Name: Une In Vitro Dosage enzymatique pour mesurer linhibition de transcription par le gallium (III) et H 3 5,10,15-tris (pentafluorophényl) corroles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Découvrez un dosage enzymatique in vitro pour évaluer l'inhibition de la transcription par des dérivés de corrole anticancéreux. Cette méthode utilise l'électrophorèse sur gel et la spectroscopie UV-Vis pour quantifier l'efficacité des inhibiteurs.

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Nous remercions sincèrement le Dr N. Cindy Chiu de l&#39;aide pour électrophorèse sur gel, et Andy Zhou et Michael Grodick pour leur généreux don de l&#39;ADN et l&#39;enzyme de restriction. Nous tenons à remercier le professeur J. Heath et le Professeur D. Prober pour un accès généreux à l&#39;équipement et des matériaux. Nous remercions le Dr Karn Sorasaenee suggestions utiles. Nous remercions Mary H. Tang pour créer l&#39;illustration utilisée dans l&#39;aperçu schématique dans la vidéo. Le financement a été fourni par Johnson &amp; Johnson et USC Y86786.

REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec l&#39;ARN de maintenir un environnement de travail propre pour éviter la contamination par DNase et RNase enzymes qui dégradent l&#39;ADN et de l&#39;ARN. Veiller à ce que des conseils et des tubes pipettes sont DNase et RNase. Il est également utile pour essuyer les surfaces de laboratoire et des équipements tels que des pipettes, des supports de tubes, etc., avec une solution de décontamination. 1. Traitement avec l&#39;ARN de transcription corrole <ol><li> Préparer le corrole composés inhibiteurs et 0,01 dans un ratio molaire de 1 [complexe]: [ADN]. NOTE: Dans notre cas, le ratio était de 4,3 fmol complexe: 0,43 pmol ADN, où la matrice d&#39;ADN utilisé était vecteur APET-28c avec le gène de la Liga E. coli sous le contrôle du promoteur T7. Autres ADN avec le promoteur T7 sont également des candidats valables pour l&#39;exécution de l&#39;essai de transcription. <ol><li> Dissoudre actinomycine D, triptolide, tpfc, et Ga (tpfc) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), dans des récipients propres distincts. Obtenir la concentration finale de 0,01 un ratio molaire de 1 [complex]: [ADN] en utilisant des dilutions en série avec de l&#39;eau sans nucléase. <ol><li> Dissoudre 1 mg actinomycine D dans 1,8 ml de DMSO. Aliquote de 10 pi à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l&#39;eau sans nucléase de créer une dilution 1/100. Aliquote de 1 ul de la dilution à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l&#39;eau sans nucléase de créer une dilution 1/1000. REMARQUE: La concentration de la solution finale de l&#39;actinomycine D est de 4,3 fmol. </li><li> Dissoudre 1 mg triptolide dans 0,64 ml de DMSO. Aliquote de 1 ul à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l&#39;eau sans nucléase de créer une dilution 1/1000. Aliquote de 1 ul de la dilution à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l&#39;eau sans nucléase de créer une seconde 1/1000 dilution. REMARQUE: La concentration de la solution finale est de 4,3 fmol triptolide. </li><li> Dissoudre 1 mg tpfc dans 2,9 ml de DMSO. Aliquote de 10 pi à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l&#39;eau sans nucléase pour créer un 1/100 dilution. Aliquote de 1 ul de la dilution à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l&#39;eau sans nucléase de créer une dilution 1/1000. REMARQUE: La concentration de la solution finale est de 4,3 fmol tpfc. </li><li> Dissoudre 1 mg Ga (tpfc) dans 2,6 ml de DMSO. Aliquote de 10 pi à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l&#39;eau sans nucléase de créer une dilution 1/100. Aliquote de 1 ul de la dilution à un récipient séparé et diluer à 1 ml avec de l&#39;eau sans nucléase de créer une dilution 1/1000. REMARQUE: La concentration de la solution finale de Ga (tpfc) est de 4,3 fmol. NOTE: Ces corroles et les inhibiteurs ne sont pas solubles dans l&#39;eau et doivent être pré-dissous dans du DMSO. De petites quantités de DMSO (moins de 1%) ne induisent pas de cytotoxicité dans les cellules (données non publiées). </li></ol></li></ol></li><li> Avant de commencer la réaction de transcription, préparer les réactifs nécessaires individuellement ou les acheter à partir d&#39;un fournisseur commercial. <ol><li> Thaw sur la glace tout gelén réactifs (voir