Name: Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Découvrez l'isolation de sous-populations de cellules souches adipose-dérivées humaines (ASCs) avec un potentiel ostéogénique accru par cytométrie en flux. Cette méthode avance la médecine régénérative.

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Cette étude a été soutenue par les Instituts nationaux de recherche en santé subvention R01-DE021683-01 et National Institutes of Health Research subvention R01-DE019434 à MTL; Howard Hughes Medical Institute bourse de recherche à MTCDCW a été soutenu par l&#39;ACS Franklin Martin Faculté de bourses de recherche, le laboratoire Hagey for Pediatric médecine régénérative, et de la Faculté Scholar Award Child Health Research Institute de l&#39;Université de Stanford.

REMARQUE: Tous les échantillons de patients ont été obtenus avec le consentement éclairé, et les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Conseil d&#39;examen Stanford University institutionnel (Protocole N ° 2188 et # 9999). 1. Isolement et culture cellulaire: <ol><li> Obtenir le tissu adipeux sous-cutané humain provenant de patients sains de sexe féminin subissant lipoaspiration élective de l&#39;abdomen, du flanc, et / région ou de la cuisse sous anesthésie locale / générale. Assurez-vous que l&#39;Institutional Review Board (IRB) l&#39;approbation a été obtenue pour le protocole d&#39;isoler ASC de tissus humains, et suivre les précautions de sécurité institutionnels tout en travaillant avec de tels matériaux. </li><li> Pour obtenir le SVF à partir du tissu adipeux lipoaspirated, le lipoaspirat premier laver trois fois avec des volumes égaux de 1x solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Aspirer soigneusement et jeter la couche aqueuse inférieure. </li><li> Préparer le tampon collagénase de digestion: 0,075% collagénase de type I dans HankBalanced Salt Solution (HBSS). Préparer tampon FACS: 2% de FBS, 1% et 1% P188 Pen-Strep dans du PBS. Filtrez les deux solutions en utilisant un 0,22 um taille des pores débit rapide filtre polyéthersulfone disponible dans le commerce. </li><li> Pour digérer le tissu adipeux lavé, ajouter un volume égal de tampon de digestion à la collagénase et le placer récipient de digestion en toute sécurité dans un bain-marie à agitation pendant 60 min à 37 ° C (environ 180 secousses / min). REMARQUE: Il est préférable d&#39;utiliser un récipient de digestion de volume plus important que nécessaire, car cela permet à la digestion maximale pendant l&#39;agitation (c.-250 ml de tampon de digestion collagénase, 250 ml de tissu adipeux lavé dans un flacon stérile 1L). </li><li> Neutraliser l&#39;activité enzymatique par addition d&#39;un volume égal de tampon pour FACS et permettant de se asseoir à la température ambiante pendant 5 min. Ensuite, centrifuger à 233 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer soigneusement et jeter le surnageant, en prenant soin de ne pas perturber le culot SVF-haute densité. </li><li> Reprendre le culot dans 5 à 10 ml de RT rougeTampon de lyse cellulaire, selon la taille du culot. Laissez la solution de se asseoir à la température ambiante pendant 5 min et centrifuger à 233 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre le culot en ajoutant 5-10 ml de milieu de croissance traditionnelle, basée sur la taille de pellets (milieu de Eagle modifié Dulbecco [DMEM] / 10% de FBS / 1% de pénicilline-streptomycine solution [pen-strep]). </li><li> On filtre la suspension à travers un filtre cellulaire en nylon de 100 um pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C, et jeter le surnageant sans perturber le culot. </li><li> Reprendre le culot dans 5 à 10 ml de milieu de croissance traditionnelle, basée sur la taille du culot. </li><li> Placez 2 x 10 6 cellules dans une boîte de culture de 15 cm standard et établir des cultures primaires O / N à 37 ° C / 21% d&#39;O 2, 5% de CO 2. Maintenir au niveau sous-confluentes à prévenir une différenciation spontanée à 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2 dans des milieux de croissance. La densité cellulaire dans un cadre entièrement: NOTEconfluentes 15 cm plaque est d&#39;environ 4-6 x 10 6 cellules. </li></ol> 2. coloration <ol><li> CSA de la culture dans un milieu de croissance classique à 37 ° C / 21% O 2, 5% de CO 2, pendant 36 heures avant la coloration / tri. </li><li> ASC Ascenseur à partir de plaques de culture à l&#39;aide Accutase (selon le protocole du fabricant). </li><li> Laver les cellules une fois avec du tampon FACS (PBS avec 2% de FBS et 1% de Pen-strep). </li><li> Centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant sans perturber le culot. Remettre en suspension les cellules dans 0,5 à 1 ml de tampon FACS (selon le nombre