Mesure automatisée de l'emphysème pulmonaire et petites remodelage des voies aériennes dans la cigarette de fumée souris exposées

Le but de cette procédure est de quantifier la BPCO, à l’instar des pathologies pulmonaires chroniques dans les poumons des souris exposées à la fumée de cigarette. Ceci est accompli en exposant d’abord les souris à la fumée de cigarette ou à l’air pendant six mois. Ensuite, des tests de la fonction pulmonaire sont effectués sur les souris à l’aide d’un ventilateur pour rongeurs.

Ensuite, les poumons sont gonflés à une pression fixe, retirés et fixés dans du formol à 10 %. Enfin, un logiciel plus informatif est utilisé pour mesurer la taille de l’espace aérien sur les sections pulmonaires colorées par les branchies et la matrice extracellulaire des petites voies respiratoires, l’épaisseur de la couche de protéines ou les sections pulmonaires colorées aux trichomes de Mason. En fin de compte, la mesure de l’élargissement de l’espace aérien dans les poumons de souris exposées à la fumée de cigarette est effectuée de manière normalisée, impartiale et automatisée.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la mesure de l’interception linéaire moyenne ou l’indice destructif, est que ce protocole prend moins de temps à compléter, moins sensible au biais de l’observateur et plus efficace pour capturer la nature hétérogène de la pathologie chez la souris car il peut analyser la maladie dans des LOB entiers et/ou les deux poumons. Après avoir exposé des souris à la fumée de cigarette et les avoir anesthésiées selon le protocole textuel, rasez la peau en avant de la trachée et utilisez une solution à base d’iode suivie d’éthanol pour désinfecter la zone à l’aide de ciseaux clavés. Faites une incision médiane à travers la peau et le tissu sous-cutané en avant de la trachée et utilisez des pinces pour séparer les muscles thyroïdiens Sterno.

Pour exposer la trachée, passez une longueur de deux pouces de suture en soie à l’arrière de la trachée, induisez des ciseaux trachéaux pour faire une trachéotomie sur la face antérieure de la trachée. Insérez ensuite une canule de calibre 18 dans la trachéotomie. Induisez la suture pour la fixer en place via la canule trachéale.

Connectez la souris au tube en Y de l’adaptateur du ventilateur mécanique et lancez la ventilation mécanique en utilisant un volume courant de 10 millilitres par kilogramme et une fréquence respiratoire de 150 respirations par minute. Ensuite, gonflez les poumons jusqu’à une capacité pulmonaire totale ou CCM de trois fois par historique de volume. Pour mesurer la capacité inspiratoire ou ic et réduire l’ectasie des poumons, effectuer une oscillation forcée à fréquence unique, manœuvrer, et évaluer la résistance dynamique, RRS, élastine ERS et compliance CRS du système respiratoire.

Ensuite, effectuez une fréquence à large bande, une oscillation forcée, une manœuvre et mesurez la résistance des voies respiratoires centrales, la résistance du tissu RN, le tissu G, l’élastine H et le rapport G sur H.Enfin, enregistrez la conformité quasi statique CST pendant les manœuvres d’écoulement de pression volumique. Répétez chacune de ces manœuvres cinq fois jusqu’à ce que des lectures cohérentes soient obtenues. Gonflage à TL C3 fois entre chaque série répétée.

Enregistrez la valeur moyenne de chaque paramètre pour chaque souris. Retirez la souris du ventilateur et après l’avoir euthanasiée conformément au protocole de texte. Coupez le diaphragme, ouvrez le thorax sur la ligne médiane et retirez les côtes antérieures pour exposer les poumons.

Disséquez la peau et le tissu sous-cutané autour de la trachée et passez deux sutures en soie de deux pouces de longueur à l’arrière de la trachée. Une fois que l’inflation pulmonaire a été quantifiée en effectuant un lavage broncho-alvéolaire et que l’air a été évacué de l’ensemble d’administration pour l’inflation pulmonaire, connectez l’ensemble d’administration intraveineuse à la canule trachéale. Ouvrez la valve et laissez le PBS s’écouler dans les poumons par gravité jusqu’à ce que les poumons se gonflent complètement.

Faites un nœud avec la suture distale à la canule trachéale. À l’aide d’une pince, soulevez la trachée et coupez-la à proximité du nœud. Ensuite, disséquez le tissu conjonctif postérieur à la trachée et aux poumons.

Retirez délicatement les poumons et placez-les dans un tube contenant 10 % de solution saline. Formule tamponnée dans. Fixez les poumons à température ambiante pendant la nuit avant d’utiliser du PBS pour les laver deux fois.

Enfoncez les poumons dans de la paraffine et coupez cinq micro-sections épaisses. Ensuite, utilisez une coloration branchiale pour colorer les sections et les imager comme indiqué dans le protocole textuel. Pour préparer les images à l’analyse d’image Scion, démarrez Scion image et chargez les macros comme indiqué dans la partie supplémentaire du protocole texte, sélectionnez la macro Ouvrir l’image en fond clair une macro à sélectionner et ouvrez un fichier TIFF.

