Production et purification des droits de INO80 remodelage de la chromatine Complexes et Subcomplexes

L'objectif de cette procédure est de produire et de purifier des versions sauvages et mutantes du complexe de remodelage de la chromatine multi-sous-unités ino80. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, l'isolement des noyaux à partir de cellules exprimant des protéines ino80 marquées par un épitope flag, puis la préparation d'extraits nucléaires. Ensuite, les complexes de remodelage de la chromatine humains de type sauvage ou mutés sont purifiés par chromatographie sur colonne anti-flag. Enfin, la composition en sous-unités des complexes ino80 purifiés peut être analysée par immunobuvardage (western blot) ou coloration argentique.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la manière dont les sous-unités des complexes de remodelage de la chromatine MultiPro contribuent à leur activité globale. Cette méthode est spécifiquement conçue pour l'étude de versions sauvages et mutantes du complexe de remodelage de la chromatine NO 80, mais elle peut également être utilisée pour étudier d'autres complexes nucléaires multiprotéiques, comme le médiateur.

La phase la plus critique de la procédure est l'extraction nucléaire. Les problèmes surviennent généralement lors de l'étape d'extraction saline, au cours de laquelle les personnes ont tendance à ajouter le sel trop rapidement ou trop vigoureusement. Après la culture en bouteilles roulantes, transférez les cellules HEC 2 9 3 dans un tube conique gradué de taille appropriée et centrifugez-les pendant 10 minutes à 1000 ×g et à 4 °C. Après avoir retiré le surnageant, mesurez le volume du culot cellulaire, puis remettez en suspension le culot dans un volume égal à cinq fois celui du culot en tampon A, à l’aide d’un pipetage doux, et incubez les cellules sur glace pendant exactement 10 minutes.

Après avoir à nouveau centrifugé les cellules, mesurez une deuxième fois le culot cellulaire, qui devrait avoir augmenté jusqu’à deux fois en taille. Cette fois, resuspendez les cellules dans un volume de tampon A équivalent à deux fois le volume du culot, puis transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur tissulaire de taille appropriée muni d’un pilon en verre mobile, et homogénéisez la suspension cellulaire jusqu’à ce que 90 % des cellules soient positivement colorées au bleu de trypan. Centrifugez ensuite les cellules homogénéisées dans un tube de centrifugeuse haute vitesse de 45 millilitres pendant 20 minutes à 25 000 ×g et à 4 degrés Celsius, dans un rotor à angle fixe. Puis retirez le surnageant contenant les protéines cytosoliques du culot nucléaire afin d’extraire les noyaux avec du sel.

Ajoutez maintenant 2,5 millilitres de tampon C pour chaque 3 millilitres de volume cellulaire compacté initial au culot. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, détachez le culot de la paroi du tube et transférez tout le mélange dans un homogénéisateur Dounce de taille appropriée. Homogénéisez le mélange avec deux mouvements d’un pilon lâche afin de resuspendre les noyaux, puis transférez la fraction nucléaire resuspendue dans un bécher prérefroidi d’une taille telle que la suspension remplisse le bécher d’au moins 0,5 centimètre de profondeur.

Ensuite, calculez le volume de chlorure de sodium à cinq molaire nécessaire pour amener la solution à une concentration finale de 0,42 molaire en chlorure de sodium selon la formule suivante. Ajoutez ensuite progressivement, goutte à goutte, le volume calculé de solution saline tout en agitant doucement la suspension avec une tige en verre sur de la glace afin d'augmenter progressivement la concentration en sel jusqu'à ce que tout le chlorure de sodium ait été ajouté et que la solution devienne très visqueuse. Transférez ensuite soigneusement la suspension visqueuse dans des tubes en polycarbonate de 70 millilitres équipés d'un bouchon, destinés à un rotor de type 45 TI, puis utilisez un agitateur rotatif pour faire osciller lentement les tubes scellés à quatre degrés Celsius. Après 30 minutes, ultracentrifugez les échantillons dans un rotor TI 45 pendant 30 minutes à 40 000 ×g et à quatre degrés Celsius, puis récupérez l'extrait nucléaire contenant les surnageants dans un seul récipient en plastique.

