Name: Évaluation de lefficacité des médicaments contre le cancer Sensibilisation In Vitro Et In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Découvrez une méthode d'évaluation de la sensibilisation aux médicaments anticancéreux en mesurant le métabolisme cellulaire in vitro et la fréquence métastatique in vivo. Cette approche utilise un modèle d'embryon de poulet pour valider de nouvelles cibles thérapeutiques.

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Ce travail a été rendu possible par des subventions à JK des Centres d&#39;excellence de l&#39;Ontario et le Fonds de la recherche en Ontario. Nous tenons à remercier Siddika Pardhan et le Dr Peter Ferguson pour l&#39;assistance technique pendant le tournage.

REMARQUE: Le protocole suivant a été conçu pour une utilisation avec des cellules adhérentes. Modifications sont nécessaires pour appliquer la méthode à des cellules non-adhérentes cultivées en suspension. Les expériences CAM décrites dans le protocole sont conçus pour une utilisation avec des cellules qui expriment un marqueur fluorescent (par exemple, la GFP, RFP, etc.). Neuf jours embryons de poulet sont tenus le jour 2 du protocole expérimental pour les expériences de CAM. 1. Préparation et transfection de cellules tumorales avec oligonucléotides antisens (OLS) <ol><li> Aspirer milieu du flacon T75 (s) contenant des cellules d&#39;intérêt, laver avec 1XPBS, et ajouter 2 ml de trypsine à 0,25% / EDTA. Ajouter 10 ml de milieu de croissance complet à chaque flacon et transférer les cellules dans une solution dans un tube de 50 ml. Compter les cellules et ajuster le volume de sorte que la concentration finale est 1,0x10 5 cellules par ml. </li><li> Étiquette deux groupes de flacons T25: un groupe contiendront huit flacons étiquetés, 1-8, et seront used pour l&#39;expérience de mesure du métabolisme en temps réel; et le second groupe contient également huit flacons et sera utilisé pour l&#39;expérience de CAM d&#39;embryon de poulet. Ajouter 2 ml de solution de cellules dans chaque flacon et le placer dans l&#39;incubateur (37 ° C, 5% CO 2 O / N). </li><li> Le lendemain matin (jour 0, Temps 0), l&#39;étiquette de trois 5 ml tubes comme suit: le contrôle (non-ciblage ASO ou siRNA), «cible d&#39;intérêt» (ce est à dire, en ciblant ASO ou siRNA) et Lipofectamine 2000 (ou similaire réactif de transfection). Diluer les solutions disponibles ASO à la concentration appropriée du milieu sans sérum dans le tube approprié. <ol><li> Ajouter la quantité nécessaire de réactif de transfection au tube approprié et incuber dans un milieu exempt de sérum pendant 5 min. Ajouter la solution de réactif de transfection pour les tubes ASO et incuber pendant 20 min. </li></ol></li><li> Ajouter 250 ul de solution de réactif ASO de transfection de commande pour chacun des flacons de 1 à 4 dans chaque groupe, et 250pi de «cible d&#39;intérêt &#39;ASO solution de réactif de transfection à chacun des flacons 5-8 dans chaque groupe. Incuber pendant 4 heures (37 ᵒC, 5% CO 2). <ol><li> Pendant l&#39;incubation, effectuer les étapes décrites à la section 2.1. Après l&#39;incubation, ajouter 3 ml de milieu complet à chaque flacon dans le groupe d&#39;essai de CAM et revenir à l&#39;incubateur O / N (37 ᵒC, 5% CO 2). Traiter le groupe de l&#39;expérience du métabolisme selon la description à la section 2.2. Traiter l&#39;expérience de cames selon la description à la section 4. </li></ol></li></ol> 2. Biocapteur Chip Préparation et ensemencement cellulaire <ol><li> Dans un environnement stérile, laver soigneusement six puces de biocapteurs avec 400 pi de PBS. Stériliser les puces avec 400 ul d&#39;éthanol à 70% pendant 20 min. Laver trois fois avec 400 ul de PBS. <ol><li> Placez les puces à l&#39;intérieur de tissus stériles culture plats pour éviter la contamination. Placez trois puces dans un plat étiqueté «contrôle», et trois dans un plat étiqueté «cible d&#39;intérêt &#39;. </li></ol></li><li> Étiqueter deux tubes de 50 ml que «contrôle» et «cible d&#39;intérêt &#39;. Laver les cellules avec du PBS et ajouter un volume approprié de 0,25% de trypsine / EDTA. Attendez jusqu&#39;à ce que les détache de monocouches et de recueillir les cellules dans chaque flacon. Déposer la solution dans le tube approprié. <ol><li> Compter les cellules et ajuster le volume de sorte que la concentration finale est 6.0x10 5 cellules / ml. Centrifuger les cellules et remettre en suspension si la concentration initiale est trop faible. </li></ol></li><li> Ajouter 250 pi de la solution cellulaire pour chaque puce de biocapteur dans le groupe approprié (pour un total de 1.25x10 5 cellules par puce). Effectuez cette tâche un groupe à la fois pour minimiser le risque de confondre les puces. Placez les plats stériles contenant les puces dans une chambre d&#39;humidité pour éviter l&#39;évaporation, et placer les cha d&#39;humiditémbre dans l&#39;incubateur O / N (37 ᵒC, 5% CO 2). </li><li> Le matin suivant (jour 1), aspirer soigneusement le milieu de chaque puce et le remplacer par 250 ul de milieu de croissance supplémenté avec 0,2% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 x pénicilline et de streptomycine (P / S). Incuber pendant 4 heures (37 ᵒC, 5% CO 2). </li></ol> De préparation du système de mesure et de métabolisme 3. Préparation de la solution <ol><li> Durant l&#39;incubation, préparer les solutions de médicament requises et le système de mesure du métabolisme pour le dosage à venir. NOTE: Le système de mesure du métabolisme contient un total de six modules. Chaque module peut accueillir une puce par expérience. <ol><li> Subdiviser le dosage dans les groupes expérimentaux suivants: une puce de chacun des «contrôle» et «cible d&#39;intérêt&quot; groupes à recevoir véhicule pendant toute la durée de l&#39;essai; deux puces de chaque groupe pour recevoir le traitement médicamenteux pendant une période de temps définie pendant la uneéssayé, suivie de véhicule au cours de la période de lavage. </li><li> Pour les études drogues de sensibilisation, de modifier la longueur, le calendrier, et la concentration de traitement de la toxicomanie pour répondre à la drogue en question. NOTE: Pour le cisplatine, les étapes suivantes ont été déterminées empiriquement avec des cellules A549, et peut varier en fonction de la lignée cellulaire. Effectuez toutes les étapes avec le débit par défaut de 4 pi / min. 6 h de croissance à moyen + 0,2% de FBS et 1x P / S 24 h de 6 uM cisplatine en milieu + 0,2% de FBS 1x P / S 24 h de croissance à moyen + 0,2% de FBS et 1x P / S 18 h de croissance à moyen + 0,2% de FBS et 1x P / S 4 h de 0,1% de Triton X- REMARQUE: Des dérogations à ces étapes, il faudra calcul pour déterminer le volume requis de solutions à moyen et médicaments basés sur le débit souhaité et la durée de l&#39;expérience. Les sections suivantes sont basées sur les étapes décrites ci-dessus. </li></ol></li><li> Étiquette et remplir quatorze tubes de 50 ml avec 50 ml de croissance à moyen + 0,2% de FBS uned 1x P / S. Placez dans une six portoir de tubes du système de mesure du métabolisme, six dans l&#39;autre, et les deux autres dans un troisième porte-tube qui contient également des tubes avec le cisplatine. Sceller les deux premières grilles d&#39;une membrane perméable à l&#39;air pour empêcher l&#39;évaporation. </li><li> Préparer une solution de 6 uM de cisplatine (du volume approprié) dans un milieu FBS + 0,2% avec 1 x P / S. Distribuer le volume requis de solution de cisplatine marqués en quatre tubes de 50 ml. <ol><li> Placer les tubes dans les quatre places restantes dans le rack de tube de mesure troisième métabolisme. Se assurer que les tubes sont placés dans les fentes appropriées qui correspondent aux