de cellules et la quantité souhaitée de l&#39;anticorps). NOTE: Le volume de la suspension cellulaire, selon les recommandations du fabricant d&#39;anticorps FACS, détermine la concentration d&#39;anticorps. Cependant, le titrage de la concentration en anticorps, en utilisant une concentration de départ de 1: 100, est habituellement conseillé si ce est la première fois d&#39;utiliser un anticorps. </li><li> Comptez le nombre total decellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Réserve aliquotes de 100 ul dans 1,5 ml tubes de centrifugeuse à utiliser pour un échantillon non colorées et les contrôles d&#39;une seule couleur (selon le nombre d&#39;anticorps fluorescents utilisés). </li><li> Ajouter les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence appropriés (à des concentrations prédéterminées, selon les instructions du fabricant) et incuber pendant 20-30 min sur la glace, à l&#39;abri de la lumière. <ol><li> Pour étiqueter sous-population ostéogénique: Diluer anti-CD90 (CD90 APC anti-humain (Thy1)) ou anti-CD105 (FITC anti-CD105 humain (endogline)) dans un tampon FACS à une concentration de 1:50. </li><li> Pour marquer d&#39;autres populations de cellules (par exemple, hématopoïétiques et les cellules endothéliales): Diluer anti-CD45 (anti-humain CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (anti-humain CD34 APC), et / ou anti-CD31 (anti-humain CD31 PE ) dans un tampon FACS à une concentration de 1:50. </li><li> Si vous ne utilisez anticorps directement conjugués, utiliser un anticorps primaire biotinylé avec une seconde de streptavidine conjugué appropriéeary anticorps, tels que la streptavidine PE-Cy7, à une dilution de 1: 100. </li></ol></li><li> Après incubation, laver les cellules deux fois: remplir les tubes avec du tampon FACS et centrifuger à 233 g pendant 5 min à 4 ° C, aspiration surnageant. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 400 à 500 échantillons ul FACS tampons et filtrer à travers une cellule de nylon filtre 70 um pour éliminer les grumeaux de cellules. </li><li> Transfert cellules marquées dans des tubes FACS avec le dessus du filtre et conserver des échantillons sur la glace pendant la durée de l&#39;analyse. </li></ol> 3. fluorescence tri cellulaire activé REMARQUE: Les étapes suivantes prescrivent des connaissances préalables dans la cellule activé par fluorescence (FACS) ou l&#39;assistance d&#39;un technicien qualifié. <ol><li> Utilisation du logiciel FACS appropriées, parcelles d&#39;analyse de conception pour examiner diffusion vers l&#39;avant (FSC), diffusion latérale (SSC), la phycoérythrine (PE) -Texas rouge, bleu Pacifique, isothiocyanate de fluorescéine (FITC), Allophycocyanin (APC) et toute autre utilisation de fluorophored pour marquer les cellules. </li><li> Avant de charger dans le trieur de cellules, vortex brièvement chaque échantillon pour remettre en suspension les cellules. </li><li> Commencer avec l&#39;analyse de l&#39;échantillon non coloré afin de mettre en portes pour la population totale de la cellule, pour exclure les débris cellulaires, et de déterminer autofluorescence base. </li><li> Ajouter l&#39;iodure de propidium (PI) à l&#39;échantillon non colorées et les analyser afin de visualiser la population de cellules vivantes dans la population totale de la cellule. Construire une porte autour de cette population. </li><li> Analyser un échantillon de contrôle d&#39;une seule couleur pour chaque fluorochrome pour régler la compensation de fluorescence. </li><li> Analyser l&#39;échantillon teinté pour régler la position des portes pour le tri. </li><li> Ajouter PI à l&#39;échantillon coloré pour colorer les cellules mortes. </li><li> Trier les populations cellulaires marqués. Trier soit 1,5 ml dans des tubes à centrifuger ou tubes coniques (15 ml) contenant du milieu de culture. </li><li> Cesser tri manuellement une fois que la quantité requise de cellules a été obtenue. </li><li> Nousing FACS, effectuer une vérification de la pureté en analysant une petite fraction (ex., 500 cellules) de la population de cellules acquise. NOTE: Cette étape confirme la pureté des populations de cellules triées. Idéalement, la pureté soit supérieure à 90-95%. </li><li> Centrifuger les cellules à 233 g pendant 5 min à 4 ° C immédiatement après la fin du tri et remettre en suspension dans 1 ml de milieu frais contenant 10% de FBS. REMARQUE: La quantité de support utilisé peut être augmentée en fonction de la taille du culot cellulaire. </li><li> Plate sur des plaques revêtues de gélatine pour améliorer la viabilité des cellules. Selon le rendement cellulaire finale, plaque 300000 cellules par puits dans une plaque à 6 puits, 100 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits. </li></ol>