le tableau 1 pour une liste de réactifs congelés). </li><li> Laisser le tampon de réaction 10x et 4 ribonucléotide (ATP, CTP, GTP et UTP) temps de solutions de mélanger jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient complètement dissous dans la solution. </li><li> Centrifuger brièvement tous les réactifs pour éviter la perte de matière sur le bord du tube. Une fois décongelé, ribonucléotides de magasins sur la glace tout en gardant le 10X Reaction Buffer à température ambiante. </li><li> Combiner les réactifs pour la réaction de transcription à la température ambiante (voir le tableau 2 pour une liste de réactifs). REMARQUE: La spermidine 10x dans le tampon de réaction peut coprécipiter l&#39;ADN de matrice si la réaction est assemblé sur de la glace et non à la température ambiante. </li><li> Mélanger soigneusement en tapotant le tube ou le mélange pipetage et doucement. Après mélange, on centrifuge brièvement pour collecter le mélange de réaction à la partie inférieure du tube. </li><li> Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant un total de 2 à 4 heures. NOTE: Les temps de réaction nécessaires varierontavec la taille et la séquence de matrice d&#39;ADN. Cette étape peut nécessiter une optimisation pour des séquences spécifiques. Des modèles plus courts peuvent nécessiter de plus longues durées de réaction pour un rendement élevé de l&#39;ARN total. </li><li> Retirez quatre aliquotes de chaque réaction après chaque heure et conserver à -20 ° C. Modifier comme nécessaire pour timepoints souhaités. </li></ol></li></ol> 2. ARN Spin Colonne <ol><li> Après la réaction de transcription, de purifier l&#39;ARN en utilisant des colonnes de Chromatographie microcentrifugation-compatible. Remarque:. Utilisation d&#39;ARN colonnes de spin pour purifier l&#39;ARN avec plus de 20 bases des résultats dans plus de 80% de récupération 44 REMARQUE: La Chromatographie sur colonne est une méthode courante et pratique pour purifier l&#39;ARN. D&#39;autres procédés de purification existent aussi comme chlorure de lithium précipitation, extraction au phénol: chloroforme, précipitation à l&#39;isopropanol, ainsi que d&#39;autres kits disponibles dans le commerce. <ol><li> Remettre en suspension uniformément dans la matrice Sephadex le tampon de colonne en inversant la vigoureusementcolonne trois fois ou plus. Pour ce faire, en feuilletant la colonne fortement. </li><li> Retirez le couvercle supérieur de la colonne. Il y aura une certaine matrice Sephadex résiduelle dans le bouchon; si la capsule est remplie avec la matrice, replacer le capuchon sur la colonne et répéter l&#39;étape précédente jusqu&#39;à ce que la majorité de la matrice est dans la colonne. </li><li> Casser la pointe en bas de la colonne. NOTE: Certaines liquide peut se échapper de la colonne. </li><li> Remplir la colonne. <ol><li> Placez colonne dans une stérile (sans RNase ni DNase) Tube de 1,5 ml. </li><li> Centrifuger le tube dans une centrifugeuse de paillasse à 1000 g pendant 1 min. </li></ol></li><li> Jeter le tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec du tampon élue de la colonne. </li><li> Placer immédiatement la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml de microcentrifugation stérile et pipeter l&#39;échantillon au centre du lit de la colonne. Utilisez 20-50 ul de l&#39;échantillon pour éviter de surcharger la colonne. </li><li> Centrifuger le tube dans une centrifugeuse de table à 1000 xgpendant 1 min. NOTE: L&#39;éluant est l&#39;échantillon d&#39;ARN purifié. </li></ol></li></ol> 3. Agarose électrophorèse sur gel (1% Agarose Gel) 42 NOTE: Le bromure d&#39;éthidium est fluorescent lors de la liaison à l&#39;ADN et l&#39;ARN, par conséquent, ces biomolécules peuvent être visualisées avec une lumière UV en les incubant avec 0,5 pg / ml de solution de bromure d&#39;éthidium. <ol><li> Préparer une solution 1,000x boursier de bromure d&#39;éthidium (0,5 mg / ml) en dissolvant 5 mg de bromure d&#39;éthidium dans 10 ml d&#39;eau. </li><li> Préparer Tris acétate EDTA (TAE) tampon de course pour électrophorèse sur gel. Pour faire un tampon 50x TAE combiner 2,0 M Tris-acétate avec 0,05 M d&#39;acide éthylène diamine (EDTA) et ajuster le pH à 8,5. </li><li> Préparation d&#39;un gel d&#39;agarose à 1% (poids / volume) en dissolvant 10 g d&#39;agarose dans UltraPure 1 L de tampon TAE 1X et faire fondre l&#39;agarose