Name: Imagerie intracellulaire de Ca 2+ Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Apprenez l'imagerie du calcium intracellulaire dans les astrocytes striataux de souris adultes en utilisant des indicateurs génétiquement codés. Cette méthode par injection virale AAV permet d'étudier la signalisation calcique astrogliale in situ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

La majorité des travaux et le personnel impliqués ont été pris en charge par le NIH subvention NS060677 et en partie par les NIH accorde MH099559 et MH104069 (à BSK). Une partie du travail a également été soutenu par la Fondation CHDI.

Tous les protocoles d&#39;animaux étaient en conformité avec les Instituts nationaux américains de la santé Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à l&#39;UCLA. 1.1) Préparer Micropipette et AAV2 / 5 Virus de chargement <ol><li> Utilisation de fines micropipettes en verre borosilicaté pour l&#39;injection du virus. Tirez la micropipette en utilisant un programme de traction en deux étapes avec un extracteur vertical. Biseau la pipette à un angle de 40 ° en utilisant un broyeur de pipette. La pipette qui est idéal pour être utilisé aura un diamètre de pointe de 20 à 40 um et une longueur de tige de 6-7 mm. Autoclaver la pipette et instruments chirurgicaux. Le foret est stérilisée par essuyage avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Stocker le virus AAV2 / 5-GfaABC une D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), à -80 ° C dans des aliquotes de 10 pi. Juste avant la chirurgie, prendre les aliquotes du congélateur et stocker sur la glace jusqu&#39;à son utilisation pour le remplissage ee micropipette. </li><li> Remplir la micropipette avec le virus en utilisant une pompe à seringue. Relier hermétiquement une extrémité d&#39;un morceau de tuyau, à travers un tube de compression raccord de taille appropriée, d&#39;une seringue en verre avec un piston renforcé. Attacher la micropipette autoclave à l&#39;autre extrémité du morceau de tube par l&#39;intermédiaire d&#39;une compression de l&#39;aiguille de taille appropriée raccord amovible. </li><li> Avant de charger le vecteur viral, d&#39;éliminer les bulles d&#39;air du système de pompage comprenant un tube, seringue et micropipette par remplissage de l&#39;installation avec une huile minérale de couleur avec du Soudan IV rouge (~ 1 mg / 50 ml) dans une seringue de 1 ml avec une aiguille (27 G ). </li><li> Placez un morceau de parafilm propre sous la micropipette de verre, et distribuer 5 - 10 pi du vecteur viral sur le parafilm. </li><li> Sucer le vecteur viral en déplaçant le piston de la seringue vers l&#39;arrière à 0,5 pi / min, et marquer la limite entre le vecteur et l&#39;huile sur la pipette de verre. </li></ol> 1.2) Anesthésie, coupe de cheveux, HEAD fixation et préparation pour Craniotomy <ol><li> Mettre une souris (P49-63, C57BL / 6) dans la chambre rempli de N 2 O et O 2, et 5% d&#39;isoflurane. Évaluer la profondeur de l&#39;anesthésie par une perte de mouvement intentionnel et un rythme respiratoire ralenti (~ 60-90 / min). Couper les cheveux sur la tête quand la souris est anesthésiée. </li><li> Monter la souris dans le cadre stéréotaxique, avec sa tête fixé par des barres d&#39;oreille émoussées et son nez placés dans un système d&#39;anesthésie et de ventilation. Maintenir l&#39;isoflurane continu à 2 - 3%. Appliquer des larmes artificielles pommade pour les deux yeux puisque les souris perdent leur réflexe de clignement sous anesthésie. </li><li> Administrer 0,05 ml de buprénorphine (0,1 mg / ml) par injection sous-cutanée pour le soulagement de la douleur. </li><li> Zone chirurgicale pur avec 10% de povidone iode et 70% d&#39;alcool trois fois, en alternant entre les deux solutions de départ et avec de la povidone iode. Commencez par l&#39;avant et vers l&#39;arrière essuyer pour enlever les poils déjà coupées. </li><li> Faire une incision de la peau sur le dessus of la tête qui commence entre les yeux et se termine entre les oreilles. </li></ol> 1.3) Craniotomy et microinjections <ol><li> Retirez le périoste en balayant avec un coton-tige, puis sécher