Biomodules souhaités. Sceller les tubes avec une membrane perméable à l&#39;air. </li></ol></li><li> Préparer et étiqueter six tubes de 50 ml et les remplir avec 20 ml chacune de solution à 0,1% de Triton-X dans le milieu. La solution Triton-X lyser toutes les cellules restantes et de fournir une valeur «zéro» pour chaque puce. Placer les tubes dans un rack tube quatrième unité de mesure du métabolisme et sceller l&#39;esprith une membrane permable de l&#39;air pour éviter l&#39;évaporation excessive. </li><li> Chargez les jetons dans les Biomodules et initier l&#39;expérience. </li></ol> Traitement et de drogues injectables 4. CAM Expérience REMARQUE: Les étapes et la procédure pour la préparation des embryons de poulet pour une expérience de CAM sont décrits ailleurs 19 <ol><li> Commencer le traitement de la heures après la transfection CAM expérience 48 (Jour 2). Sous-diviser le «contrôle» et «cible d&#39;intérêt&quot; des groupes en deux flacons pour véhicule, et deux pour cisplatine. Aspirer le milieu des flacons et reconstituer avec soit 3 ml de milieu frais, ou 6 uM de cisplatine. Incuber pendant 6 h (37 ᵒC, 5% de CO 2). </li><li> Aspirer le milieu, puis lavez et trypsiniser les cellules; recueillir les cellules trypsinisées en solution en quatre correctement étiquetés tubes de 15 ml. <ol><li> Centrifuger les cellules et laver trois fois avec du PBS. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de PBS uneD compter les cellules. </li><li> Ajuster le volume de sorte que la concentration cellulaire finale est 1,0x10 6 cellules / ml. Transférer la solution cellulaire dans étiquetés tubes de 5 ml pour l&#39;injection, et le placer sur la glace. Retourner doucement les tubes avant l&#39;injection afin de se assurer que les cellules sont bien mélangés. </li></ol></li><li> Mettez de côté un total de 24 embryons de poulet (vieilles 9 jours) pour injection (6 par groupe). Effectuer l&#39;injection en utilisant une aiguille de verre fixé à un tube flexible relié à une seringue de 1 ml. La personne effectuant l&#39;injection doit être aveugle au groupe de traitement. <ol><li> En utilisant un microscope stéréo, injecter 1,0x10 5 cellules dans un volume de 100 ul dans la circulation veineuse de la came. Utilisez, une technique de pulsation lente pour injecter la totalité du volume de cellules. Tamponnez délicatement le site d&#39;injection avec un chiffon doux lingette pour endiguer le flux de sang et d&#39;absorber tout déversement. Étiqueter chaque récipient embryonnaire suivante appropriée chaque injection. </li></ol></li><li> Confirmer la présence et Distrition de cellules fluorescentes dans le système vasculaire de la CAM après l&#39;injection par les visualiser à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence. Prenez note de tous les embryons dans lequel le nombre de cellules tumorales semble faible, ou la distribution est médiocre. </li><li> Placez les embryons de poulet dans une chambre d&#39;humidité et de les stocker dans un incubateur (37 ° C, 60% d&#39;humidité). Attendre 7-9 jours avant d&#39;énumérer foyers métastatiques. </li></ol> 5. métastatique point Enumeration <ol><li> Au cours de la période d&#39;incubation de 7-9 jours, surveiller les embryons et jetez les morts. Se assurer que la chambre d&#39;humidité reste humide pendant toute la durée de la période d&#39;incubation. </li><li> En utilisant un microscope stéréo fluorescent à grossissement 20X, balayer la totalité de la surface supérieure de la CAM d&#39;embryons dans un motif régulier, analogue à une grille. </li><li> Comptez le nombre de foyers métastatiques dans chaque champ de vision, alors comptabiliser le nombre pour un total final par embryon. Cela pour les six embryons dans chaque groupe fournira un nombre o moyennef foyers métastatiques par traitement. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