avec un four à micro-ondes conventionnel. Une fois refroidi à 50 ° C, ajouter 1 ml de bromure d&#39;éthidium à 1,000x le gel d&#39;agarose à 1% solution, mélanger en remuant doucement en inversant ou dans un récipient fermé, puis verser la solution d&#39;agarose dans une plate-forme de gel sous pression et permettre au gel de se solidifier à température ambiante. NOTE: Le bromure d&#39;éthidium est un mutagène et cancérogène potentiel. Porter des gants et manipuler solutions attentivement. Pour les procédures de manipulation appropriées de bromure d&#39;éthidium, se il vous plaît voir: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a> . </li><li> Après que le gel est solidifié, placer le gel de consigne dans la cuve d&#39;électrophorèse. Ajouter tampon TAE assez pour couvrir le gel jusqu&#39;à ce que les puits sont submergés. Vérifiez que le niveau du tampon TAE est d&#39;environ 1 mm au-dessus du niveau du gel. Retirer le peigne de gel. REMARQUE: Retrait du peigne après puits sont submergés empêche poches d&#39;air d&#39;être piégé dans les puits. </li><li> Préparer les échantillons d&#39;ARN. Combiné 1 pl de chaque échantillon aliquote purifiée avec 1 ul Gel Loading Buffer (ou avec 1 ul 10x tampon de chargement et DILUTed à 10 pi avec de l&#39;eau sans nucléase) et bien mélanger par pipetage de haut en bas avec une micropipette. REMARQUE: tampon de charge de 10x contient 20% de Ficoll 400, 0,1 M de Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% de SDS, 0,25% de bleu de bromophénol. 0,25% de xylene cyanol peut également être ajouté au tampon de charge, il fonctionne comme ~ 50% plus vite que le bleu de bromophénol et peut être utile pour contrôler très longues distances. 42 </li><li> Charger le gel avec chaque échantillon à la pipette soigneusement la solution dans le fond de chaque puits. Prenez soin de ne pas laisser les bulles d&#39;air ou de mélanger les échantillons entre les puits. REMARQUE: Une échelle d&#39;ARN peut également être utilisé pour déterminer la taille de la transcription. </li><li> Fixez les câbles de sorte que l&#39;ADN va migrer dans le gel vers le fil positif. Régler la tension au niveau désiré, généralement de 1 à 10 V / cm de gel. Démarrer le gel pour le temps est suffisant pour la séparation significative entre les fragments d&#39;ARN, en utilisant la migration des colorants pour surveiller la progression de la séparation. NOTE: A 23 cm x 25 cm de gel à 250 V prendra environ 1 heure, tandis que 8 cm x 8 cm de gel à 150 V aura environ 20 min. Fragments d&#39;ARN de petite taille ont une meilleure résolution lorsqu&#39;il est exécuté à des tensions plus élevées. </li><li> Coupez l&#39;alimentation électrique lorsque le colorant de la mémoire tampon de chargement a migré une distance jugée suffisante pour la séparation entre les fragments d&#39;ARN. </li><li> Image de l&#39;ARN sous lumière UV que le bromure d&#39;éthidium sera fluorescence. </li><li> Prenez une photo de l&#39;image et comparer les intensités de fluorescence de l&#39;ARN purifié à partir de chaque condition. </li></ol> 4. ARN Quantification par spectroscopie UV-Vis <ol><li> Placez 2 pl H 2 O sur une NanoDrop 2000, ou une machine similaire, et de mesurer le vide. </li><li> Ensuite, placer 2 ul de chaque échantillon d&#39;ARN, après purification, sur le spectrophotomètre et de mesurer UV-Vis à partir d&#39;une gamme de longueurs d&#39;onde de 200 nm à 800 nm. REMARQUE: Une lecture de 260 A 1,0 est équivalente à environ 40 ug / ml d&#39;ARN,et l&#39;ARN pur a un A 260 / A 280 rapport de 2,1 45. </li><li> Dans le cas ci-dessus est que l&#39;absorbance DO 1, diluer les échantillons dans de l&#39;eau sans nuclease à obtenir une DO inférieure à 1. </li><li> Utilisez un logiciel graphique pour tracer les différents échantillons et comparez DO à 260 nm. </li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet essai démontre que l&#39;ajout de Ga (tpfc) inhibe la transcription de l&#39;ARN comparable aux complexes anticancéreux de liaison à l&#39;ADN connus actinomycine D et triptolide. Le comportement cytotoxique de Ga (tpfc) (IG = 50 58,1 à 154,7 M) peut en raison de ses propriétés inhibitrices. Étant donné qu&#39;aucune transcription inhibition a été observée dans tpfc, la cytotoxicité de tpfc est pas due à la transcription d&#39;ARN d&#39;inhibition mais est causée par d&#39;autres moyens non encore étudiée...

