

Ensuite, pipetez deux millilitres de cellules remises en suspension dans chaque tube de 50 millilitres. Ajoutez 500 microlitres de particules de phage emballées dans un tube de 50 millilitres étiqueté mutant. Mélangez doucement le tube et laissez les particules de phage infecter les cellules pendant 30 minutes à température ambiante.

Après l’incubation de 30 minutes, vortex brièvement les cellules infectées, puis transférez 15 microlitres de cellules infectées dans le tube de titrage correspondant de 50 millilitres. Ajoutez 30 millilitres de tarière supérieure à 50 degrés Celsius dans le tube de titrage de 50 millilitres. Répartissez immédiatement le mélange de vis sans fin et de cellules entre les quatre plaques de titrage.

Assurez-vous que trois grammes par litre de gallon ont été ajoutés à la vis de sélection des mutants à 50 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 30 millilitres de la vis de sélection mutante contenant du PGAL dans le tube mutant de 50 millilitres. Ensuite, répartissez immédiatement la quantité de mélange de vis sans fin et de cellules dans les quatre plaques mutantes.

Laissez les plaques se solidifier, puis retournez les plaques et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation d’une nuit, comptez le nombre de plaques sur les plaques mutantes et les plaques de titre. Estimez ensuite la fréquence des mutants en divisant le nombre total de plaques mutantes comptées, comptées sur les quatre plaques mutantes, par le nombre total estimé d’unités formant des plaques dans le volume total de cellules infectées déterminé à partir des plaques de titre.

Un test typique de mutation germinale de rongeur transgénique donne très peu de plaques sur les plaques de tarière mutante, en particulier dans les groupes témoins. Alors que d’autre part, des centaines de plaques sont détectées sur les plaques de titre. L’exposition de souris mâles à une dose orale aiguë unique de 0, 25, 50 et 100 milligrammes par kilogramme d’ÉNU, suivie d’une période d’échantillonnage de 70 jours, a permis de mesurer les événements mutationnels dans les cellules souches de spermatogonies.

La faible dose d’ENU a induit une augmentation de 2,6 fois de la fréquence des mutants par rapport aux témoins, et la dose maximale a provoqué une augmentation de 4,4 fois. Lors de la conception d’expériences qui utilisent cette procédure, il est important de toujours prendre en compte le moment de celle-ci. Le cycle métagénique des spermatozoïdes, le temps d’administration, le temps d’échantillonnage et le type de cellule collecté doivent être soigneusement sélectionnés afin d’observer les effets provenant du type de cellule métagénique de spermatozoïde souhaité.

À la suite de cette procédure, le séquençage de l’ADN peut être effectué sur les plaques mutantes afin de caractériser les mutations et d’identifier les mutants qui peuvent être dérivés d’événements d’expansion clonale. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la toxicologie génétique pour identifier les mutagènes qui peuvent cibler la lignée germinale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la fréquence mutante induite dans les cellules germinales ou les souris mâles transgéniques exposées à un mutagène.

Ce test a des applications potentielles dans les tests réglementaires pour les mutagènes des cellules gemmes, et dans des investigations mécanistes plus ciblées.