Name: Un Guide to Modern quantitative fluorescente Western blot avec des stratégies de dépannage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Apprenez le Western blot fluorescent quantitatif pour détecter et quantifier précisément les protéines dans divers échantillons biologiques. Cette méthode améliore la sensibilité et la linéarité par rapport aux techniques ECL traditionnelles.

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Nous tenons à remercier pour le soutien financier qui suit: BBSRC Institut stratégique de financement des programmes - CF &amp; TMW; Financement BBSRC Est Bio DTP - LG; Le Darwin Trust of Edinburgh - MLH. Nous tenons également à remercier le Dr Barry McColl pour permission d&#39;inclure l&#39;optimisation TREM2 dans ce manuscrit.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une attention particulière et de la planification est essentielle avant toute expérience et peuvent en fin de compte déterminer le succès de la technique utilisée. Les progrès dans la détection de la protéine à l&#39;aide de la Banque mondiale peut présenter une pléthore d&#39;obstacles potentiels en essayant de choisir les anticorps, de transfert et de visualisation des méthodes appropriées à utiliser. Heureusement, en utilisant une liste de contrôle attentif et des mesures de contrôle appropriées QFWB peut être utilisée en routine pour déterminer la présence de la protéine et des différences d&#39;expression de plus en plus subtiles entre les échantillons. Ce protocole fournit un guide complet fluorescent western blot quantitatif ainsi que quelques stratégies de dépannage pour éviter et / ou de surmonter quelques-uns des nombreux écueils les plus courants associés. Les étapes essentielles utilisées pour maintenir la sensibilité et obtenir vraiment des mesures quantifiables et comparables comprennent: 1) l&#39;extraction des protéines robuste à partir d&#39;échantillons de tissus; 2) la préparation des échantillons; 3) précise loadin de protéinesg déterminée par l&#39;analyse des protéines totales; 4) un transfert optimal de protéines en utilisant I-Blot; 5) la préparation d&#39;anticorps primaires et secondaires dans le tampon de blocage contenant 0,1% de Tween 20, et 6) visualisation correcte et analyse à l&#39;aide d&#39;un imageur infrarouge et les logiciels associés. Détection fluorescente infrarouge est vraiment quantitative et offre une plus grande sensibilité par rapport à d&#39;autres techniques de détection ECL traditionnelles 3,11. Ce système de détection est à plusieurs facettes, et en tant que tel ne se limite pas à QFWB. Ce système est capable de formation d&#39;image de marquage immunohistochimique à faible puissance permettant la visualisation et la quantification des coupes de tissus entiers 12. Ceci est une zone de développement potentiel futur en termes de résolution qui pourrait voir l&#39;imagerie rouge lointain rivalisant avec capture d&#39;immunofluorescence conventionnelle avec des microscopes conventionnels en termes d&#39;évaluation quantitative. Cependant, avec une plus grande sensibilité à des changements subtils dans protein expression, il est essentiel de veiller à la variabilité est réduite au minimum et les mesures de contrôle sont strictes avec des protocoles robustes. Cela commence avec l&#39;extraction des protéines rigoureuse de l&#39;échantillon de tissu suivie par la production de protéines colorées au total gels à fournir l&#39;assurance que le chargement des échantillons est uniforme, optimisation des anticorps primaires et secondaires afin de déterminer si la détection est réel et tester les directives du fabricant en ce qui concerne le transfert fois pour obtenir le transfert de la protéine efficace. Néanmoins, même lorsque les conditions de la Banque mondiale sont optimisés, il peut y avoir encore des problèmes associés à la gestion des westerns qui peuvent ne pas avoir été pleinement explorées ici. Ceux-ci comprennent, sans s&#39;y limiter, les facteurs, y compris la solubilisation de la protéine et le choix de tampon d&#39;extraction. Des tampons peuvent interférer avec des dosages de la concentration de protéine, et certains tissus sont particulièrement difficiles à solubiliser, ce qui nécessite des techniques plus robustes telles que l&#39;utilisation de macération automatiséTing emballage étanche, tel que M TUBES ensemble avec un dissociateur Mac. En outre, des mesures de contrôle simples pour le stockage de la matière extraite et non extraite à -80 ° C peuvent faire la différence entre l&#39;obtention d&#39;étiquetage optimale immédiatement après l&#39;extraction et ayant pauvres résultats semaines plus tard. Méthodes de QFWB modernes se sont révélés être plus sensible pour capturer des différences subtiles dans l&#39;expression des protéines et permettent aux plus polyvalent simultanée double étiquetage 3 par rapport aux techniques plus anciennes comme ECL. Il est essentiel que les protocoles de transfert de Western sont robustes et facilement reproductible pour la quantification précise et l&#39;analyse statistique. Ce protocole est sensible et suffisamment robuste pour être utilisée en routine pour la détection de protéines à travers une série d&#39;échantillons de tissus et d&#39;espèces différentes et 3 permet la quantification des protéines de faible abondance et élevés à l&#39;intérieur de la même QFWB réduisant par conséquent l&#39;utilisation des consommables ainsi que le temps pour l&#39;expérience 1. 1 En outre, la sensibilité accrue de cette technique permet la validation de plus en plus populaire - études omiques 9,14 Cependant, l&#39;exactitude est cruciale et l&#39;inclusion de mesures de contrôle appropriées doivent être respectées évitant ainsi l&#39;acquisition de données erronées.

