Les dosages biochimiques pour l'analyse des activités de l'ATP-dépendant remodelage de la chromatine enzymes

L'objectif de la procédure suivante est de mesurer les différentes activités biochimiques des complexes de remodelage de la chromatine dépendants d'une TP. Cela est réalisé en mesurant le déplacement, dépendant d'une TP, d'un nucléosome positionné d'une extrémité d'une molécule d'ADN vers une position plus centrale sur l'ADN, à l'aide d'un test de migration en gel ou EMSA (essai de modification de la mobilité électrophorétique). Une méthode similaire fondée sur l'EMSA peut être utilisée pour suivre la formation de mononucléosomes liés au complexe de remodelage, afin d'évaluer l'activité de liaison au nucléosome des complexes de remodelage de la chromatine.

En outre, la chromatographie sur couche mince peut être utilisée pour mesurer l'activité des APA dans des complexes de remodelage de la chromatine dépendants de TP. En définitive, ces méthodes permettent de mesurer le remodelage de la chromatine dépendant de TP dans les complexes humains de O 80. Dans cette vidéo, nous démontrerons des tests biochimiques étudiant les complexes de remodelage de la chromatine de NO 80.

Une méthode similaire peut également être appliquée à l'étude d'autres complexes de remodelage de la chromatine afin d'effectuer un dosage de remodelage des nucléosomes dépendant de l'ATP. Préparez tout d'abord les substrats nucléosomiques après avoir mis en place une réaction PCR de 100 microlitres, comme indiqué dans le tableau. Réalisez les réactions PCR dans un thermocycleur, puis faites passer les produits réactionnels deux fois à travers des colonnes filtrantes sans nuclease afin d'éliminer les nucléotides non incorporés.

Ensuite, mélanger deux unités oléaires de fragments d'ADN marqués au P 32 6 0 1 avec six microgrammes de nucléosomes hilariaux dans 50 microlitres de tampon, puis incuber le mélange à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, diluer progressivement le mélange à 0,8 molaire, 0,6 molaire et 0,4 molaire en chlorure de sodium par addition respectivement de 12,5 microlitres, 20,8 microlitres et 41,6 microlitres de solution tampon tris HCl supplémentée en E-D-T-A-P-M-S-F et DTT, en incubant 30 minutes à 30 degrés Celsius après chaque addition, après la dernière incubation ajouter alors 125 puis 250 microlitres du tampon tris hydrochlorure. Poursuivre par deux autres dilutions supplémentaires de 30 minutes à 30 degrés Celsius, en complétant davantage le tampon avec du P 40 non ionique, du glycérol et de la PSA, pour atteindre respectivement des concentrations de 0,2 molaire et 0,1 molaire en chlorure de sodium.

Ensuite, conserver le substrat de mononucléosome à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à trois mois avant de préparer les dosages sur gels natifs de polyacrylamide. Ensuite, pour chaque réaction à effectuer, combiner environ 20 nanomolaires en OH 80 avec la quantité appropriée de tampon EB 100 suffisante pour obtenir un volume de 4,75 microlitres dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre silanisé prérefroidi. Recongeler immédiatement toutes les fractions restantes contenant NO 80, en poudre sèche sur de la glace sèche.

Ensuite, distribuez 5,25 µL de cocktail maître fraîchement préparé dans chaque tube de réaction, en mélangeant soigneusement par aspiration et expulsion répétées à l’aide d’une pipette. Incubez ensuite les réactions dans un bloc chauffant à 30 °C. À la fin de l'incubation, ajoutez 1,5 µL de mélange d’élimination fraîchement préparé dans chaque tube pour arrêter les réactions, puis mélangez chaque tube de réaction.

Centrifuger brièvement puis incuber à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes supplémentaires. Pendant ce temps, pré-électrophoréser le gel natif de polyacrylamide dans un appareil vertical d'électrophorèse à 100 volts pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, en utilisant 0,5 XTBE comme tampon de migration avec une barrette aimantée dans la chambre inférieure pour assurer une circulation constante du tampon. À la fin de l'incubation, remplacer le mélange par un nouveau mélange, puis ajouter 2,5 microlitres de colorant de charge à chaque réaction. Après une brève centrifugation, utiliser des pointes de charge pour déposer les échantillons sur le gel.

Faites migrer le gel à 200 volts pendant 4,5 heures à quatre degrés Celsius avec une circulation du tampon. Ensuite, transférez le gel sur une pile de deux feuilles de papier filtre et placez délicatement les filtres avec le gel par-dessus à l’aide d’un film plastique transparent pour détecter le signal. Exposez le gel à un écran de détection phosphorée à quatre degrés Celsius pendant la durée souhaitée, puis numérisez l’écran à l’aide d’un système de scanner d’imagerie isotopique et analysez les données en utilisant le logiciel approprié pour réaliser les tests APA dépendants de l’ADN et des nucléosomes.