La chimiothérapie consiste souvent à large spectre des agents cytotoxiques à des effets secondaires indésirables et ciblage limitée, mais avec une plus grande compréhension de la biologie du cancer, il ya une demande croissante pour les agents anticancéreux avec plus d&#39;efficacité sur le cancer-ciblage et moins d&#39;effets secondaires. 1 cellules cancéreuses humaines deviennent souvent 2 Ainsi dépendant d&#39;un seul oncogène activé ou surexprimé à la survie., de nombreux médicaments anticancéreux sont évalués par leur capacité à inhiber la transcription d&#39;ARN. Les traitements qui bloquent l&#39;expression de ces gènes transformants sont efficaces dans l&#39;élimination des cellules cancéreuses et conduisent à la mort cellulaire. 3 Les cellules transformées sont plus sensibles aux perturbations de la transcription d&#39;ARN que celles des cellules normales correspondantes. 4 Les médicaments anticancéreux qui inhibent la transcription devraient inhiber sélectivement le expression des oncogènes qui sont nécessaires à la cellule de cancer de survivre. 5 Par conséquent, la transcription d&#39;ARN inhibition est un moyen utile pour identifier les candidats potentiels de médicaments anticancéreux et en apprendre davantage sur leur mécanisme d&#39;action. Ce protocole démontre que Ga (tpfc) inhibe la transcription de l&#39;ARN sur le même ordre que les médicaments de chimiothérapie actinomycine D et triptolide; comparaisons semblables peuvent être faites en utilisant ce protocole avec d&#39;autres candidats de médicaments anticancéreux. L&#39;actinomycine D est un inhibiteur de la transcription d&#39;ARN utilisée pour traiter le cancer trophoblastique gestationnel, le cancer des testicules, la tumeur de Wilm, rhabdomyosacoma, et le sarcome d&#39;Ewing 6. Actinomycine D a été utilisé dans le traitement du cancer depuis près de 50 années depuis qu&#39;il a été approuvé par la FDA en 1964.Triptolide est un inhibiteur sélectif de la transcription qui a été étudiée in vitro et dans divers modèles animaux portant la tumeur pour 30 ans. 7 La nature macrocyclique amphiphile de corroles confère des avantages significatifs par rapport aux autres classes de médicaments tels que les petites molécules ou biologiques. 14.8 Le caractère macrocyclique permet de perméabilité cellulaire qui est plus grande que prévu pour ces grosses molécules, et ils sont assez grands pour interagir avec des surfaces macromoléculaires, telles que celles des protéines. 8 corroles sont connus pour former des complexes non covalents serrés avec des biomolécules et les médicaments. 10 En plus de la cytotoxicité inhérente du cadre corrole, nous avons démontré qu&#39;une sulfonés corrole agit en tant que molécule porteuse pour les agents chimiothérapeutiques, en particulier l&#39;anthracycline doxorubicine médicament d&#39;intercalation d&#39;ADN. Lorsque le corrole sulfoné a été administré en association avec la doxorubicine, une amélioration de 3 fois dans le IC 50 de la doxorubicine a été observée pour cellules DU-145. 9 Le cadre corrole est stable et a absorbance et de fluorescence propriétés inhérentes que, lorsque fonctionnalisé, subissent des changements d&#39;absorbance uniques qui peut être utilisé pour la caractérisation. 10 La fonctionnalisation de l&#39;échafaudage ne ​​est pas intrinsèquement affect les propriétés photophysiques du corrole, 9-15, mais, comme on le voit avec une corrole sulfoné, modifier sélectivement le cadre de la corrole peuvent modifier considérablement ses propriétés biologiques. 16 Nous avons déjà évalué six métallocorroles contre sept lignées de cellules cancéreuses humaines. Les résultats indiquent que la toxicité envers les cellules cancéreuses humaines dépend de l&#39;ion métallique spécifique, ainsi que la substitution du groupe fonctionnel. Par exemple, les corroles de gallium sulfonés connu absorption cellulaire élevée et pénètrent sélectivement dans le noyau des cellules du cancer de la prostate métastatique du cerveau (DU-145); les cellules de la même corrole, bien qu&#39;elle ne pénètre pas dans le noyau d&#39;autres lignées cellulaires, présente une plus grande cytotoxicité du cancer du sein (MDA-MB-231), le mélanome (SK-MEL-28), et de l&#39;ovaire (OVCAR-3) cancer que pour cancer de la prostate. 