En raison du coût inhérent et le risque associé à des essais cliniques, il est nécessaire de développer une meilleure et plus rigoureuse méthodologie de test pré-clinique pour évaluer adéquatement les nouveaux schémas thérapeutiques anti-cancéreuses. Techniques couramment utilisées toutes les faiblesses actuelles d&#39;exposition qui peuvent limiter leur capacité de distinguer entre cibles thérapeutiques / agents potentiellement prometteurs, et ceux qui peuvent être moins efficaces. Nous avons élaboré un protocole visan...

Résistance à la cible et / ou le traitement du cancer cytotoxique est un problème clinique important qui peut conduire à l&#39;échec du traitement, de la rechute acquise, et l&#39;augmentation de la mortalité des patients 1. Compte tenu du degré élevé d&#39;hétérogénéité dans la plupart des tumeurs, ce est une certitude mathématique qu&#39;une tumeur du nombre suffisamment élevé de cellules contient un sous-ensemble de cellules résistantes à des traitements simples ou combinés ciblant les voies moléculaires à laquelle ces cellules dépendent de survie de 2,3. Ces cellules tumorales peuvent être sélectionnées positivement pour pendant le traitement, conduisant à la réapparition de la maladie. Le développement de nouvelles thérapies qui ciblent simultanément différents mécanismes de survie des cellules cancéreuses, soit avant, soit après le choix du traitement à médiation, est donc d&#39;importance clinique. Un niveau élevé d&#39;instabilité du génome et la mutation dans le génome de la tumeur est une caractéristique fondamentale qui distingue les cellules cancéreuses à partir de cellules hôtes non tumorales 4. Par conséquent, un useful stratégie pour augmenter l&#39;efficacité de la chimiothérapie endommageant l&#39;ADN et d&#39;empêcher le développement de la résistance est active pour inhiber la réparation de l&#39;ADN dans les cellules tumorales 5. Ce est un champ actif de l&#39;enquête et une variété de cibles de réparation d&#39;ADN nouveaux sont à l&#39;étude dans un cadre pré-clinique. Un certain nombre de petites molécules ou des inhibiteurs à base antisens-de ces objectifs ont été élaborés et sont en cours de test 6-8. L&#39;objectif est d&#39;identifier les candidats pré-cliniques les plus prometteurs et d&#39;évaluer la sécurité et l&#39;efficacité dans les essais cliniques. Le coût élevé des essais cliniques et le risque d&#39;échec (pour une variété de raisons, y compris l&#39;évaluation pré-clinique sous-optimale) sont de formidables obstacles pour progresser dans le développement de nouvelles thérapies neuf. L&#39;utilisation de modèles appropriées et rigoureuses pré-clinique pour évaluer adéquatement nouvelles cibles thérapeutiques et médicaments candidats peut diminuer le taux d&#39;échec élevé de 10 essais cliniques </sup&gt;. Certaines méthodes précliniques couramment utilisés pour évaluer l&#39;efficacité des thérapies anticancéreuses sont les suivantes: a) mesure de la capacité à réduire la prolifération des cellules tumorales in vitro (les essais de prolifération cellulaire), b) la réduction induite par un traitement dans la capacité des cellules tumorales à colonies de culture sous forme de tissu (essais de formation de colonie), c) la réduction induite par un traitement dans des cellules tumorales activité métabolique in vitro (transformation de colorant redox), d) induction induit par le traitement d&#39;vitro la mort dans des cellules tumorales (apoptose, nécrose, autophagique, associé avec la mitose et autres) 11, et e) la réduction in vivo de la croissance ou l&#39;ablation de xénogreffes humaines et de souris induite par un traitement de 12 à 14. Une faiblesse majeure des méthodes énumérées in vitro, ce est qu&#39;aucun d&#39;entre eux fournissent évaluation en temps réel et en continu de l&#39;effet de thérapies candidats. Plutôt, ils fournissent des informations sélectionnées, seulement à des points de temps largement séparésau cours du traitement. Ces mesures ont diminué la capacité de refléter avec précision l&#39;ampleur et le calendrier des réponses des cellules tumorales. In vivo des modèles de xénogreffes de souris sont également limitées par le coût élevé, la longueur de temps pour terminer, et le risque de dosage et de traitement synchronisation sous-optimale (ordonnancement). En outre, il existe des preuves que les modèles rongeurs de xénogreffes sont des prédicteurs limitées d&#39;efficacité clinique chez l&#39;homme, par rapport à l&#39;évaluation in vitro de réponses des cellules primaires de tumeurs humaines et établies des lignées de cellules tumorales humaines à des interventions thérapeutiques candidats 15,16. Nous avons conçu un nouveau protocole de combinaison pour évaluer de nouvelles combinaisons de médicaments pré-clinique, d&#39;une manière qui répond aux faiblesses des procédures plus communs énumérés ci-dessus. A la place de la prolifération, la formation de colonies, ou de colorant redox essais de conversion, nous avons utilisé un appareil de mesure du métabolisme d&#39;analyser l&#39;adhérence cellulaire, la respiration, et l&#39;acidification en temps réelau cours de la période de traitement 17. En même temps, nous avons étudié les effets de la combinaison d&#39;un traitement in vivo par l&#39;utilisation d&#39;un embryon de poulet membrane chorio-allantoïde de modèle (CAM) de l&#39;invasion et de métastase 18,19. Nous avons utilisé ces méthodes pour évaluer la capacité d&#39;un oligonucleotide antisens (ASO) ciblage BRCA2 pour potentialiser l&#39;efficacité du cisplatine médicament chimiothérapeutique couramment utilisé.

