Un Guide to Modern quantitative fluorescente Western blot avec des stratégies de dépannage

L’objectif de cette procédure est de détecter et de quantifier avec précision l’abondance relative de protéines spécifiques dans un échantillon biologique complexe à l’aide d’une torsion et d’un transfert quantitatifs, fluorescents. Ceci est accompli en séparant d’abord électro-fluorescent les extraits de protéines à l’aide d’un gel à gradient préfabriqué. Dans la deuxième étape, la charge protéique équivalente est vérifiée sur toutes les voies d’échantillonnage par l’application d’une coloration protéique totale, puis le système de transfert rapide semi-sec par bloc oculaire est utilisé pour transférer les échantillons sur la membrane A-P-V-D-F.

Enfin, les protéines sont sondées avec des anticorps primaires spécifiques suivis de l’anticorps secondaire approprié marqué par fluorescence pour faciliter leur détection sensible, robuste et linéaire dans les longueurs d’onde infrarouges et rouges lointaines. En fin de compte, la floraison occidentale fluorescente quantitative peut être utilisée pour détecter, visualiser et quantifier avec précision un grand nombre de protéines membranaires et solubles dans une large gamme d’échantillons de tissus. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’imagerie basée sur l’ECL est qu’elle permet une plus grande sensibilité avec une précision accrue sur une large échelle linéaire pour une lecture véritablement quantitative. Commencez par faire macérer manuellement l’échantillon de tissu, puis homogénéisez-le dans un tampon d’extraction fraîchement préparé à environ un à 10 poids de tissu par volume de tampon jusqu’à ce qu’un homogénat lisse et cohérent soit produit.

Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire pendant 20 minutes à 20 000 fois G à quatre degrés Celsius. Transférez ensuite le sate contenant les protéines solubilisées dans un microtube à centrifuger propre et stockez les fractions granulées et surnageantes S à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Après avoir déterminé la concentration en protéines du supinate, transférez 15 microgrammes de protéines par échantillon dans de nouveaux microtubes à centrifuger.

Portez ensuite le volume final de chaque échantillon jusqu’à 10 microlitres avec de l’eau distillée et ajoutez cinq microlitres de tampon de chargement Forex. Agitez soigneusement les solutions cellulaires par vortex, puis chauffez les échantillons à 98 degrés Celsius pendant deux minutes pour dénaturer les protéines. Après la dénaturation, ajouter trois microlitres d’un étalon de poids moléculaire approprié dans le premier puits de chacun des gels expérimentaux et de contrôle de charge.

Ensuite, chargez 10 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés après l’électrophorèse. À l’aide d’un couteau à gel, libérez les gels de la cassette et retirez les puits et le pied du gel. Marquez le gel pour faciliter l’orientation ultérieure.

Ensuite, pour déterminer la charge protéique équivalente, décantez environ 30 millilitres de coloration protéique dans une boîte de Pétri carrée de 12 x 12 centimètres et placez le gel de contrôle de charge dans la coloration, en veillant à ce que la solution recouvre tout le gel. Agitez doucement le gel pendant au moins une heure à température ambiante, puis jetez la coloration protéique et lavez le gel trois fois dans de l’eau distillée avant de visualiser le bloc oculaire. Après l’électrophorèse, préparez la pile de transfert inférieure en retirant le couvercle de la feuille et en prémouillant la membrane avec un tampon directement à partir du réservoir de gel.

Mouillez à nouveau le papier filtre avec de l’eau distillée à ce moment-là également. Ensuite, lavez le gel expérimental sur la pile de transfert inférieure préparée, puis posez le papier filtre de pré-travail sur le gel et roulez-les tous les deux pour vous assurer qu’aucune bulle n’est piégée entre les couches. Posez la pile supérieure sur le papier filtre et la pile inférieure.

Roulez ensuite le sandwich de la pile de transfert pour éliminer les bulles d’air. Insérez l’éponge du kit de pile de transfert dans le tampon absorbant et placez le sandwich de pile de transfert dans l’espace dédié. Ensuite, fermez bien le couvercle et démarrez le bloc I deux, en transférant les protéines pendant sept minutes sur le programme trois.

Lorsque le programme est terminé, retirez la pile de transfert de la machine à blocs oculaires et décollez la pile de transfert supérieure et les couches de papier filtre exposant le gel sur la pile de transfert inférieure. Utilisez un scalpel pour couper autour du gel en prenant soin de faire une coupe triangulaire à des fins d’orientation sur la membrane après la coupe de la membrane pour vérifier l’efficacité du transfert, la coloration des protéines, le gel comme nous venons de le démontrer, puis déplacez rapidement la membrane dans un tube propre de 50 millilitres contenant cinq millilitres de PBS pour le premier des trois, Lavages de cinq minutes sur un rouleau mécanique. Après le troisième lavage, jetez le tampon de lavage et incubez la membrane dans un tampon de blocage non dilué pendant au moins 30 minutes à température ambiante.