9 Dosages à base de cellules initiales indiquent que ces composés prometteurs en tant qu&#39;agents thérapeutiques anti-cancéreuses, ce qui mérite Furthenquête er dans le mécanisme d&#39;action. inhibition de la transcription est observée avec certains complexes organométalliques 17-27 et nous a demandé d&#39;examiner ce processus comme un mécanisme possible pour le comportement cytotoxique de la famille corrole. Ce dosage de transcription fournit une méthode simple, peu coûteux et facile pour évaluer l&#39;inhibition de la transcription, ce qui conduira à des informations plus détaillées sur les effets de ces molécules dans les cellules vivantes. Ici, l&#39;inhibition de la transcription de gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) et son analogue de base libre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (figure 1) sont testés. Contrairement à certains complexes de métaux de transition, le gallium (III) est redox inactive et donc ne est pas directement impliqué dans le processus d&#39;oxydo-réduction de voies métaboliques en fonction redox. 28 Indépendamment, le gallium (III) ne présentent des propriétés cytotoxiques et a été étudié à des fins thérapeutiques. Gallium est le deuxième métal le plus prometteur pour les traitements anticancéreux après platine et a subi de nombreuses études et enquêtes; des sels à base de nitrate et de chlorure de gallium ont été évaluées dans des essais cliniques contre l&#39;hépatome, le lymphome, les cancers de la vessie, et d&#39;autres maladies. 29-34 Gallium (III) est donc idéal pour les études corrole anticancéreux. Les données initiales montrent Ga (tpfc) et tpfc avoir une faible IG 50, la concentration de médicament nécessaire pour inhiber 50% de la prolifération cellulaire maximale, avec diverses lignées de cellules cancéreuses (voir la figure 2); Cela confirme la validité des autres expériences sur ces deux composés pour déterminer leurs propriétés inhibitrices. Nous comparons ces composés avec les médicaments anticancéreux commune actinomycine D et triptolide. L&#39;actinomycine D intercale ADN, ARN inhibe l&#39;allongement, et induit une apoptose dans certaines lignées cellulaires à des concentrations picomolaires 6,35-37 Triptolide a montré à inhiber la croissance tumorale. il se lie à XPB / ERCC3 humain, une sous-unité of facteur de transcription TFIIH, conduisant à l&#39;inhibition de l&#39;ARN polymérase II activité. 6-7,38-40 Se il est bien connu que corroles présentent des propriétés cytotoxiques, il existe peu d&#39;informations sur les différents mécanismes découlant de fonctionnalisation. Inhibition corrole de transcription de l&#39;ARN offrirait une meilleure idée de leurs interactions avec les macromolécules biologiques. D&#39;autres complexes connus pour se lier à l&#39;ADN, tels que dirhodium (II, II), le chrome (III), le ruthénium (II) polypyridyl, le rhodium (III), et divers autres, ont été soumis à des essais de transcription d&#39;ARN, 18- 27 entraîne une plus grande compréhension de leurs interactions avec biomacromolécules. Cette expérience facile et largement disponible est aussi un bon test initial pour évaluer les propriétés de cytotoxicité d&#39;une molécule donnée et de déterminer se il mérite d&#39;autres essais biologiques. Le dosage de transcription d&#39;ARN permet également de nombreuses modifications, telles que varying la quantité de composé ou les enzymes utilisées; faire varier la période d&#39;incubation, le temps de réaction et des instants échantillons; et faire varier la longueur de la matrice d&#39;ADN et de la séquence, entre autres variables d&#39;intérêt, ainsi potentiellement fournir une grande quantité de données. Ce dosage de transcription est également disponibles sous forme de kits abordables avec tous les composants de réaction nécessaires fournis, bien que les composants peuvent être achetés et préparés individuellement. Dans ces expériences, nous utilisons un kit disponible dans le commerce connu pour avoir un rendement élevé 41. Pour évaluer l&#39;inhibition de la transcription, nous utilisons deux méthodes: électrophorèse sur gel d&#39;agarose et de spectroscopie UV-Vis. Électrophorèse sur gel d&#39;agarose est une méthode simple et efficace pour la séparation, l&#39;identification, la purification et 0,5 à des fragments d&#39;ADN et d&#39;ARN de 25 kb. 42 spectroscopie UV-Vis peut être utilisé pour déterminer la concentration et la pureté de l&#39;ARN. 43