Western Blot (WB) est une technique d&#39;analyse développé à l&#39;origine dans les années 1970 pour déterminer la présence ou l&#39;absence d&#39;une protéine d&#39;intérêt dans un échantillon biologique complexe, comme un homogénat de tissu 1. Communément dénommé immunoblot des protéines, en raison de la clé interaction anticorps-antigène, la méthode consiste en cinq étapes distinctes: 1) la séparation électrophorétique des protéines par leur point isoélectrique; 2) le transfert à une nitrocellulose ou polyfluorure de vinylidène (PVDF); 3) le marquage en utilisant un anticorps primaire spécifique à la protéine d&#39;intérêt; 4) incubation avec un anticorps secondaire dirigé contre l&#39;anticorps primaire; et 5) la visualisation. méthodologie de visualisation a évolué avec le temps pour améliorer la sécurité et de la sensibilité. Certains des premiers Western Blots ont été réalisées en utilisant la radio balises marquées qui ensuite évolué vers les chemilluminescent plus largement utilisé (ECL) des méthodes colorimétriques et puis. Radioactivity a été marqué directement sur ​​les sondes pour des antigènes spécifiques alors que les méthodes colorimétriques et ECL utilisent une technique de marquage indirect avec un rapporteur enzymatique tel que la peroxydase de phosphatase alcaline ou de la streptavidine de raifort (HRP) 2. L&#39;intensité de l&#39;étiquetage du produit luminescent ou chromogène est mesurée en utilisant la densitométrie par lequel la force du signal, fort ou faible, plus ou moins indique la présence de la protéine d&#39;intérêt dans l&#39;échantillon. ECL est la méthode plus sensible et donc favorisée mais toutes les deux trois méthodes ont été initialement mis au point sur ​​le film à rayons X avec des techniques d&#39;imagerie numérique plus sophistiqué ensuite établies 3. L&#39;avancement de l&#39;imagerie numérique de WB a non seulement permis à un chercheur de déterminer la présence ou l&#39;absence de leur protéine d&#39;intérêt, mais a également permis une déduction au niveau de l&#39;expression d&#39;une protéine choisie lorsqu&#39;on les compare aux autres échantillons et peut donc être considéré comme «semi-quantitative &amp; #8221 ;. Récemment, une technique de transfert de Western véritablement quantitative et plus sensibles ont été mis au point de sorte que le niveau de fluorescence mesurée est directement liée à la quantité et à l&#39;expression d&#39;une protéine unique dans un échantillon: quantitatif fluorescent western blot (QFWB). Lorsque l&#39;on compare avec l&#39;étiquetage QFWB ECL, l&#39;utilisation d&#39;un anticorps secondaire fluorescent génère un profil de détection linéaire 4. Ceci est en contraste avec les techniques ECL où la linéarité du signal se produit généralement avec des charges faibles en protéines est inférieure à 5 ug et la saturation de signal directement liés à l&#39;expression des protéines, à savoir, avec des gènes domestiques exprimés de manière ubiquitaire 5,6. Cette disparité est très probablement dû à un plus grand nombre de sites de liaison disponibles pour un substrat ECL avidine à se lier à un secondaire biotinylé, ce qui entraîne un risque plus élevé de potentiel de saturation du signal. Ceci est l&#39;une des principales raisons de la base ECL immuno étant désignées comme étant ONLy &quot;semi-quantitative» 7. Le point de signal de saturation est d&#39;une importance critique pour la mesure des différences subtiles dans les niveaux d&#39;expression et peut conduire à des mesures inexactes. Au cours des dernières années, l&#39;avènement des techniques protéomiques répandues détaillant de plus en plus la sensibilité et l&#39;identification des différences d&#39;expression subtiles a entraîné une dépendance croissante sur vraiment quantitative Western blot pour des expériences de validation 8,9. L&#39;application de la méthodologie sensible, dynamique et véritablement quantitative est donc crucial. Beaucoup de &quot;optimisés&quot; méthodes de transfert de Western ont été utilisés par des laboratoires indépendants, qui se révèlent souvent difficiles à mettre en place ou de reproduire en raison d&#39;ajustements méthodologiques subtils qui peuvent ne pas être dans les protocoles officiels et documentés. Ceci est un protocole établi et robuste pour QFWB et fournit des stratégies utiles pour la résolution des problèmes communs tha plust peut survenir au cours de la mise en œuvre. Ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec des homogénats de cerveau de souris, mais a depuis été utilisé efficacement dans un large éventail d&#39;échantillons de tissus et les espèces 4,9,10. Variations de protocole de potentiel nécessaires pour résoudre les problèmes spécifiques sont inclus.