la surface du crâne avec des boules de coton dentaires. Faire une marque sur le site d&#39;injection, et percer sur le pourtour de la marque à l&#39;aide d&#39;une petite fraise en acier alimenté par un forage à grande vitesse. </li><li> Retirer l&#39;os et nettoyer la surface avec une solution saline. </li><li> Placez la pipette dans la dorsale latéral gauche striatum avec les coordonnées suivantes (mm): 0,8 antéro-postérieur, médio-latérale: 2,0, dorso-ventral de la surface piales: -2,4 13. A noter que ces coordonnées signifie que la pointe de l&#39;aiguille de micro-injection se trouve juste au-dessus du striatum dorso-latéral (figure 1A, B), ce qui signifie qu&#39;il ne pénètre légèrement à l&#39;intérieur de ce noyau. Évitez d&#39;endommager les vaisseaux sanguins. Si la pipette se trouve être à droite sur un vaisseau sanguin, légèrement ajuster lales coordonnées de ~ 0,1 à 0,2 mm. </li><li> Lancer injection avec un taux d&#39;injection fixée à 0,2 pi / min, et injecter 1 à 1,5 ul de virus. </li><li> Laisser la pipette en place après l&#39;injection pendant 10 min, puis retirer la pipette lentement. </li><li> Terminez par la fermeture de la plaie chirurgicale avec suture continue nylon externe suture. </li></ol> 1.4) Recouvrement <ol><li> Mettez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant pendant 24 heures. Ne retournez pas une souris qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. Ne laissez pas la souris sans surveillance tant qu&#39;il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. </li><li> Ajouter triméthoprime Sulfamethoxiazole (5 ml par 500 de l&#39;eau, contenant 40 mg de triméthoprime et 200 mg sulfamethoxiazole) dans l&#39;eau pendant une semaine. Administrer buprénorphine deux fois par jour pour un maximum de trois jours après la chirurgie. </li><li> Maintenir la souris sur un cycle lumière-obscurité de 12 h, nourris et abreuvés quotidiennement, une est pondéré une fois par jour jusqu&#39;à 3 jours après la chirurgie. Dans ces 3 jours, aucune souris avec une perte de plus de 10% du poids du corps est considérée comme compromise, et sera euthanasiée au lieu d&#39;être soumis à l&#39;expérimentation. </li><li> Par ailleurs, changer la cage de la souris deux fois par semaine, et de surveiller la santé générale au moins une fois par jour. En général, la souris est utilisé dans les 2 - 3 semaines après les micro-injections stéréotaxiques. </li></ol> 2. Trancher aiguë cerveau Préparation pour la Imaging confocale Ca 2.1) Préparation de coupe et Solutions d&#39;enregistrement. <ol><li> Préparer une solution comprenant (mM) de coupe: 194 saccharose, 30 NaCl, 4,5 KCl, 10 le D-glucose, 1 de MgCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 et NaHCO 3 26, saturé avec 95% O 2 et 5% CO 2. </li><li> Préparer la solution d&#39;enregistrement comprenant (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl2, 10 le D-glucose, 2 CaCl2, 1,2 NaH 2 PO 4 </sub&gt;, et 26 NaHCO 3; pH 7.3 à 7.4, de 290 à 295 mOsm, saturé avec 95% O 2 et 5% CO 2. Remplir le bécher tranche de cerveau tenue avec une solution d&#39;enregistrement, et les conserver à 34 ° C. </li></ol> 2.2) tranchage <ol><li> Deux à trois semaines après microinjections stéréotaxiques, profondément et terminale anesthésier la souris, puis décapiter. </li><li> Extraire le cerveau, et utiliser une lame pour enlever l&#39;hémisphère droit non injectée, et monter celle de gauche sur le plateau vibratome utilisant la super glue. Remplissez le bac à glace vibratome avec un tampon de coupe froid et gardez-le saturant avec 95% d&#39;O 2 et 5% de CO 2. </li><li> Couper les tranches de cerveau striatum coronale ou sagittale à 300 um d&#39;épaisseur. Habituellement, 4-5 coronaire, ou 6-7 tranches striatales sagittales peuvent être collectées. </li><li> Transférer les tranches dans le bécher de maintien de tranche réchauffé à 34 ° C, et de les y maintenir pendant 30 min avant de les stocker à température ambiante pendant recordi ultérieureng. </li><li> Incuber les tranches de cerveau dans du tampon d&#39;enregistrement oxygénée à la température ambiante pendant au moins 30 min avant de [Ca2 +] i imagerie. </li></ol> 3. L&#39;immunohistochimie (IHC) <ol><li> Deux semaines après l&#39;injection du virus, la souris perfuser transcardiaque avec du PBS suivi par 10% de formaline dans du PBS. </li><li> Retirer, post-fixer nuit, et cryoprotect le cerveau en tampon saccharose à 30% pendant au moins 2 jours. </li><li> Préparer 40 um sections à l&#39;aide d&#39;un microtome de cryostat. </li><li> Rincer les sections 3 fois avec du PBS à intervalle de 10 min. </li><li> Incuber les coupes pendant 1 h dans du PBS avec 10% de sérum de chèvre normal et avec 0,5% de Triton X-100. </li><li> Incuber les coupes pendant une nuit à 4 ° C dans l&#39;anticorps primaire préparée dans du PBS avec 0,5% de Triton X-100. Les anticorps primaires utilisés étaient les suivants: anti-GFP poulet 1: 1000, de souris anti-S100β 1: 400, de souris anti-NeuN 1: 600, de souris anti-glutamine synthétase 1: 300. </li><li> Rincer les sections 3 fois avec du PBS à 10 mdans les intervalles. </li><li> Incuber les coupes avec des anticorps secondaires préparées dans du PBS avec 10% de sérum de chèvre normal pendant 2 h à température ambiante. Les anticorps secondaires étaient les suivants: chèvre anti-souris Alexa546 1: 500, de chèvre anti-poulet Alexa488 1: 500. </li><li> Monter les coupes sur des lames de verre, sécher et appliquer quelques gouttes de antifade milieu de montage, puis couvrir lentement les sections avec une lamelle de verre. Conserver les lames à 4 ° C. </li><li> Prendre des images sur un microscope confocal avec un objectif à immersion dans l&#39;huile 40X avec une ouverture numérique de 1,3. </li></ol> 4. confocale [Ca 2+] i Imaging REMARQUE: [Ca2 +] i a été effectuée en utilisant l&#39;imagerie de microscope confocal avec un objectif 40X à immersion d&#39;eau avec une ouverture numérique de 0,8. <ol><li> Entre 1 et 5 h après la coupe, tranche lieu dans la chambre d&#39;enregistrement et superfuse avec le tampon d&#39;enregistrement oxygéné à température ambiante avec un débit de 1 - 2 ml parmin. Ensuite, placez une harpe de platine avec des cordes en nylon sur le dessus de la tranche pour minimiser le mouvement pendant l&#39;expérience. </li><li> Visualiser et localiser le striatum dorsal avec le champ lumineux luminescence sous un objectif à immersion d&#39;eau 10X. </li><li> Passez à l&#39;immersion dans l&#39;eau 40X objectif, et tourner sur la ligne 488 nm du laser Argon. En changeant le plan focal, trouver des cellules situées à environ 20 um sous la surface de la tranche, affichant fluorescence basale à Soma, branches et rameaux. Fait à noter, les cellules compromis affichent généralement le niveau de fluorescence dessus de la moyenne, qui devrait être évité. </li><li> Utilisez le mode «balayage d&#39;image» pour lancer la numérisation. En général, l&#39;intensité du laser ajusté à 0,5 à 5% de la puissance maximale est suffisante pour l&#39;image [Ca 2+] i par cyto-GCaMP3. Pour la surveillance de [Ca2 +] i dynamique dans l&#39;ensemble du territoire des astrocytes, le &#39;balayage d&#39;image »avec une vitesse de balayage de 1 s par châssis ou plus rapide est recommeDEMVSO, mais cela doit être décidé en fonction de l&#39;expérience en question. </li><li> Si nécessaire, à l&#39;image de [Ca 2+] i dans les processus, utiliser un grossissement numérique de 2 - 3 fois pour surveiller 1 - 2 astrocytes dans l&#39;ensemble du champ de vue. </li><li> Pour éviter pixels saturés pendant l&#39;enregistrement, utilisez le mode de recherche &#39;HiLo&#39; de pseudo-cellules. Toujours commencer par un &quot;enregistrement de pilote&quot; pendant environ 5 min, à tester si la couleur rouge apparaît comme indication de saturation. Si oui, plus la puissance de sortie de laser, ou abaisser le PMT / Gain / valeurs de décalage et d&#39;effectuer un autre enregistrement de pilote pour tester les valeurs de pixels sont dans la gamme non saturé. En règle générale, les paramètres combinés utilisés pour l&#39;imagerie des astrocytes [Ca 2+] i dans le striatum sont les suivantes: laser de puissance de sortie de 0,5 à 5% (de 10 mW), PMT 550 à 650 Volts, Gain 2.0 - 3.5x, et l&#39;offset 0 - 5%. </li></ol>

