Purification non chromatographique de polypeptides recombinants élastine et de leurs fusions avec des peptides et des protéines Escherichia coli

L’objectif global de cette procédure est de purifier les polypeptides recombinants de type élastine à partir d’E coli par cycle de transition inverse. Ceci est accompli en collectant d’abord le lysat à partir de cellules E coli qui ont exprimé l’élastine recombinante comme le polypeptide, et en éliminant les débris cellulaires insolubles par centrifugation. La deuxième étape consiste à éliminer les contaminants solubles en induisant la transition polypeptidique de l’élastine avec l’ajout de sel ou de chaleur.

Ensuite, la collecte de l’élastine comme le polypeptide se couche par centrifugation et élimination du surnageant. Cette étape est appelée essorage à chaud. Ensuite, la solution polypeptidique de type élastine en suspension est centrifugée pour éliminer les contaminants insolubles.

Le polypeptide soluble de type élastine dans le surnageant est conservé et la pastille est jetée. Cette étape est appelée essorage à froid, répétez les cycles de spins chauds et froids jusqu’à ce que la pureté satisfaisante de l’élastine comme le polypeptide soit atteinte. En fin de compte, le cycle de transition inverse produit de l’élastine pure comme des produits polypeptidiques qui peuvent être caractérisés pour être utilisés dans une variété d’applications biomédicales.

Les polypeptides de type élastine purifiés par cette technique ont un certain nombre d’applications utiles, notamment la biodétection, l’ingénierie tissulaire et l’administration de médicaments, où la température de transition et l’architecture biopolymère du polypeptide de type élastine peuvent être spécifiquement ajustées pour chaque application. Pour commencer, exprimez le plasmide codant pour l’ELP souhaité en e coli en utilisant les conditions décrites dans le protocole de texte ci-joint. Après avoir secoué une culture d’un litre dans un incubateur pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, transférez la culture dans une bouteille de centrifugeuse d’un litre, puis centrifugez la bouteille à 2000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Ensuite, jetez le surnageant et le réusin. Suspendez le granulé dans de l’eau PBS ou un autre tampon souhaité jusqu’à un volume total de 45 millilitres. Ensuite, la suspension cellulaire a été transférée dans un tube conique de 50 millilitres.

Placez la suspension cellulaire sur de la glace et, une fois refroidie, le sonicate pendant un total de neuf minutes par cycles de 10 secondes de marche et 20 secondes d’arrêt. Avec une puissance de sortie de 85 watts. Laissez l’échantillon refroidir sur de la glace pendant environ 10 minutes après le premier cycle de sonication, puis répétez le cycle de sonication de neuf minutes.

Transférez le lysat dans un tube à centrifuger à fond rond de 50 millilitres. Ajoutez ensuite deux millilitres de polyéthylène de 10 % de poids par volume pour chaque litre de culture, puis secouez le tube pour mélanger ensuite, centrifugez le tube à 16 000 GS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez ensuite le surnageant dans un tube à centrifuger à fond rond propre de 50 millilitres et jetez la pastille.

Ajoutez du chlorure de sodium cristallin à l’échantillon pour induire la transition ELP. Une fois le sel dissous, la solution devient trouble, ce qui indique la séparation de phase de l’ELP de la solution. Ensuite, granulez l’ELP en centrifugeant l’échantillon à 16 000 GS pendant 10 minutes.

À température ambiante, la pastille ELP peut d’abord apparaître opaque, jeter le surnageant, puis ajouter un à cinq millilitres du tampon souhaité après refroidissement. La pastille ELP peut apparaître translucide et de couleur brune. Resus suspend le granulé en pipetant ou en faisant pivoter le tube à quatre degrés Celsius.

Ensuite, pipetez des aliquotes d’un millilitre de la solution ELP remise en suspension dans des microtubes à centrifuger propres de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes à 16 000 GS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez ensuite le surnageant dans un tube propre et jetez les granulés.

Induire la transition ELP avec l’ajout de chlorure de sodium. Si l’ELP a une température de transition élevée qui ne peut pas être induite avec du sel seul, incubez l’échantillon sur un bloc chauffant pendant 15 minutes à une température supérieure à la température de transition de l’ELP. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 16 000 GS pendant 10 minutes à une température supérieure à la température utilisée pour l’étape de transition ELP.

Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille ELP dans 500 à 750 microlitres du tampon souhaité en pipetant ou en tournant le tube à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que la pastille soit resolubilisée. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 16 000 GS pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler tous les contaminants insolubles. Transférez ensuite le snat dans un tube propre et jetez la pastille Répétez le cycle de transition inverse jusqu’à ce qu’aucune pastille contaminante ne soit observée.

Cela nécessite généralement deux à cinq cycles. Préparez une série de dilutions de solutions ELP dans du PBS ou un autre tampon souhaité. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre UV v à température contrôlée pour mesurer la densité optique à 350 nanomètres sur une plage de températures tout en chauffant l’échantillon à un taux d’un degré Celsius par minute.

Si aucune augmentation de la densité optique n’est observée, la température de transition peut dépasser la limite supérieure de température. Ensuite, mesurez la diminution de la densité optique sur la même plage de températures à une vitesse de refroidissement d’un degré Celsius par minute. Pour vérifier la réversibilité du graphique de transition ELP, la densité optique en fonction de la température, puis déterminer la température de transition de l’ELP homopolymère.

En identifiant le point d’inflexion sur ce profil de turbidité, la purification réussie des LP est confirmée par la page SDS comme on peut le voir ici. Le nombre de contaminants est beaucoup plus élevé dans le lysat initial d’E coli par rapport à l’échantillon après un cycle de transition inverse. La température de transition ELP est caractérisée par la turbidité programmée en température pour un homopolymère ELP.

Le profil de turbidité présente une seule augmentation brutale de la densité optique, qui définit la température de transition à une concentration donnée. La nature réversible de la transition ELP est confirmée par un balayage de turbidité de refroidissement. Les copolymères à bloc de matrice ELP présentent un profil de turbidité plus complexe que les LP homopolymères.

Des mesures dynamiques de diffusion de la lumière peuvent ensuite être prises pour confirmer le comportement de ces LP qui est déduit du fichier de profil de turbidité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier l’élastine recombinante comme les polypeptides d’E coli en utilisant le cycle de transition inverse. Non, non, non, non, non.