<table><tbody><tr><td>Tampon RIPA</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M Tubes</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Pile de transfert iBlot, PVDF Regular</td><td>Life Technologies, Royaume-Uni</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5602</td><td>Utilisation dans le gel 1 pour le Western blot</td></tr><tr><td>SeeBlue Norme de protéines pré-colorées</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5625&nbsp ;</td><td>Utilisation dans le gel 2 Gel coloré aux protéines totales</td></tr><tr><td>Tampon d’échantillonnage NuPAge LDS 4x</td><td>Life Technologies, Royaume-Uni</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de fonctionnement NuPAGE MES SDS (pour gels Bis-Tris uniquement) (20x)</td><td>Life Technologies, Royaume-Uni</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12 % Bis-Tris Gel 1,0 mm, 12 puits</td><td>Life Technologies, Royaume-Uni</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Comprimé salin tamponné au phosphate</td><td>Sigma-Aldrich,</td><td>Royaume-Uni P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA, Kit de dosage des protéines</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>tampon bloquant Odyssey</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P/N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG anti-lapin de chèvre (H+L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD IgG anti-souris d’âne (H+L), 0,5 mg ;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW IgG anti-Lapin Chèvre (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Âne IgG anti-Chèvre (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL Imageur infrarouge</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Appel à devis</td></tr><tr><td>iBlot 7-Minute Blot System</td><td>Life technologies, Royaume-Uni</td><td></td><td>Ce modèle n’est plus en production</td></tr><tr><td>InstantBlue Protein</td><td>stain Expedeon, UK</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot western blot stripping buffer&nbsp ;</td><td>Rockland Immunochemicals Inc.</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

un guide to modern quantitative fluorescente western blot avec des stratégies de dépannage

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

La fin des années 1970 ont vu la première utilisation déclarée publiquement du western blot, une technique pour évaluer la présence et l&#39;abondance relative des protéines spécifiques dans des échantillons biologiques complexes. Depuis lors, la méthodologie western blot est devenue un élément commun de la biologie moléculaire répertoire expérimental. Une recherche rapide de PubMed en utilisant le terme &quot;western blot&quot; suggère que plus de 220 000 manuscrits publiés ont fait usage de cette technique d&#39;ici l&#39;an 2014. Surtout, les dix dernières années ont vu des avancées d&#39;imagerie techniques couplées avec le développement marqueurs fluorescents de sensibles qui ont permis d&#39;améliorer la sensibilité et a donné encore plus de plages de détection linéaire. Le résultat est une fluorescence maintenant vraiment quantifiable fondé Western Blot (QFWB) qui permet aux biologistes d&#39;effectuer une analyse comparative de l&#39;expression avec une plus grande sensibilité et de précision que jamais auparavant. Beaucoup de &quot;optimisé&quot; western blotméthodes existent et sont utilisées dans différents laboratoires. Ceux-ci se révèlent souvent difficiles à mettre en œuvre en raison de l&#39;exigence de modifications procédurales subtiles mais sans papiers. Ce protocole fournit une description complète de la méthode d&#39;QFWB établi et robuste, avec des stratégies de résolution des problèmes.