Utilisez des outils d’édition d’image pour préparer l’image. Pour l’analyse, sélectionnez la couleur du pinceau en cliquant sur noir ou blanc en bas de la fenêtre LUT. Cliquez ensuite sur l’outil pinceau pour modifier la taille du pinceau.

Double-cliquez sur l’outil pinceau et entrez une taille de pinceau appropriée. Utilisez l’outil pinceau pour forcer les zones qui ne sont pas de l’espace aérien ou des parois alvéolaires à être traitées comme de l’espace aérien ou des tissus en peignant les bronches et les vaisseaux en noir afin qu’ils soient analysés comme des tissus. Pour mesurer la longueur moyenne du cordon de l’espace d’air, sélectionnez la macro longueur du cordon air deux.

Cette étape convertit l’image en niveaux de gris en une image binaire avec uniquement un seuil de pixels noirs ou blancs. L’image binaire en cliquant près du centre de l’image et en faisant glisser la souris vers le haut ou vers le bas. Pour ajuster la valeur de seuil, cliquez une seconde fois sur la souris pour accepter la valeur.

Ajustez le seuil pour que les parois alvéolaires aient la même épaisseur que dans les images originales. Il est crucial de ne pas passer sous le seuil et de créer ainsi des ruptures dans les parois alvéolaires qui n’existent pas dans l’image originale, ce qui produira des valeurs de longueur de cordon artificiellement élevées. Observez une fenêtre qui déclenche un nouveau seuillage de l’image binaire et continuez ou annulez la macro jusqu’au seuil.

Encore une fois, répondez pourquoi à l’invite et sélectionnez le bouton OK. Observez la fenêtre de grille horizontale et verticale générée par la macro avec des lignes espacées de cinq pixels. Le programme mesure la longueur des lignes verticales horizontales qui chevauchent l’espace aérien.

Enregistrez le fichier dans n’importe quel dossier en utilisant le nom par défaut. Cela inclut un format de fichier qui est ajouté avec C LA TXT pour la longueur du cordon de l’espace aérien. Cela permettra aux macros de rapport Excel de trouver le fichier.

Pour analyser les rapports, ouvrez le rapport X Excel TWENTYX XLS. Choisissez la macro multiple CL m pour signaler les mesures de longueur du cordon alvéolaire pour plusieurs dossiers correspondant aux images de plusieurs souris à partir de la fenêtre de fichier. Sélectionnez un dossier à la fois en mettant le dossier en surbrillance, puis en sélectionnant OK.

Au fur et à mesure que chaque dossier est sélectionné, observez sa feuille de calcul qui affiche les statistiques de chaque fichier CL txt. Ensuite, les statistiques pour les données de longueur de cordon combinées à partir de tous les fichiers, ouvrez le fichier tous les CL pour afficher les données de toutes les feuilles de travail. Enfin, renommez et enregistrez la feuille de calcul.

Le nom de fichier par défaut est le nom du dossier parent ajouté en c xls. Une coupe d’un poumon bien gonflé est montrée ici. Les macrophages dans les espaces alvéolaires sont peints en blanc et les vaisseaux et les bronches sont peints en noir.

Ensuite, l’image est convertie en une image binaire soumise à un seuillage à l’aide de l’image d’origine, puis inversée de sorte que tous les pixels de l’espace alvéolaire soient noirs et/ou les pixels des zones du poumon qui ne sont pas des alvéoles soient blancs. Ces figures montrent les longueurs verticales et horizontales des cordons alvéolaires générées par la macro logicielle. Cette expérience montre que les souris C 57 noires de six types sauvages exposées à la fumée ont une augmentation de 23 % de la taille de l’espace aérien alvéolaire par rapport aux souris de type sauvage exposées à l’air appariées selon l’âge et le sexe.

Les tests de la fonction respiratoire montrent de modestes décalages vers la gauche dans les boucles de volume de pression, reflétant une perte modeste de recul élastique du poumon, ce qui correspond à un emphysème léger qui se développe chez les souris de type sauvage C 37 noires six exposées à la fumée de cigarette. Les six mois montrés ici sont des images de coupes de poumons colorées au trichrome massen de souris de type sauvage C 57 noir six exposées à l’air ou à la fumée de cigarette pendant six mois, illustrant l’augmentation du dépôt de protéines de matrice extracellulaire autour des petites voies respiratoires dans la cigarette, les animaux exposés à la fumée Lors de cette procédure. Il est important de se rappeler de faire attention à ne pas entailler les poumons lorsque vous les retirez de la cage thoracique des souris après son développement.

Cette technique a ouvert la voie à des recherches dans le domaine des maladies pulmonaires afin d’explorer les voies qui contribuent à la pathogenèse des maladies pulmonaires chroniques pro-obstructives chez la souris et d’évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies de notre BPCO dans un système modèle préclinique.