<table><tbody><tr><td>Cellules A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx</td></tr><tr><td>film AeraSeal</td><td>Carl Roth GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMEM</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>210-011-QK</td><td></td></tr><tr><td>Oligodésoxynucléotides antisens</td><td>Avecia</td><td></td><td>BRCA2 séquence cible : 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 )</td></tr><tr><td>Axio Zoom V16 Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html</td></tr><tr><td>Bionas Bionas</td><td>Bionas GmbH et Micronas GmbH</td><td>BIS8001D</td><td></td></tr><tr><td>Bionas Discovery 2500 System&nbsp ;</td><td>Bionas GmbH</td><td></td><td>http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/</td></tr> <tr><td>Cisplatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Œufs de poule fécondés</td><td>D’origine locale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal&nbsp ;</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp ;</td><td>Invitrogen - Life Technologies&nbsp ;</td><td>12566014</td><td>http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (0,25 %)/EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de l&#39;efficacité des médicaments contre le cancer sensibilisation<em&gt; in vitro</em&gt; et<em&gt; in vivo</em

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

En raison du niveau élevé de l&#39;hétérogénéité et de mutations inhérentes dans les cancers humains, les thérapies d&#39;agents simples ou les traitements d&#39;association qui ciblent la même voie, sont susceptibles d&#39;échouer. L&#39;accent doit être mis sur l&#39;inhibition des voies qui sont responsables de la résistance intrinsèque et / ou d&#39;adaptation à la thérapie. Un champ actif de l&#39;enquête est le développement et les tests d&#39;inhibiteurs de réparation d&#39;ADN qui favorisent l&#39;action de, et empêchent la résistance à, couramment utilisé chimiothérapie et la radiothérapie. Nous avons utilisé un protocole selon l&#39;invention pour évaluer l&#39;efficacité de l&#39;inhibition de BRCA2 en tant que moyen de sensibiliser les cellules tumorales à la cisplatine préjudiciable de médicaments de l&#39;ADN. le métabolisme des cellules de la tumeur (acidification et la respiration) a été surveillé en temps réel pendant une période de 72 h à délimiter l&#39;efficacité du traitement sur une base minute par minute. En combinaison, nous avons effectué une évaluation de la fréquence métastatique utilisant une membrane chorioallantoïque d&#39;embryon de poulet (CAM) de modèle d&#39;extravasation et l&#39;invasion. Cetteprotocole répond à certaines des faiblesses des couramment utilisés in vitro et in vivo de méthodes pour évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques du cancer. Il peut être utilisé en plus des méthodes communes telles que des tests de prolifération cellulaire, les tests de la mort cellulaire, et les études in vivo de xénogreffes de souris, de discriminer davantage parmi les cibles et agents candidats, et ne choisissez que les candidats les plus prometteurs pour la poursuite du développement.

Résultats et chiffres adaptés avec la permission de travaux publiés 22. BRCA2 inhibition induit une diminution de la respiration dans les cellules tumorales traitées au cisplatine Les cellules humaines de cancer du poumon A549 traitées avec BRCA2 ciblage ASO et le cisplatine exposé une baisse anticipée et irréversible dans la respiration, par rapport aux cellules qui ont reçu commande ASO et cisplatine seul; après 24 h de traitement par le cis...

Ici, la surveillance en temps réel du métabolisme des cellules tumorales, combinée à un modèle in vivo de métastases à membrane chorio-allantoïde (CAM) d’embryon de poulet, est utilisée pour évaluer de nouvelles cibles/agents anticancéreux pour leur capacité à sensibiliser les cellules tumorales aux chimiothérapies endommageant l’ADN.