<table><tbody><tr><td>Actinomycine D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1410</td><td>Stocker à 2-8 &deg ; C, protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3652</td><td>Stocker à 2-8 &deg ; C , protéger contre les</td></tr><tr><td>H2O légères sans nucléases.</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>Magasinez chez &ndash ; 20 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>ATTENTION : Pour des procédures de manipulation appropriées du bromure d’éthidium, veuillez consulter : http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td></tr><tr><td>Acétate de Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>mini Colonnes d’ARN Quick Spin</td><td>Roche Life Science</td><td>11814427001</td><td>Store à 2-8 &deg ; C , ne pas congeler</td></tr><tr><td>1 kb Échelle d’ADN</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>Magasinez à &ndash ; 20 &deg ; C&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

une<em&gt; in vitro</em&gt; dosage enzymatique pour mesurer l&#39;inhibition de transcription par le gallium (iii) et h<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorophényl) corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

La chimiothérapie consiste souvent à large spectre des agents cytotoxiques avec de nombreux effets secondaires et ciblage limité. Corroles sont une classe de macrocycles tétrapyrroliques qui présentent des propriétés cytostatiques et cytotoxiques différentielles dans des lignées cellulaires spécifiques, en fonction de l&#39;identité du métal chélaté et des groupes fonctionnels. Le comportement unique de corroles fonctionnalisés envers des lignées cellulaires spécifiques introduit la possibilité d&#39;une chimiothérapie ciblée. De nombreux médicaments anticancéreux sont évalués par leur capacité à inhiber la transcription d&#39;ARN. Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la transcription d&#39;ARN en présence d&#39;inhibiteurs connus et potentiels. L&#39;évaluation des produits d&#39;ARN de la réaction de transcription par électrophorèse sur gel et spectroscopie UV-Vis fournit des informations sur les propriétés inhibitrices de candidats potentiels de médicaments anticancéreux et, avec les adaptations à l&#39;essai, et plus de leur mécanisme d&#39;action. Peuest connu sur le mécanisme d&#39;action moléculaire de la cytotoxicité corrole. Dans cette expérience, nous considérons deux composés corrole: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) et analogique freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un essai de transcription d&#39;ARN a été utilisé pour examiner les propriétés inhibitrices des corroles. Cinq réactions de transcription ont été préparés: ADN traité avec l&#39;actinomycine D, triptolide, Ga (tpfc), à une tpfc [complexe]: [base de matrice d&#39;ADN] rapport de 0,01, respectivement, et un témoin non traité. Les réactions de transcription ont été analysés après 4 heures en utilisant une électrophorèse sur gel d&#39;agarose et spectroscopie UV-Vis. Il est clair par inhibition Ga (tpfc), actinomycine D et triptolide. Ce dosage de transcription d&#39;ARN peut être modifié pour fournir des détails plus mécaniste en faisant varier les concentrations du complexe anticancéreux, ADN, polymérase ou une enzyme, ou par incubation de l&#39;ADN polymerase ou à l&#39;achèvementxes avant transcription de l&#39;ARN; ces modifications seraient différence entre un mécanisme d&#39;inhibition impliquant l&#39;ADN ou l&#39;enzyme. L&#39;ajout du complexe ARN après transcription peut être utilisé pour tester si les complexes se dégradent ou se hydrolyser l&#39;ARN. Ce dosage peut également être utilisé pour étudier les candidats anticancéreux supplémentaires.