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</ol>

Aucun des auteurs ont un intérêt financier dans l&#39;un des produits, dispositifs ou médicaments mentionnés dans ce manuscrit. Aucun des auteurs ne ont aucun intérêt financier concurrence à signaler.

Actuellement, l&#39;isolement des sous-populations homogènes de CSA de la SVF de tissu adipeux humain reste un défi si objectif souhaitable. L&#39;isolement de sous-populations de l&#39;ASC pro-ostéogéniques est particulièrement souhaitable, car ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la formation et l&#39;homéostasie des tissus squelettiques. Toutefois, le SVF du tissu adipeux abrite hétérogénéité significative en ce qui concerne d&#39;endiguer la capacité des cellules et le potentiel de différenciation. ...

La nature hétérogène des populations de cellules souches n’est pas encore entièrement comprise et reste un obstacle majeur au développement d’applications thérapeutiques à base de cellules souches cliniquement efficaces. L’une des façons les plus courantes de caractériser une population hétérogène de cellules souches consiste à utiliser une méthode de tri cellulaire, telle que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), pour séparer les cellules en fonction de leurs profils d’expression de marqueurs de surface. À mesure que les méthodes de tri deviennent plus complexes, il devient possible d’identifier des sous-populations fonctionnelles plus distinctes de cellules. Les technologies basées sur la microfluidique sont de plus en plus fréquemment utilisées dans l’analyse de l’expression des gènes au niveau de la cellule unique. La réaction en chaîne quantitative par polymérase (qPCR) multiplexée au sein d’une puce microfluidique permet une analyse transcriptionnelle efficace et fiable à haute résolution sur cellule unique. 1 à 5
Dans une étude précédente utilisant le profilage transcriptionnel de 48 gènes, une hétérogénéité transcriptionnelle considérable a été observée entre les ASC. 6 Cependant, la distribution des gènes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 a montré une forte association avec un groupe de cellules possédant des profils transcriptionnels hautement ostéogéniques. Pour isoler les cellules selon ce profil d’expression génique ostéogénique, les modèles d’expression de l’antigène de surface ont été corrélés avec les modèles de transcription et l’expression du marqueur de surface de l’endogline (CD105) s’est avérée étroitement corrélée avec le potentiel de différenciation ostéogénique amélioré des ASC. Indépendamment de l’expression de CD105, l’expression du récepteur de surface Thy-1 (CD90), une protéine membranaire liée au glycosyl-phosphatidylinositol précédemment montrée par Chen et al. comme étant associée aux cellules ostéoprogénitrices, était également corrélée avec l’expression génique ostéogénique. 6,7 Ces résultats offrent l’occasion d’isoler prospectivement des sous-populations au sein d’un pool hétérogène plus large d’ASC avec une capacité ostéogénique accrue pour les applications d’ingénierie des tissus osseux à base de cellules.