Commencez par combiner de 10 à 50 nanomolaires de sous-complexes purifiés par immunoprécipitation avec une quantité suffisante de tampon eeb 100 pour obtenir un volume de 2,2 microlitres dans un tube micro-centrifuge de 1,5 millilitre préalablement refroidi et lubrifié, pour chaque réaction, puis recongelez immédiatement les fractions contenant NO 80 dans de la glace sèche pulvérisée. Ensuite, mélangez délicatement 2,8 microlitres de sous-cocktail fraîchement préparé contenant des nucléosomes d'ADN ou aucun des deux aux tubes de réaction contenant l'enzyme, à l’aide de pipetage ascendant et descendant, et transférez les tubes dans un bloc chauffant à 30 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un crayon pour tracer une ligne très légère à au moins 1,5 centimètre du bord inférieur d’un polyéthylène de 20 par 10.

J'entends par là une plaque de chromatographie sur couche mince ou plaque CCM. Déposez ensuite 0,5 microlitre de chaque mélange réactionnel sur la ligne aux temps de 5, 15, 30 et 60 minutes après incubation, en replaçant immédiatement chaque échantillon dans le bloc chauffant, afin de pouvoir prélever plusieurs points temporels à partir d'un seul tube. Après avoir appliqué le dernier échantillon, utilisez un sèche-cheveux pour sécher la plaque, puis transférez-la dans une chambre en verre contenant suffisamment.

0,375 molaire de phosphate de potassium afin que les 0,5 centimètres inférieurs de la plaque de CCM soient immergés dans la solution. Couvrez la chambre et laissez migrer la phase mobile jusqu'à ce que le front du liquide atteigne le haut de la plaque de CCM ; à ce moment-là, la plaque doit être immédiatement séchée à l'air et exposée à un écran phosphorescent de stockage à température ambiante. Enfin, analysez l'écran à l'aide d'un système de détection d'isotopes par imagerie pour déterminer la quantité de substrat radioactif a TP et de produit a DP.

Ce premier expérience démontre que le complexe purifié par l'intermédiaire du drapeau IES deux drapeaux, N-O-A-T-E et drapeau NO 80 delta N, présente des activités de glissement des nucléosomes similaires, indiquant que l'extrémité N-terminale de NO 80 et/ou ses sous-unités associées sont dispensables pour le remodelage des nucléosomes par le complexe NO 80. En revanche, le complexe purifié par le drapeau NO 80 delta n delta HSA est inactif dans ce test, ce qui indique que l'activité de remodelage dépend du domaine HSA des APAs de NO 80 et/ou de ses sous-unités associées. En utilisant une modification de la procédure du test de glissement des nucléosomes, on peut mesurer l'activité de liaison aux nucléosomes des complexes de remodelage de la chromatine.

Dans cette expérience, l'incubation des nucléosomes avec des quantités croissantes de complexes NO 80 intacts, purifiés via la sous-unité NO 80 E, a entraîné une disparition dépendante de la dose de la bande correspondant aux mononucléosomes libres et l'apparition d'une nouvelle espèce déplacée qui migrait près du haut du gel. En revanche, lorsque les nucléosomes ont été incubés avec des complexes plus petits, purifiés via NO 80 delta N et dépourvus d'un sous-ensemble de sous-unités NO 80, l'espèce déplacée a migré plus rapidement, suggérant que la mobilité relative de la bande surdéplacée dépend de la taille des complexes testés. Dans cette dernière expérience, les résultats d'un test comparant les activités APA activées par l'ADN et les nucléosomes de deux sous-complexes NO 80 différents sont présentés.

Les taches migrantes plus lentement correspondent à l'alpha 32 P marqué de départ, l'a TP, tandis que les espèces migrantes plus rapidement sont les produits de la réaction A DP, les zones indiquant la direction de la migration du solvant. Lors de l'utilisation de ces procédures, il est important de se rappeler d'effectuer des dosages variant par durée et contenant différentes concentrations d'enzyme. Cela garantira que les mesures sont prises lorsque les courbes de réponse produit en fonction du temps et de la dose sont linéaires.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser les activités de liaison aux nucléosomes et de glissement des nucléosomes par des complexes de remodelage de la chromatine purifiés. N'oubliez pas que le travail avec des matières radioactives peut être dangereux. Il convient de prendre des précautions telles que porter une blouse de laboratoire et des protections oculaires, surveiller la contamination radioactive et éliminer correctement les déchets radioactifs.