<ol><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li>
<li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology%3A+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li>
<li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li>
<li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272(2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. Waltham, MA. (2012).</li>
<li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262(2014).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li>
<li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus%3A+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li>
<li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+an+underappreciated+topic+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li>
<li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2%2F1%2C+rAAV2%2F2%2C+rAAV2%2F5%2C+and+rAAV2%2F8+transduction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à divulguer.

Les méthodes décrites ici nous ont permis d&#39;exprimer cyto-GCaMP3 dans les astrocytes du striatum in vivo pour la suite [Ca 2+] i imagerie in situ. Cette méthode a des avantages sur l&#39;aide transgénique ou souris knock-in, y compris l&#39;expression robuste de la protéine ciblée, la rapidité et la souplesse de mise en œuvre expérimentale et la spécificité anatomique. L&#39;expression de GCaMP3 utilisant VAA2 / 5 a été trouvé pour être plus précis et robuste. La combinaison d...

Les astrocytes sont des cellules gliales omniprésents et abondantes du cerveau. Il est bien établi que les astrocytes servent soutien vital et rôles homéostatiques y compris tampon de concentration de K + dans l&#39;espace extracellulaire, recaptage des neurotransmetteurs, ainsi que fournir des éléments nutritifs. Cependant, des études récentes montrent qu&#39;ils affichent aussi [Ca2 +] i signaux, qui se produisent spontanément et sont augmentés de l&#39;activité neuronale 1. L&#39;existence d&#39;astrocytes [Ca 2+] i la signalisation a été de plus en plus pensé à déclencher leur communication avec les neurones, et en tant que tel a été interprétée comme une forme de &quot;Ca 2+ excitabilité&quot; dans les astrocytes. Les données disponibles au cours des deux dernières décennies suggèrent deux contextes dans lesquels les astrocytes et les neurones peuvent communiquer, peut-être d&#39;une manière bidirectionnelle. Tout d&#39;abord, les astrocytes réagissent souvent avec une augmentation de la [Ca 2+] i lorsqu&#39;il est activé par les neurotransmetteurs etneuromodulateurs libérés par les neurones 2. Deuxièmement, [Ca 2+] i augmente dans les astrocytes provoquer la libération de molécules de signalisation des astrocytes qui peuvent à leur tour affecter les neurones et les vaisseaux sanguins. Les preuves suggèrent que les molécules libérées par les astrocytes conduisent à des changements dans les fonctions de synapses, les circuits et en fin de compte le comportement de signalisation par l&#39;intermédiaire de 3 à 5 astrocyte-à-neurone. Cependant, cela reste un domaine de recherche en plein développement, et il a été avancé que d&#39;une meilleure compréhension et détaillée des astrocytes [Ca 2+] i est nécessaire pour résoudre certaines des incertitudes actuelles 6. Dans le travail passé, il a été démontré que le chargement en vrac de Ca 2+ organiques colorants indicateurs dans les astrocytes ne parvient pas à détecter de manière fiable [Ca 2+] i signaux dans les astrocytes entiers de la culture et in situ 7-10. Ces résultats ont été discutés par nous et d&#39;autres 6,11,12. Le Emerging image est que [Ca 2+] i signaux au sein des processus d&#39;astrocytes (par exemple, les branches et rameaux), qui sont les premiers sites d&#39;interactions avec les neurones et les vaisseaux sanguins, ont rarement été étudiée en détail. Récemment, l&#39;utilisation d&#39;indicateurs de calcium génétiquement codées (GeCIS) comme GCaMP3 cytosolique, GCaMP5G et GCaMP6 et membrane plasmique versions captif (par exemple, Lck-GCaMP3) a permis l&#39;étude de [Ca 2+] i signaux dans de petits compartiments de astrocytes ces processus minces, près de la membrane plasmique et dans des territoires entiers 7,8. Cependant, GeCIS ont un inconvénient plus organiques Ca 