<table><tbody><tr><td>Tubes coniques jetables de 250 ml</td><td>Corning (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glycémie élevée, supplément GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Bétadine - Solution antiseptique de povidone/iode</td><td>Purdue&nbsp ;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr> Solution <tr><td>saline équilibrée de Hank, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, certifié, origine américaine</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de&nbsp ; Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASE Solution de détachement de cellules</td><td>souches Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC Souris anti-humaine CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humaine CD105 (Endoglin)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD45 eFluor 450 (remplacement du bleu pacifique)&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>CD34 anti-humain APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>CD31 anti-humain (PECAM-1)</td><td>PE eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II instrument</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BM-MSCs) sont considérées comme la référence pour les applications d’ingénierie tissulaire à base de cellules souches. Cependant, le processus par lequel ils doivent être récoltés peut être associé à une morbidité importante du site donneur. En revanche, les cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ASC) sont plus facilement abondantes et plus facilement récoltées, ce qui en fait une alternative attrayante aux BM-MSC. À l’instar des BM-MSC, les ASC peuvent se différencier en cellules de lignée ostéogénique et peuvent être utilisées dans des applications d’ingénierie tissulaire, telles que l’ensemencement sur des échafaudages pour une utilisation dans les défauts squelettiques craniofaciaux. Les ASC sont obtenues à partir de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux digéré, qui est un mélange hétérogène d’ASC, de cellules endothéliales et murales vasculaires, de cellules musculaires lisses, de péricytes, de fibroblastes et de cellules circulantes. L’analyse cytométrique en flux a montré que le profil des marqueurs de surface pour les ASC est similaire à celui des BM-MSC. Malgré plusieurs rapports publiés établissant des marqueurs pour le phénotype de l’ASC, il n’y a toujours pas de consensus sur les profils identifiant les cellules ostéoprogénitrices dans cette population hétérogène. Ce protocole décrit comment isoler et utiliser une sous-population d’ASC ayant une capacité ostéogénique accrue pour réparer les défauts calvaires de taille critique.

Utilisation de CD90 en tant que marqueur pour des cellules avec des résultats améliorés d'ostéogenèse en isolement d'une population hautement enrichi de CSA humains (Figure 1A, 1B). CSA ont été colorées avec Pacific Blue-CD45 anti-humain conjugué, conjugué à FITC anti-CD105 humain, et APC conjugué anti-CD90 humain. Après le tri, le niveau de pureté était supérieure à 98%, telle que quantifiée par une analyse post-tri. Définir les groupes de cellules en fonction des profils d...

L’hétérogénéité transcriptionnelle au sein des cellules stromales dérivées du tissu adipeux humain peut être définie au niveau de la cellule unique à l’aide de marqueurs de surface cellulaire et de gènes ostéogéniques. Nous décrivons un protocole utilisant la cytométrie en flux pour l’isolement de sous-populations cellulaires ayant un potentiel ostéogénique accru, qui peut être utilisé pour améliorer la reconstruction du squelette craniofacial.

Isolement et enrichissement du tissu adipeux humain cellules stromales pour ostéogenèse accrue