Ensuite, diviser la solution d'extrait nucléaire en aliquots de taille pratique, les congeler rapidement dans de l'azote liquide et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Pour préparer les billes Anti-Flag aros destinées à la purification immunoaffine, commencer par utiliser une pipette de 200 microlitres dont l'embout a été coupé pour transférer 200 microlitres d'une suspension de billes Anti-Flag aros à 50 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Transférer les billes préalablement lavées dans un tube conique contenant 10 millilitres d'extrait nucléaire récemment décongelé, puis incuber pendant plusieurs heures à quatre degrés Celsius avec une rotation lente sur un rotateur de laboratoire, et enfin recueillir les billes Flag aros par centrifugation pendant cinq minutes à 1000 fois G et à quatre degrés Celsius.

Ensuite, lavez l'extrait de billes P dans 10 millilitres de tampon lice 4 50 pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius avec un balancement doux sur un mutateur. Après avoir centrifugé le mélange d'extrait de billes, réutilisez-le à nouveau. Suspendez le culot dans 100 à 150 microlitres de lice 4 50 frais, puis transférez les billes dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre.

Continuer à rincer le tube conique de 15 millilitres avec des aliquotes de 100 à 150 microlitres de Lysol 50 jusqu'à ce que toutes les billes aient été transférées dans le tube de microcentrifugation. Après avoir centrifugé les billes dans une microcentrifugeuse, les laver trois fois avec un millilitre de lys quatre 50 et une fois avec un millilitre de EB 100.Buffer. Ensuite, pour éluer les protéines liées, ajouter 200 microlitres de tampon EB 100 contenant le peptide flag et incuber l'échantillon à quatre degrés Celsius sur un agitateur rotatif.

Après une demi-heure, faire tomber en sédiment les billes dans la microcentrifugeuse récupérée, puis transférer le surnageant contenant le complexe OAC C élué vers un nouveau tube de microcentrifugeuse. Après avoir répété l'élution quatre fois supplémentaires, faire passer l'éluat récupéré à travers une colonne de centrifugation vide afin d'éliminer toute trace résiduelle de billes Flag Aéro de la fraction protéique. Enfin, utiliser un dispositif de filtration ultra-centrifuge avec une coupure à 50 000 de poids moléculaire pour concentrer d'environ 10 fois la fraction protéique éluée.

Comme illustré sur cette figure, la pureté des complexes NO 80 préparés à l'aide des sous-unités marquées au flag indiquées, comme vient d'être démontré, peut être évaluée à l'aide de gels de polyacrylamide SDS colorés à l'argent. Toutes les protéines apparaissant sur cette voie témoin sont des contaminants qui se lient de façon non spécifique aux billes flag. Ces légendes indiquent les bandes correspondant aux sous-unités du complexe NO 80 testées, et celles-ci indiquent les mobilités des marqueurs de poids moléculaire.

La position du NO 80 de type sauvage est indiquée par le carré noir, et les positions des mutants du NO 80 sont indiquées par les cercles creux. Les bandes séparées par la ligne noire proviennent de gels distincts. La composition des complexes peut être évaluée par immunotransfert (Western blot) à l'aide d'anticorps dirigés contre diverses sous-unités du NO 80.

Par exemple. Les sous-unités du module du domaine terminal C, du module associé au centre hélicase et du module SNF2 ont été évaluées. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une journée, en commençant par la récolte des cellules et en terminant par la purification des complexes.

Cette technique permettra aux chercheurs de purifier des complexes multissous-unités et des sous-complexes à partir de cellules de mammifères afin d'étudier leurs fonctions. Après avoir visionné cette vidéo, vous aurez une meilleure compréhension de la purification des complexes protéiques impliqués dans le remodelage de la chromatine et d'autres complexes multissous-unités à partir de cellules humaines ou d'autres lignées cellulaires de mammifères.