2+ colorants indicateurs et qui est l&#39;exigence des méthodes génétiques pour livrer les gènes codant sélective pour les astrocytes in vivo pour des périodes de plusieurs semaines pour la GeCIS être appropriée exprimé. Expression in vivo est généralement réalisé en utilisant des souris transgéniques, souris knock-in ou par le virus basé livraison appcafards. Dans l&#39;article présent JoVE nous présentons les méthodes et procédures utilisées pour fournir GeCIS à astrocytes striataux utilisant des virus adéno-associés. Nous nous concentrons sur cyto-GCaMP3 comme un exemple, mais la même procédure de base fonctionne pour tout autre GECI ou fluorescent reporter à base de protéines.

<table><tbody><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Harvard Apparatus</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Broyeur de micropipettes</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>un plasmide envoyé vers UPenn Vector Core pour l’emballage des virus</td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de seringue</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>virus AAV2/5</td><td>Noyau de vecteur UPenn</td><td></td> NA <td></td></tr><tr><td>Soudan rouge IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>CVS Pharmacie</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Instrument stéréotaxique</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>Kit de micromoteur rotatif à grande vitesse</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Santa cruz biotechnologie</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Krazy&reg ; Colle</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Microslicer</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopes confocaux</td><td>Olympus</td><td>FV300 et FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Vecteur</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>poulet anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>souris anti-s100&beta ;</td><td>Souris Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>souris anti-glutamine synthétase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-souris-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-poulet-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Montage Moyen</td><td>Vecteur</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie intracellulaire de ca 2+ signaux dans striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Les astrocytes présentent des fluctuations spontanées de concentration intracellulaire en Ca2+ ([Ca2+]i) et, dans plusieurs contextes, répondent à l’excitation neuronale par des signaux [Ca2+]i améliorés. Il a été proposé que les astrocytes régulent à leur tour les neurones et les vaisseaux sanguins par des mécanismes dépendants du calcium, tels que la libération de molécules de signalisation. Cependant, l’imagerie [Ca2+]i dans des astrocytes entiers n’est devenue possible que récemment avec des indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) tels que la série GCaMP. L’utilisation des GECI dans les astrocytes offre maintenant la possibilité d’étudier en détail les signaux astrocytaires [Ca2+]i dans des microcircuits modèles tels que le striatum, qui est le plus grand noyau des ganglions de la base. Dans le présent rapport, des méthodes chirurgicales détaillées pour exprimer les GECI dans les astrocytes in vivo, et des approches d’imagerie confocale pour enregistrer les signaux [Ca2+]i dans les astrocytes striataux in situ, sont décrites. Nous soulignons les précautions, les contrôles nécessaires et les tests pour déterminer si l’expression de GECI est sélective pour les astrocytes et pour évaluer les signes de réactivité manifeste des astrocytes. Nous décrivons également en détail les conditions de coupe de cerveau et d’imagerie qui permettent une imagerie fiable [Ca2+]i dans les astrocytes striataux in situ. L’utilisation de ces approches a révélé l’ensemble des territoires d’astrocytes striataux uniques et de signaux spontanés [Ca2+]i à l’intérieur de leurs somatas, branches et rameaux. L’utilisation et l’expansion ultérieures de ces approches dans le striatum permettront l’étude détaillée des signaux astrocytaires [Ca2+]i dans les microcircuits du striatum.