Comme la sensibilité à QFWB et la plage linéaire de détection est supérieure à la détection ECL classique, il ya un certain nombre de mesures de contrôle qui sont essentiels pour assurer l&#39;exactitude des données sont collectées, facilitant ainsi l&#39;interprétation efficace. Tout d&#39;abord, l&#39;inclusion des échantillons témoins positifs comme représenté sur la figure 1. D&#39;autre part, l&#39;optimisation du transfert de garantir un mouvement équivalent de protéines de haut et de bas poids moléculaire à partir du gel à la membrane comme présenté dans la figure 2. En troisième lieu, l&#39;optimisation d&#39;anticorps, en particulier secondaire des anticorps dont l&#39;optimisation est souvent négligé, mais qui peuvent produire non spécifique bandes capables d&#39;interférer avec l&#39;interprétation correcte de la protéine (s) d&#39;intérêt. Voir Figure 3. Quatrièmement, il peut aussi être le cas que quand une protéine apparaît indétectable mais devrait être présente, cela peut aussi être une question d&#39;anticorps secondaire qui peut être corrigé en utilisant simplement un raïs secondairesed dans un hôte de différentes espèces. Voir figure 4. Cinquièmement, l&#39;étiquetage de la protéine totale et l&#39;analyse est une méthode beaucoup plus robuste et quantifiable par rapport à l&#39;utilisation unique de protéine traditionnel (s) qui sont exprimés de façon ubiquitaire à des étalons de référence internes 3. Beaucoup de ces protéines simples ont été trouvés à être exprimés de manière différentielle dans des modèles de maladies neurodégénératives, ainsi qu&#39;entre les échantillons de tissus différents et l&#39;uniformité d&#39;expression peut modifier dans le même tissu 3. Par conséquent, la production d&#39;un gel de commande de charge confirme l&#39;uniformité de la charge de l&#39;échantillon lorsqu&#39;il est combiné avec une analyse des protéines totales par la comparaison et la quantification de la charge de protéine dans chaque ligne à différentes gammes de poids moléculaires mesurés par rapport à chaque échantillon pour indiquer l&#39;erreur standard comme le montre la figure 6 . Fait important, l&#39;ensemble de ces techniques et des contrôles de dépannage ne sont efficaces que la sensibilité et la cohérence de l&#39;analyse tutils appliquées par l&#39;opérateur (figure 5). Enfin cette technique se prête bien à l&#39;arrachement et re-sondage de membranes avec plus de souplesse que ECL en raison de facteurs y compris, mais sans s&#39;y limiter, une sensibilité accrue, de fond réduit, la détection de double couleur et la stabilité de la membrane dans des conditions de stockage à long terme. Voir la Figure 7.

L’avancement du western blot à l’aide de la fluorescence a permis de détecter des changements subtils dans l’expression des protéines, permettant des analyses quantitatives. Nous décrivons ici une méthodologie robuste pour la détection d’une gamme de protéines à travers une variété d’espèces et de types de tissus. Une stratégie pour surmonter les problèmes techniques courants est également fournie.

Un Guide to Modern quantitative fluorescente Western blot avec des stratégies de dépannage