Qualitativement transcription ARN évaluée par électrophorèse sur gel d&#39;agarose Une électrophorèse sur gel d&#39;agarose est utilisé pour l&#39;image de l&#39;ARN transcrit. Bromure d&#39;éthidium fluoresce lors de la liaison (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 permettant l&#39;imagerie de l&#39;ARN. Bandes sombres dans le gel correspondent à des concentrations plus élevées d&#39;ARN. Si actinomycine D, triptolide, ou soit complexe c...

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole et son analogue freebase présentent une faible cytotoxicité cellulaire micromolaire. Ce manuscrit décrit une réaction de transcription d&#39;ARN, l&#39;ARN de formation d&#39;image avec un gel coloré au bromure d&#39;éthidium et l&#39;ARN quantifier avec spectroscopie UV-Vis, afin d&#39;évaluer l&#39;inhibition de la transcription par corroles et illustre une méthode simple d&#39;évaluation des propriétés anticancéreuses candidates.

Une<em&gt; In Vitro</em&gt; Dosage enzymatique pour mesurer l&#39;inhibition de transcription par le gallium (III) et H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorophényl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer si des composés candidats anti-cancéreux inhibent la transcription de l'acide ribonucléique, ou ARN. Pour ce faire, on prépare d'abord des réactions de transcription de l'ARN, en incluant dans cette expérience des composés CHO qui présentent des propriétés cytotoxiques différentes, afin d'évaluer leur inhibition de la transcription de l'ARN et de la comparer à celle d'inhibiteurs connus. Après avoir soigneusement mélangé les réactions, les tubes sont incubés à 37 degrés Celsius et des aliquotes sont prélevées aux temps souhaités.Ensuite, une électrophorèse sur gel est utilisée pour évaluer l'inhibition relative, car un bromure d'iridium fluoresce lorsqu'il se lie à l'ARN ; des bandes plus foncées sur le gel correspondent à des concentrations plus élevées d'ARN. Pour quantifier le degré d'inhibition de la transcription, une spectroscopie ultraviolette, visible ou UV-visible est réalisée. Enfin, cette vidéo démontre une méthode simple pour évaluer les propriétés de candidats anti-cancéreux.En évaluant l'inhibition de la transcription par les coraux, les médicaments anticancéreux potentiels doivent être analysés selon leur capaci

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Cette méthode décrit un rendement élevé in vitro synthèse d'ARNm capés et non capés à partir d'un plasmide linéarisé contenant le Gaussia gène de la luciférase (GLuc). L'ARN est purifié et une fraction de l'ARN non capée est capée enzymatiquement à l'aide du Vaccinia enzyme de coiffage viral. Dans la dernière étape, l'ARNm est transfecté dans des cellules HeLa et les surnageants de culture cellulaire sont analysés pour l'activité de la luciférase.