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des sous-populations de cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux avec un potentiel ostéogénique amélioré en utilisant la cytométrie assistée par flux pour y parvenir. Les cellules souches dérivées du tissu adipeux humain ou ASC sont prélevées à partir d’une lipo-aspiration humaine et cultivées pendant 36 heures. Les cellules sont ensuite colorées avec des anticorps sélectionnés pour marquer les populations ostéogéniques pros et les populations souhaitées sont isolées à l’aide de la cytométrie assistée par flux.En fin de compte, la coloration alcaline à la phosphatase et à l’azarine révèle un potentiel ostéogénique accru des cellules isolées. Les implications de cette technique s’étendent à la médecine régénérative et au développement de nouvelles thérapies translationnelles, car elle décrit comment isoler une sous-population d’ASC avec une ostéogenèse améliorée. La procédure suivante est réalisée à l’aide de tissu adipeux sous-cutané humain provenant de patientes en bonne santé qui ont subi une lipo-aspiration élective de l’abdomen, du flanc et/ou de la cuisse sous anesthésie locale ou générale.Commencez avec 500 millilitres à un litre de tissu dans une cartouche d’aspiration prélevée directement dans la salle d’opération. Immédiatement après la collecte, commencez la procédure de récolte. Cela maximisera la viabilité cellulaire pour obtenir la fraction vasculaire stromale ou SVF à partir du tissu adipeux lipo-aspiré Commencez par ajouter du PBS stérile dans un rapport de un à un.Secouez ensuite doucement la cartouche pour mélanger. Après le mélange. Laissez reposer la solution jusqu’à ce qu’elle se sépare en trois couches.La couche supérieure d’huile est claire et jaune. La couche graisseuse intermédiaire est visqueuse, opaque et jaune, et la couche inférieure de sang est rouge. À l’aide d’une pipette sérologique, aspirez et jetez la couche de sang inférieure, aspirez la couche d’huile supérieure.Ensuite, répétez cette opération. Lavez deux fois de plus. Après avoir préparé le tampon de digestion de la collagénase et le tampon de fax comme indiqué dans le document d’accompagnement, placez-les dans le capot avec le tampon de lyse des globules rouges afin qu’ils puissent se réchauffer à température ambiante.Ensuite, transférez le tissu adipeux lavé dans un grand flacon et digérez-le à un volume égal de tampon de digestion de la collagénase. Placez le ballon en toute sécurité dans un bain-marie agitant pendant 60 minutes. À 37 degrés Celsius.Il est préférable d’utiliser un récipient de digestion de plus grand volume que nécessaire, car cela permet une digestion maximale pendant l’agitation. Par exemple, 250 ml de tampon de digestion de la collagénase et 250 ml de tissu adipeux lavé doivent être placés dans une fiole stérile d’un litre. Après l’incubation, neutralisez l’activité enzymatique en ajoutant un volume égal de tampon de télécopie et en laissant le tissu reposer à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, transférez le tissu digestif dans un tube à centrifuger conique jetable de 250 millilitres et centrifugez à 233 G, ou 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, aspirez le supinate et remettez en suspension la pastille de pel en ajoutant cinq à 10 millilitres de croissance traditionnelle. Moyen, selon la taille du granulé.Ensuite, pipetez la suspension à travers une crépine en nylon de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres pour éliminer tous les débris cellulaires. Après avoir jeté le surnageant, la palette doit apparaître comme indiqué. Ici, Reese, suspendez le palais dans 10 millilitres à température ambiante.Tampon de lyse rouge. Laissez la solution reposer à température ambiante pendant cinq minutes, puis centrifugez-la à 233 G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, centrifugez à 233 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jetez le piège sans déranger la pastille.Puis Resus, suspendez la pastille dans cinq à 10 millilitres de croissance traditionnelle. Moyen, selon la taille du granulé. Après avoir compté les cellules, placez 2 millions de cellules dans une boîte de culture standard de 10 centimètres et établissez des cultures primaires pendant la nuit.Maintenez les cellules SVF à des niveaux subconfluents pour éviter la différenciation spontanée. 36 heures après l’ensemencement, soulevez les cellules à l’aide d’Accutane selon le protocole du fabricant. Lavez les cellules une fois avec un tampon de télécopie, puis centrifugez-les à 233 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après l’essorage, jetez la caisse claire sans perturber la pastille. Remettre les cellules en suspension dans 0,5 à un millilitre d’effets. Tampon. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Allouez 1,2 million de cellules à un groupe non trié qui sera stocké séparément en tant que contrôle. Pour cette expérience, transférez 100 microlitres de quats dans un tube einor de 1,5 millilitre. Pour chaque échantillon à analyser, préparez un échantillon non coloré et des contrôles de couleur unique pour chacun des anticorps à utiliser et placez-les sur de la glace.Ensuite, pour étiqueter la sous-population ostéogénique, diluer anti CD 90 ou anti CD 1 0 5 dans le tampon de fax pour marquer les autres populations cellulaires telles que les cellules hématopoïétiques et endothéliales, diluer anti CD 45, anti CD 34 et ou anti CD 31 dans le tampon de fax. Après l’incubation, lavez les cellules deux fois en remplissant les tubes avec un tampon de fax et centrifugez à 233 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après l’aspiration par essorage, le snat après le deuxième lavage remet les cellules en suspension dans 400 à 500 microlitres d’effets.Filtre tampon les échantillons à travers une crépine en nylon de 70 micromètres dans un tube à centrifuger pour éliminer les amas de cellules. Effectuez le tri des cellules activé par fluorescence comme indiqué dans le protocole d’accompagnement. À l’aide de graphiques d’analyse de conception de logiciels de faits pour examiner la diffusion vers l’avant, la diffusion latérale fico, l’éryn, l’isothiocyanate fluorescent Texas Red Pacific, le cyanure et tout autre fluor quatre utilisé pour marquer les cellules.Il est important de s’assurer que les graphiques d’analyse des faits sont dessinés de manière appropriée afin de ne pas exclure par inadvertance les populations cellulaires souhaitées. Triez les populations de cellules marquées dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre ou des tubes coniques de 15 millilitres contenant une culture. Le moyen cesse manuellement le tri.Une fois que la quantité requise de cellules a été obtenue pour cette expérience, environ 2 millions de cellules sont nécessaires. Ensuite, à l’aide de faits, effectuez un contrôle de pureté en analysant une petite fraction d’environ 500 cellules de la population cellulaire acquise. Notez que cette étape confirme la pureté des populations cellulaires triées.Idéalement, la pureté devrait être supérieure à 90 à 95 % immédiatement après le tri des cellules de centrifugation à 233 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, réinstallez les cellules dans un milieu frais d’un millilitre contenant 10 % de plaque FBS, les cellules sur des plaques recouvertes de gélatine pour améliorer la viabilité cellulaire. Selon la plaque de rendement cellulaire finale, 300 000 cellules par puits dans une plaque à six puits, ou 100 000 cellules par puits.Dans une plaque de 12 puits pour isoler l’adipeux humain arrive des cellules stromales avec un potentiel ostéogénique accru. Les ASC ont été colorées avec du CD 45 conjugué au bleu du Pacifique, au CD conjugué 1 0 5 et au CD 90 anti-humain conjugué à la A PC et isolés comme décrit dans cette vidéo, comme le montre ici, le tri basé sur l’expression élevée de CD 90 ou faible de CD 1 0 5 a donné des populations fortement enrichies d’ASC humaines pour caractériser le potentiel ostéogénique des deux sous-populations. CD 90 positif CD 1 0 5, des ASC faibles et non triées ont été cultivées dans un milieu de différenciation ostéogénique pendant 14 jours, comme on peut le voir sur cette image.La coloration à la phosphatase alcaline, qui sert d’indicateur précoce de la formation osseuse, a été augmentée dans la population de culture CD 90 positive par rapport aux autres groupes. La quantification à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images a confirmé que la différence observée était significative. De même, au jour 14, la coloration alleraire et rouge, qui est utilisée pour détecter la minéralisation de la matrice extracellulaire et sert de mesure pour la différenciation ostéogénique terminale, a augmenté dans la population positive au CD 90 par rapport aux autres groupes. La quantification à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images a également confirmé que la différence observée était significative.Ces données indiquent que les ASC positives au CD 90 sont capables de minéraliser une quantité significativement plus importante de matrice extracellulaire que les cellules non triées, ce qui suggère que les ASC isolées conservent la capacité de subir une différenciation ostéogénique après le tri. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler une sous-population d’ASC avec un potentiel ostéogénique accru. Lorsque vous travaillez avec des échantillons humains tels que décrits dans ce protocole, il est important de toujours porter des vêtements de protection appropriés.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Réparation d&#39;un modèle de critique des défauts de taille crânienne Utilisation adipeuses cellules stromales prélevés sur des Lipoaspirate

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