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

L’objectif de cette procédure est de détecter et de quantifier avec précision l’abondance relative de protéines spécifiques dans un échantillon biologique complexe à l’aide d’une torsion et d’un transfert quantitatifs, fluorescents. Ceci est accompli en séparant d’abord électro-fluorescent les extraits de protéines à l’aide d’un gel à gradient préfabriqué. Dans la deuxième étape, la charge protéique équivalente est vérifiée sur toutes les voies d’échantillonnage par l’application d’une coloration protéique totale, puis le système de transfert rapide semi-sec par bloc oculaire est utilisé pour transférer les échantillons sur la membrane A-P-V-D-F.Enfin, les protéines sont sondées avec des anticorps primaires spécifiques suivis de l’anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence pour faciliter leur détection sensible, robuste et linéaire dans les longueurs d’onde infrarouges et rouges lointaines. En fin de compte, la floraison occidentale fluorescente quantitative peut être utilisée pour détecter, visualiser et quantifier avec précision un grand nombre de protéines membranaires et solubles dans une large gamme d’échantillons de tissus. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’imagerie basée sur l’ECL est qu’elle permet une plus grande sensibilité avec une précision accrue sur une large échelle linéaire pour une lecture véritablement quantitative. Commencez par faire macérer manuellement l’échantillon de tissu, puis homogénéisez-le dans un tampon d’extraction fraîchement préparé à environ un à 10 poids de tissu par volume de tampon jusqu’à ce qu’un homogénat lisse et cohérent soit produit.Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire pendant 20 minutes à 20 000 fois G à quatre degrés Celsius. Transférez ensuite le sate contenant les protéines solubilisées dans un microtube à centrifuger propre et stockez les fractions granulées et surnageantes S à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Après avoir déterminé la concentration en protéines du supinate, transférez 15 microgrammes de protéines par échantillon dans de nouveaux microtubes à centrifuger.Portez ensuite le volume final de chaque échantillon jusqu’à 10 microlitres avec de l’eau distillée et ajoutez cinq microlitres de tampon de chargement Forex. Agitez soigneusement les solutions cellulaires par vortex, puis chauffez les échantillons à 98 degrés Celsius pendant deux minutes pour dénaturer les protéines. Après la dénaturation, ajouter trois microlitres d’un étalon de poids moléculaire approprié dans le premier puits de chacun des gels expérimentaux et de contrôle de charge.Ensuite, chargez 10 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés après l’électrophorèse. À l’aide d’un couteau à gel, libérez les gels de la cassette et retirez les puits et le pied du gel. Marquez le gel pour faciliter l’orientation ultérieure.Ensuite, pour déterminer la charge protéique équivalente, décantez environ 30 millilitres de coloration protéique dans une boîte de Pétri carrée de 12 x 12 centimètres et placez le gel de contrôle de charge dans la coloration, en veillant à ce que la solution recouvre tout le gel. Agitez doucement le gel pendant au moins une heure à température ambiante, puis jetez la coloration protéique et lavez le gel trois fois dans de l’eau distillée avant de visualiser le bloc oculaire. Après l’électrophorèse, préparez la pile de transfert inférieure en retirant le couvercle de la feuille et en prémouillant la membrane avec un tampon directement à partir du réservoir de gel.Mouillez à nouveau le papier filtre avec de l’eau distillée à ce moment-là également. Ensuite, lavez le gel expérimental sur la pile de transfert inférieure préparée, puis posez le papier filtre de pré-travail sur le gel et roulez-les tous les deux pour vous assurer qu’aucune bulle n’est piégée entre les couches. Posez la pile supérieure sur le papier filtre et la pile inférieure.Roulez ensuite le sandwich de la pile de transfert pour éliminer les bulles d’air. Insérez l’éponge du kit de pile de transfert dans le tampon absorbant et placez le sandwich de pile de transfert dans l’espace dédié. Ensuite, fermez bien le couvercle et démarrez le bloc I deux, en transférant les protéines pendant sept minutes sur le programme trois.Lorsque le programme est terminé, retirez la pile de transfert de la machine à blocs oculaires et décollez la pile de transfert supérieure et les couches de papier filtre exposant le gel sur la pile de transfert inférieure. Utilisez un scalpel pour couper autour du gel en prenant soin de faire une coupe triangulaire à des fins d’orientation sur la membrane après la coupe de la membrane pour vérifier l’efficacité du transfert, la coloration des protéines, le gel comme nous venons de le démontrer, puis déplacez rapidement la membrane dans un tube propre de 50 millilitres contenant cinq millilitres de PBS pour le premier des trois, Lavages de cinq minutes sur un rouleau mécanique. Après le troisième lavage, jetez le tampon de lavage et incubez la membrane dans un tampon de blocage non dilué pendant au moins 30 minutes à température ambiante.Ensuite, incubez la membrane dans un anticorps primaire dilué dans cinq millilitres de tampon bloquant et 0,1 entre 20 pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec une agitation constante. Le lendemain matin, après avoir jeté la solution d’anticorps primaires, lavez la membrane six fois pendant cinq minutes dans du PBS, comme nous venons de le démontrer. Ensuite, incubez la membrane dans l’obscurité avec un anticorps secondaire marqué