Transcription in vitro et plafonnement de l&#39;ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

Ce protocole décrit une procédure expérimentale pour la construction rapide des facteurs de transcription artificiels (atfs) avec les journalistes de la GFP apparentées et la quantification de la capacité des carburants de remplacement à stimuler l'expression de la GFP par cytométrie de flux.

Synthèse rapide et le dépistage de facteurs de transcription activés chimiquement avec Reporters base GFP

L’homéostasie calcique du réticulum endoplasmique est perturbée dans diverses pathologies.  Un rapporteur de protéine de surveillance calcique du RE (SERCaMP) peut être utilisé pour détecter les perturbations dans le stockage du calcium du RE.   Ce protocole décrit l’utilisation d’une SERCaMP de la gaussia luciférase pour examiner l’homéostasie calcique du RE in vitro et in vivo.

Suivi réticulum endoplasmique homéostasie calcique l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciférase SERCaMP

Dans ce travail, nous fournissons un flux de travail expérimental sur la façon dont les amplificateurs actifs peuvent être identifiés et validés expérimentalement.

Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant l&#39;acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole permettant d’examiner fonctionnellement la transcription et l’activité inhibitrice des agents antibactériens ciblant la transcription bactérienne.

Dans les dosages transcription in vitro et leur application dans la découverte de médicaments

Il existe une demande pour faire précliniques Essais pour une nouvelle classe de médicaments « orphelins » appelées chaperons pharmacologiques reproductible, rapide et efficace. Nous avons développé un test culture cellule simple, très standardisé et polyvalent à écran pour patients admissibles ainsi que des médicaments nouveaux chaperons pharmacologiques.

In Vitro Mesure d’enzyme à Test pharmacologique chaperon réactivité Fabry et la maladie de Pompe

Nous décrivons ici le protocole standard pour la détection de l’activité β-galactosidase dans des embryons de souris tout au début et à la méthode paraffine sectionnement et contre-coloration. Il s’agit d’une procédure simple et rapide pour contrôler l’expression des gènes au cours du développement qui peut également être appliquée à des coupes de tissus, organes ou cellules en culture.

Suivi de l’Expression génique par la détection d’activité β-galactosidase dans des embryons de souris entière

Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

L'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est un outil puissant pour comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation génique. Cependant, la méthode implique des difficultés dans l'obtention de la fragmentation de chromatine reproductible par tonte mécanique. Ici, nous fournissons un protocole amélioré pour un jeu d'enfant en utilisant la digestion enzymatique.

Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

Ce protocole utilise une réaction en chaîne de polymérase en temps réel (PCR) basée sur la sonde, un prédisme de sulforhodamine B (SRB), 3' régions non traduites (3' UTR) et un résultat de luciferase pour vérifier les gènes cibles d'un miRNA d'intérêt et pour comprendre les fonctions des miRNAs.

Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales

Les ADN méthyltransférases sont des cibles potentielles de médicaments anticancéreux. Ici, un protocole est présenté pour évaluer les petites molécules pour l’inhibition de l’ADN méthyltransférase. Ce test utilise une endonucléase pour coupler la méthylation de l’ADN à la génération de fluorescence et permet de surveiller l’activité enzymatique en temps réel.

Essai de méthylation de l’ADN couplé à l’endonucléase en continu basé sur la fluorescence pour dépister les inhibiteurs de l’ADN méthyltransférase

Découvrez un dosage enzymatique in vitro pour évaluer l'inhibition de la transcription par des dérivés de corrole anticancéreux. Cette méthode utilise l'électrophorèse sur gel et la spectroscopie UV-Vis pour quantifier l'efficacité des inhibiteurs.

Une In Vitro Dosage enzymatique pour mesurer linhibition de transcription par le gallium (III) et H 3 5,10,15-tris (pentafluorophényl) corroles (Vidéo) | JoVE Journal

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