Pour les astrocytes expression spécifique de cyto-GCaMP3 dans le striatum, nous avons utilisé un virus adéno-associé (AAV) du 5 serotype, et la GFAP GfaABC 1 promoteur de D (figure 1A), qui a été précédemment montré pour conduire GCaMP3 robuste et gène rapporteur expression dans l'hippocampe et les astrocytes corticaux 8,14. Deux semaines après le virus de la micro-injection dans le striatum de souris, la souris (~ 10 semaines) a été perfusée et IHC a été réalisée sur des coupes de...

Les propriétés et les fonctions des signaux intracellulaires Ca2+ des astrocytes dans le striatum restent incomplètement explorées. Nous décrivons des méthodes pour exprimer des indicateurs calciques génétiquement codés dans les astrocytes striataux à l’aide de virus adéno-associés de sérotype 2/5 (AAV2/5), ainsi que des procédures pour imager de manière fiable les signaux Ca2+ dans les astrocytes striataux in situ.

Imagerie intracellulaire de Ca 2+ Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

L’objectif global de cette procédure est d’imager les signaux calciques intracellulaires dans les astrocytes stri AAL de souris adultes à l’aide d’indicateurs calciques génétiquement codés tels que cyto G CAMP trois. Pour ce faire, le virus est d’abord injecté dans le striatum de souris. Ensuite, la souris est laissée récupérer pendant deux à trois semaines après l’opération.Ensuite, la souris est sacrifiée et des coupes de cerveau aiguës sont préparées. La dernière étape consiste à effectuer une imagerie calcique confocale des tranches de cerveau. En fin de compte, la chimie immunohisto est utilisée pour montrer que le Cyto G Camp trois n’est exprimé que dans les astrocytes mais pas dans les neurones, et que l’injection du virus n’a pas provoqué de réactivité manifeste des astrocytes.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le transgénique ou le nochi M, est qu’elle permet une expression robuste de la protéine cible et une mise en œuvre expérimentale rapide et flexible. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation calcique des ostéocytes, telles que la façon de mesurer de manière fiable

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Nous décrivons comment mesurer près de la membrane et la dynamique globale du calcium intracellulaire dans les astrocytes cultivés en utilisant la réflexion interne totale et de la microscopie à épifluorescence.

Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

Une méthode pour charger des sous-ventriculaire (SVZ zone) des cellules avec des colorants indicateurs de calcium pour l'activité de calcium enregistrement est décrit. Le postnatale SVZ contient des cellules serrées y compris les cellules progénitrices neurales et neuroblastes. Plutôt que d'utiliser le chargement de bain nous avons injecté le colorant par la pression à l'intérieur du tissu permettant une meilleure diffusion du colorant.

Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l&#39;imagerie calcique

Source : Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)La vidéo fait la démonstration de l’imagerie par fluorescence pour observer la dynamique calcique spontanée spécifique du compartiment dans les astrocytes en surveillant séquentiellement les protéines sensibles au calcium localisées sur la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique.

Imagerie calcique spontanée pour la dynamique spécifique des compartiments dans les astrocytes

Nous décrivons ici une adaptation des protocoles utilisés pour induire la plasticité homéostatique dans les neurones de l'étude de la plasticité des G récepteurs couplés à la protéine astrocytaires. Récemment utilisé pour examiner les changements dans le groupe I mGluR astrocytes chez les souris jeunes, la méthode peut être appliquée pour mesurer l'échelle des différents RCPG astrocytaires, dans les tissus de souris adultes in situ et in vivo, et d'avoir une meilleure appréciation de la...

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Nous présentons ici un protocole au calcium image de signalisation dans les populations de types de cellules individuelles à la jonction neuromusculaire murine.

Ex Vivo Imagerie du Calcium cellulaire spécifique de signalisation à la Synapse Tripartite du diaphragme souris

Ca2 + indicateurs génétiquement encodés (GECIs) ont radicalement changé comment in situ Ca2 + imagerie est réalisée. Pour optimiser la récupération de données de ces enregistrements, il faut une analyse appropriée des signaux de Ca2 + . Les protocoles dans le présent document facilitent la quantification de Ca2 + des signaux enregistrés sur place à l’aide de la cartographie spatio-temporelle et analyse axée sur les particules.

Applications de cartographie spatio-temporelle et Techniques d’analyse des particules pour quantifier la signalisation intracellulaire Ca2 + In Situ

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones.

Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

Le présent protocole décrit la fabrication d’une grande fenêtre crânienne (6 x 3 mm2) à l’aide d’une pellicule alimentaire, de silicone transparent et de verre de couverture. Cette fenêtre crânienne permet des expériences in vivo d’imagerie calcique à grand champ et à deux photons chez la même souris.

In vivo Imagerie calcique à grand champ et à deux photons d’une souris utilisant une grande fenêtre crânienne

Ce protocole décrit l’exposition chirurgicale du ganglion radiculaire dorsal (DRG) suivi de GCaMP3 (indicateur Ca2+ codé génétiquement; Protéine fluorescente verte-calmoduline-protéine M13 3) Imagerie Ca2+ des ensembles neuronaux à l’aide de souris Pirt-GCaMP3 tout en appliquant une variété de stimuli à la patte postérieure ipsilatérale.

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Ce protocole décrit l’imagerie calcique GCaMP in vivo de neurones intacts du ganglion du trijumeau (TG). Cette description comprend la chirurgie d’exposition aux TG, l’imagerie par microscopie confocale in vivo des neurones TG, l’application de stimuli somatiques pendant l’imagerie microscopique des neurones TG et l’analyse des données d’imagerie calcique GCaMP in vivo .

In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions du trijumeau intacts

Ce protocole fournit une description complète d’une méthode permettant l’enregistrement simultané des signaux calciques provenant des neurones et des astrocytes à travers plusieurs régions cérébrales liées à la mémoire et démontre son application dans un paradigme d’apprentissage et de comportement mémoire.

Une méthode de photométrie à fibres bicolores pour enregistrer l’activité astrocyte-neurone dans plusieurs régions cérébrales lors de l’apprentissage et des comportements de mémoire

Apprenez l'imagerie du calcium intracellulaire dans les astrocytes striataux de souris adultes en utilisant des indicateurs génétiquement codés. Cette méthode par injection virale AAV permet d'étudier la signalisation calcique astrogliale in situ.

Imagerie intracellulaire de Ca 2+ Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie intracellulaire de Ca²⁺ Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Explorer plus de vidéos