Ensuite, incubez la membrane dans un anticorps primaire dilué dans cinq millilitres de tampon bloquant et 0,1 entre 20 pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec une agitation constante. Le lendemain matin, après avoir jeté la solution d’anticorps primaires, lavez la membrane six fois pendant cinq minutes dans du PBS, comme nous venons de le démontrer. Ensuite, incubez la membrane dans l’obscurité avec un anticorps secondaire marqué fluorescent, dilaté en cinq millilitres de tampon de blocage et 0,1 % entre 20 avec une agitation constante, suivi de six lavages PBS de cinq minutes pour toute l’imagerie.

Tout d’abord, connectez-vous à l’ordinateur et à l’imageur. Ouvrez ensuite le logiciel d’imagerie pour imager le western blot. Tout d’abord, ouvrez le couvercle de l’imageur et versez une petite quantité de PBS sur le verre.

Dans le coin inférieur gauche de l’imageur, placez la membrane sur le dessus du PBS en vous assurant qu’elle est d’équerre avec l’axe de l’imageur et qu’il reste un espace d’un centimètre entre la membrane et l’axe de la grille. Roulez la membrane pour vous assurer qu’aucune bulle n’est piégée entre le verre et la membrane, puis comptez le nombre de carrés occupés par la membrane sur les axes x et y. Ensuite, fermez le couvercle de l’imageur et entrez le nombre de carrés dans le logiciel de l’ordinateur.

Sélectionnez le canal infrarouge approprié et l’intensité appropriée, puis lancez le balayage pour visualiser la coloration totale des protéines du gel de contrôle de charge. Réparez le gel et l’imageur comme nous venons de le démontrer pour la membrane expérimentale, puis sélectionnez le canal 700. Réglez l’intensité sur cinq et lancez le balayage.

Quantifier les données de numérisation. Commencez par régler les boutons de luminosité et de contraste du fichier numérisé pour obtenir la meilleure qualité d’image, en faisant pivoter les images nécessaires pour obtenir l’orientation souhaitée. Ensuite, sélectionnez un rectangle dans le menu des formes et utilisez-le pour dessiner un rectangle autour de toute la voie.

Dans la première voie d’échantillonnage. Copiez et collez la forme autour de la première voie pour échantillonner la deuxième voie. Après avoir vérifié que la mesure d’arrière-plan n’intègre pas de signal dans la voie suivante, tracez un rectangle autour de chaque voie pour le reste des voies de l’échantillon.

Affichez ensuite le signal pour le tableau des formes pour chaque rectangle dessiné en unités fluorescentes arbitraires et enregistrez l’image en tant que bile tiff. Un certain nombre de mesures de contrôle sont cruciales pour s’assurer que des données précises sont recueillies lors du transfert Western par fluorescence quantitative. Par exemple, il est souhaitable d’inclure des échantillons de contrôle positif.

Deuxièmement, il est important d’optimiser le temps de transfert pour garantir un mouvement équivalent des protéines de haut et de bas poids moléculaire du gel à la membrane. Troisièmement, les dilutions appropriées des anticorps primaires et secondaires doivent être déterminées pour éviter l’interprétation incorrecte des protéines d’intérêt en raison d’une bande non spécifique comme illustré dans ces images. Quatrièmement, il est important de se demander si un anticorps secondaire élevé chez une autre espèce hôte peut être nécessaire, en particulier dans les cas où une bande protéique attendue n’est pas détectée.

Cinquièmement, la production d’un gel de contrôle de charge peut confirmer l’uniformité de la charge d’échantillon. Lorsqu’il est combiné à une analyse de protéines totales, le gel peut ensuite être utilisé pour comparer et quantifier la charge protéique dans chaque voie à différentes plages de poids moléculaire mesurées par rapport à chaque échantillon. Enfin, cette technique se prête au décapage et au résondage des membranes avec plus de flexibilité que la luminescence kemi en raison de facteurs incluant, mais sans s’y limiter, une sensibilité accrue, un bruit de fond réduit, une détection bicolore et la stabilité de la membrane dans des conditions de stockage à long terme.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le traçage occidental fluorescent quantitatif pour détecter et quantifier avec précision les protéines d’intérêt, ainsi que de la façon de résoudre les problèmes courants qui peuvent survenir lors de l’exécution de cette technique.