Évaluation de l&#39;efficacité des médicaments contre le cancer Sensibilisation<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer l’efficacité de la sensibilisation aux médicaments anticancéreux en mesurant les changements dans le métabolisme cellulaire in vitro et la fréquence métastatique in vivo. Ceci est réalisé en transectant d’abord des cellules cancéreuses in vitro avec des molécules antisens pour abattre la cible d’intérêt. Ensuite, les cellules transfectées sont plaquées sur des puces de biocapteurs et chargées dans un système de mesure du métabolisme pour énumérer les changements dans l’acidification, la respiration et l’adhésion pendant le traitement médicamenteux.Séparément, les cellules transfectées sont traitées avec un médicament et injectées dans la circulation veineuse d’un embryon de poulet afin d’évaluer les effets sur la fréquence métastatique. Les résultats montrent une sensibilisation aux médicaments anticancéreux illustrée par des changements dans le métabolisme cellulaire et la fréquence des métastatiques. Cette technique prolonge le développement de la thérapie anticancéreuse car elle permet l’évaluation simultanée de paramètres qui ne sont pas toujours pris en compte lors des tests précliniques conventionnels de cibles ou de composés médicamenteux.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur de nouvelles cibles médicamenteuses impliquées dans la réparation de l’ADN, elle peut également être appliquée à la validation de cibles dans d’autres systèmes tels que le contrôle du cycle cellulaire. Après avoir tranecté des cellules tumorales avec des oligonucléotides antisens, selon le protocole textuel dans un environnement stérile, utilisez 400 microlitres de PBS pour laver soigneusement six puces de biocapteur Pour stériliser les puces, retirez le PBS et ajoutez 400 microlitres d’éthanol à 70 % incubez pendant 20 minutes avant d’utiliser le PBS pour laver les puces trois fois. Placez trois puces chacune dans des boîtes de culture stériles, étiquetées comme témoin et cible d’intérêt, et étiquetez deux tubes de 50 millilitres de la même manière.Ensuite, utilisez du PBS pour laver les cellules transfectées avant d’ajouter un volume approprié de 0,25 % de trypsine EDTA, attendez que la monocouche se détache et transférez la suspension cellulaire dans le tube approprié. Après avoir compté les cellules, ajustez le volume pour atteindre une concentration finale de 6,0 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre en ajoutant du milieu ou en concentrant les cellules. En préparant un groupe à la fois, ajoutez 250 microlitres de solution cellulaire à chaque puce de biocapteur.Placez les boîtes stériles contenant les copeaux à l’intérieur d’une chambre d’humidité pour éviter l’évaporation et incubez pendant la nuit pour effectuer des mesures de métabolisme en suivant le schéma expérimental détaillé dans le protocole de texte, étiquetez des tubes de 1450 millilitres et ajoutez 50 millilitres de croissance, milieu plus 0,2 % FBS et une x pénicilline et streptomycine. Ou PS. Placez six tubes dans un système de mesure du métabolisme, six dans un autre et le tube restant dans un troisième rack de tubes contenant également des tubes contenant du cisplatine. Utilisez une membrane perméable à l’air pour sceller les deux premiers paniers afin d’éviter l’évaporation.Ensuite, préparez un volume approprié de six micromolaires de cisplatine dans un milieu avec 0,2 % de FBS et un XPS. Répartissez le volume requis de fluide dans quatre tubes de 50 millilitres étiquetés et remettez-les dans les quatre fentes du troisième support de tube de mesure du métabolisme. Utilisez une membrane perméable à l’air pour sceller les tubes.