fluorescent, dilaté en cinq millilitres de tampon de blocage et 0,1 % entre 20 avec une agitation constante, suivi de six lavages PBS de cinq minutes pour toute l’imagerie.Tout d’abord, connectez-vous à l’ordinateur et à l’imageur. Ouvrez ensuite le logiciel d’imagerie pour imager le western blot. Tout d’abord, ouvrez le couvercle de l’imageur et versez une petite quantité de PBS sur le verre.Dans le coin inférieur gauche de l’imageur, placez la membrane sur le dessus du PBS en vous assurant qu’elle est d’équerre avec l’axe de l’imageur et qu’il reste un espace d’un centimètre entre la membrane et l’axe de la grille. Roulez la membrane pour vous assurer qu’aucune bulle n’est piégée entre le verre et la membrane, puis comptez le nombre de carrés occupés par la membrane sur les axes x et y. Ensuite, fermez le couvercle de l’imageur et entrez le nombre de carrés dans le logiciel de l’ordinateur.Sélectionnez le canal infrarouge approprié et l’intensité appropriée, puis lancez le balayage pour visualiser la coloration totale des protéines du gel de contrôle de charge. Réparez le gel et l’imageur comme nous venons de le démontrer pour la membrane expérimentale, puis sélectionnez le canal 700. Réglez l’intensité sur cinq et lancez le balayage.Quantifier les données de numérisation. Commencez par régler les boutons de luminosité et de contraste du fichier numérisé pour obtenir la meilleure qualité d’image, en faisant pivoter les images nécessaires pour obtenir l’orientation souhaitée. Ensuite, sélectionnez un rectangle dans le menu des formes et utilisez-le pour dessiner un rectangle autour de toute la voie.Dans la première voie d’échantillonnage. Copiez et collez la forme autour de la première voie pour échantillonner la deuxième voie. Après avoir vérifié que la mesure d’arrière-plan n’intègre pas de signal dans la voie suivante, tracez un rectangle autour de chaque voie pour le reste des voies de l’échantillon.Affichez ensuite le signal pour le tableau des formes pour chaque rectangle dessiné en unités fluorescentes arbitraires et enregistrez l’image en tant que bile tiff. Un certain nombre de mesures de contrôle sont cruciales pour s’assurer que des données précises sont recueillies lors du transfert Western par fluorescence quantitative. Par exemple, il est souhaitable d’inclure des échantillons de contrôle positif.Deuxièmement, il est important d’optimiser le temps de transfert pour garantir un mouvement équivalent des protéines de haut et de bas poids moléculaire du gel à la membrane. Troisièmement, les dilutions appropriées des anticorps primaires et secondaires doivent être déterminées pour éviter l’interprétation incorrecte des protéines d’intérêt en raison d’une bande non spécifique comme illustré dans ces images. Quatrièmement, il est important de se demander si un anticorps secondaire élevé chez une autre espèce hôte peut être nécessaire, en particulier dans les cas où une bande protéique attendue n’est pas détectée.Cinquièmement, la production d’un gel de contrôle de charge peut confirmer l’uniformité de la charge d’échantillon. Lorsqu’il est combiné à une analyse de protéines totales, le gel peut ensuite être utilisé pour comparer et quantifier la charge protéique dans chaque voie à différentes plages de poids moléculaire mesurées par rapport à chaque échantillon. Enfin, cette technique se prête au décapage et au résondage des membranes avec plus de flexibilité que la luminescence kemi en raison de facteurs incluant, mais sans s’y limiter, une sensibilité accrue, un bruit de fond réduit, une détection bicolore et la stabilité de la membrane dans des conditions de stockage à long terme.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le traçage occidental fluorescent quantitatif pour détecter et quantifier avec précision les protéines d’intérêt, ainsi que de la façon de résoudre les problèmes courants qui peuvent survenir lors de l’exécution de cette technique.

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JoVE Journal

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Western blot en utilisant l&#39;Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Western blot est une technique d'analyse utilisée pour détecter des protéines spécifiques dans un échantillon donné d'homogénat de tissu ou de l'extrait.

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Cette vidéo décrit le transfert western basé sur la chimiluminescence des lysats immunoprécipités. La technique aide à déterminer le traitement et l’activation des protéines. Le signal chimiluminescent détecté est proportionnel au niveau de traitement des protéines lors de son activation.

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Le flux de travail V3 est une procédure western blot utilisant des gels sans taches. La technologie sans taches permet aux chercheurs de visualiser la qualité de la séparation des protéines, de vérifier l’efficacité du transfert et, plus important encore, de valider le changement dans la protéine d’intérêt en utilisant la quantification des protéines totales comme contrôle de charge fiable.

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Ce protocole explore les dernières avancées dans l'exécution des analyses Western blot. Ces nouvelles modifications utilisent un système de gel Bis-Tris avec une électrophorèse temps de fonctionnement de 35 min, un système de transfert de buvard sec 7 min, et la détection de la protéine fluorescente infrarouge et l'imagerie qui génère de plus haute résolution, la qualité, la sensibilité et l'amélioration de la précision des données occidentaux.

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