Étiquetez six tubes de 50 millilitres et ajoutez 20 millilitres à chacun des 0,1 % de solution Triton X En moyenne, la solution Triton X reposera sur toutes les cellules restantes et fournira une valeur nulle pour chaque puce. Placez les tubes dans un quatrième support de tubes et fermez-les. Chargez ensuite les puces dans les modules bio.Chargez les deux bracks dans le support à deux bracks, puis lancez l’expérience. Après avoir préparé les embryons de poulet comme indiqué dans le protocole textuel le deuxième jour de la transfection cellulaire, subdivisez les groupes témoins et cibles en deux flacons pour le véhicule et deux pour le cisplatine. Aspirez le milieu et utilisez soit trois millilitres de cisplatine frais, moyen ou moyen avec six micromolaires de cisplatine pour reconstituer.Les flacons incubent pendant six heures. Après l’incubation, aspirez le milieu, puis lavez et essayez d’aniser les cellules, transférez la suspension cellulaire dans quatre tubes de 15 millilitres étiquetés de manière appropriée avant de tourner et d’utiliser du PBS pour laver trois fois les cellules en résine. Ensuite, après le comptage, utilisez le PBS pour diluer ou la centrifugation pour concentrer les cellules à une concentration finale de 1,0 fois 10 à la sixième cellule par millilitre.Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de cinq millilitres étiquetés pour l’injection et placez-la sur de la glace. Ensuite, mettez de côté 24 embryons de poulet âgés de 9 jours pour une injection sous un stéréomicroscope et à l’aide d’une aiguille en verre fixée à un tube flexible relié à une seringue d’un millilitre avec un mouvement de pulsation lente. Injecter 1,0 fois 10 à la cinquième cellules d’un volume de 100 microlitres dans la circulation veineuse de la membrane choïque ou cam avec une lingette douce.Tamponnez doucement le site d’injection pour endiguer l’écoulement du sang et absorber tout déversement d’effet. Étiquetez chaque contenant d’embryons de manière appropriée après chaque injection au microscope fluorescent. Confirmer la présence et la distribution de cellules fluorescentes dans le système vasculaire de la came.Prenez note de tous les embryons dans lesquels le nombre de cellules tumorales semble faible ou la distribution est mauvaise. Enfin, placez les embryons de poulet dans une chambre d’humidité et incubez pendant sept à neuf jours avant d’énumérer les foyers métastatiques comme indiqué dans le protocole de texte comme indiqué ici après 24 heures de vie humaine, A 5 49 cellules cancéreuses du poumon traitées avec BRCA deux ciblant un SO et le cisplatine ont montré une diminution précoce et irréversible de la respiration par rapport aux cellules qui ont reçu un SO témoin et du cisplatine seul. La diminution de 39 % par rapport aux cellules témoins traitées a commencé environ 10 heures avant une baisse détectable de l’adhésion cellulaire, ce qui suggère qu’elle s’est produite indépendamment des changements du nombre de cellules et qu’il peut s’agir d’un événement formateur qui précède la mort cellulaire, comme démontré ici.Aucune différence d’acidification n’a été observée au cours de l’expérience de 72 heures, ce qui suggère que le traitement par BRCA, deux, un SO et le cisplatine avaient peu ou pas d’effet sur le métabolisme du glucose. Dans cette expérience, des cellules cancéreuses du poumon humaines A 5 49 ont été traitées avec un SO témoin ou BRCA deux A SO en présence ou en absence de cisplatine et injectées dans la circulation veineuse de la came. Neuf jours plus tard, les cellules traitées avec BRCA deux a SO et cisplatine présentaient une fréquence de foyers métastatiques inférieure de 77 % par rapport aux cellules traitées avec le contrôle a SO et le cisplatine ou BRCA deux A SSO seuls, ce qui suggère que le traitement par BRCA deux a SO et cisplatine a le potentiel de diminuer ou de prévenir la charge métastatique chez les patients atteints de tumeurs solides.À la suite de cette procédure, des méthodes plus traditionnelles telles que la prolifération cellulaire, les tests et les études de xénogreffes in vivo peuvent être effectuées afin d’explorer davantage la contribution d’une cible particulière à l’amélioration de la sensibilité aux médicaments.

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La résistance aux médicaments à thérapies ciblées est très répandue et la nécessité d'identifier les mécanismes de résistance - avant ou après l'apparition des symptômes - est essentiel pour guider les stratégies alternatives de gestion clinique. Ici, nous présentons un protocole de coupler dérivation de lignées résistantes aux médicaments in vitro avec le séquençage d'accélérer la découverte de ces mécanismes.

Implémentation de<em&gt; In Vitro</em&gt; Résistance au médicament Essais: Maximiser le potentiel pour découvrir cliniquement importants mécanismes de résistance

Nous décrivons un test de sensibilité aux médicaments à haut débit pour les cellules primaires du myélome multiple. Il s’agit d’une reconstruction du microenvironnement de la moelle osseuse (y compris la matrice extracellulaire et le stroma) dans des plaques multi-puits, et d’une méthode non invasive de quantification longitudinale de la viabilité cellulaire.

Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

Le présent rapport résume un protocole qui peut être utilisé pour modéliser l’influence de la niche du microenvironnement de la moelle osseuse sur les cellules leucémiques en mettant l’accent sur l’enrichissement de la sous-population la plus chimiorésistante.

Modélisation chimiothérapie leucémie résistant<em&gt; In Vitro</em

L'objectif de ce protocole est d'évaluer la spécificité des médicaments anticancéreux in vitro en utilisant des cultures mixtes contenant des cellules tumorales à la fois et non tumorales.

Évaluation Spécificité de Anticancer Drugs<em&gt; In vitro</em

Nous présentons un modèle tridimensionnel (3D) de cancer du poumon basé sur un échafaudage biologique de collagène pour étudier la sensibilité aux thérapies ciblant le cancer du poumon à petites cellules (NSCLC). Nous démontrons différentes techniques de lecture pour déterminer l’indice de prolifération, l’apoptose et l’état de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Les données collectées sont intégrées dans un modèle in silico pour la prédiction de la sensibilité aux médicaments.

Un tissu combiné 3D Conçu<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor modèle de prévision de l&#39;efficacité des médicaments dans le Fond mutationnelles spécifiques

On décrit une méthode in vitro pour l’établissement de double résistance à l’EGFR-TKI et un MET-TKI dans les cellules cancéreuses. Cette méthode est utile pour développer des traitements pour les patients présentant des mutations-EGFR, qui montrent la progression de la maladie malgré un traitement EGFR-TKI avec MET-amplification. Il peut également être modifiée pour inhibiteurs ciblant d’autres molécules.

Établissant double résistance à l’EGFR-TKI et rencontré-TKI dans le poumon adénocarcinome cellules In Vitro avec une procédure d’augmentation de la Dose 2-step

Ce protocole décrit comment évaluer les synergies entre un anticorps anticancéreux et médicaments anticancéreux dans les modèles précliniques en utilisant l’équation d’indice de combinaison de Chou et Talalay.

Potentialisation des anticorps anticancéreux efficacité par les médicaments anticancéreux : détection des anticorps-médicament synergie à l’aide de l’équation d’indice de combinaison

Nous décrivons ici une méthode de culture in vitro de co aux cellules de T de tumeur ciblée de défi de manière récursive, qui permet une analyse phénotypique et fonctionnelle de l’activité antitumorale des lymphocytes T.

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Ce manuscrit décrit comment évaluer l’immunogénicité in vivo des vésicules extracellulaires dérivées de cellules tumorales (VE) à l’aide de la cytométrie en flux. Les VE dérivés de tumeurs subissant une mort cellulaire immunogène induite par le traitement semblent particulièrement pertinents dans l’immunosurveillance tumorale. Ce protocole illustre l’évaluation des VE des tumeurs immunostimulantes induites par l’oxaliplatine, mais peut être adapté à divers contextes.

In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Ce protocole décrit une évaluation standardisée des sensibilités médicamenteuses aux inhibiteurs de signalisation ciblés dans des modèles organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC.

Profilage de la sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC mutants EGFR

Ce protocole présente un ensemble d’expériences adoptées pour l’évaluation de peptides anticancéreux photocommutables, qui peuvent être utilisés dans le criblage préclinique de tels composés. Cela comprend l’évaluation de la cytotoxicité dans des cultures cellulaires 2D et 3D, l’évaluation de l’efficacité de la photoisomérisation ex vivo (tissu modèle) et l’efficacité in vivo .

Évaluation in vitro et in vivo de composés biologiquement actifs photocontrôlés - candidats médicaments potentiels pour la photopharmacologie du cancer

Découvrez une méthode d'évaluation de la sensibilisation aux médicaments anticancéreux en mesurant le métabolisme cellulaire in vitro et la fréquence métastatique in vivo. Cette approche utilise un modèle d'embryon de poulet pour valider de nouvelles cibles thérapeutiques.

Évaluation de l'efficacité des médicaments contre le cancer Sensibilisation

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