Évaluation de l'efficacité des médicaments contre le cancer Sensibilisation

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer l’efficacité de la sensibilisation aux médicaments anticancéreux en mesurant les changements dans le métabolisme cellulaire in vitro et la fréquence métastatique in vivo. Ceci est réalisé en transectant d’abord des cellules cancéreuses in vitro avec des molécules antisens pour abattre la cible d’intérêt. Ensuite, les cellules transfectées sont plaquées sur des puces de biocapteurs et chargées dans un système de mesure du métabolisme pour énumérer les changements dans l’acidification, la respiration et l’adhésion pendant le traitement médicamenteux.

Séparément, les cellules transfectées sont traitées avec un médicament et injectées dans la circulation veineuse d’un embryon de poulet afin d’évaluer les effets sur la fréquence métastatique. Les résultats montrent une sensibilisation aux médicaments anticancéreux illustrée par des changements dans le métabolisme cellulaire et la fréquence des métastatiques. Cette technique prolonge le développement de la thérapie anticancéreuse car elle permet l’évaluation simultanée de paramètres qui ne sont pas toujours pris en compte lors des tests précliniques conventionnels de cibles ou de composés médicamenteux.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur de nouvelles cibles médicamenteuses impliquées dans la réparation de l’ADN, elle peut également être appliquée à la validation de cibles dans d’autres systèmes tels que le contrôle du cycle cellulaire. Après avoir tranecté des cellules tumorales avec des oligonucléotides antisens, selon le protocole textuel dans un environnement stérile, utilisez 400 microlitres de PBS pour laver soigneusement six puces de biocapteur Pour stériliser les puces, retirez le PBS et ajoutez 400 microlitres d’éthanol à 70 % incubez pendant 20 minutes avant d’utiliser le PBS pour laver les puces trois fois. Placez trois puces chacune dans des boîtes de culture stériles, étiquetées comme témoin et cible d’intérêt, et étiquetez deux tubes de 50 millilitres de la même manière.

Ensuite, utilisez du PBS pour laver les cellules transfectées avant d’ajouter un volume approprié de 0,25 % de trypsine EDTA, attendez que la monocouche se détache et transférez la suspension cellulaire dans le tube approprié. Après avoir compté les cellules, ajustez le volume pour atteindre une concentration finale de 6,0 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre en ajoutant du milieu ou en concentrant les cellules. En préparant un groupe à la fois, ajoutez 250 microlitres de solution cellulaire à chaque puce de biocapteur.

Placez les boîtes stériles contenant les copeaux à l’intérieur d’une chambre d’humidité pour éviter l’évaporation et incubez pendant la nuit pour effectuer des mesures de métabolisme en suivant le schéma expérimental détaillé dans le protocole de texte, étiquetez des tubes de 1450 millilitres et ajoutez 50 millilitres de croissance, milieu plus 0,2 % FBS et une x pénicilline et streptomycine. Ou PS. Placez six tubes dans un système de mesure du métabolisme, six dans un autre et le tube restant dans un troisième rack de tubes contenant également des tubes contenant du cisplatine. Utilisez une membrane perméable à l’air pour sceller les deux premiers paniers afin d’éviter l’évaporation.

Ensuite, préparez un volume approprié de six micromolaires de cisplatine dans un milieu avec 0,2 % de FBS et un XPS. Répartissez le volume requis de fluide dans quatre tubes de 50 millilitres étiquetés et remettez-les dans les quatre fentes du troisième support de tube de mesure du métabolisme. Utilisez une membrane perméable à l’air pour sceller les tubes.

Étiquetez six tubes de 50 millilitres et ajoutez 20 millilitres à chacun des 0,1 % de solution Triton X En moyenne, la solution Triton X reposera sur toutes les cellules restantes et fournira une valeur nulle pour chaque puce. Placez les tubes dans un quatrième support de tubes et fermez-les. Chargez ensuite les puces dans les modules bio.

Chargez les deux bracks dans le support à deux bracks, puis lancez l’expérience. Après avoir préparé les embryons de poulet comme indiqué dans le protocole textuel le deuxième jour de la transfection cellulaire, subdivisez les groupes témoins et cibles en deux flacons pour le véhicule et deux pour le cisplatine. Aspirez le milieu et utilisez soit trois millilitres de cisplatine frais, moyen ou moyen avec six micromolaires de cisplatine pour reconstituer.

Les flacons incubent pendant six heures. Après l’incubation, aspirez le milieu, puis lavez et essayez d’aniser les cellules, transférez la suspension cellulaire dans quatre tubes de 15 millilitres étiquetés de manière appropriée avant de tourner et d’utiliser du PBS pour laver trois fois les cellules en résine. Ensuite, après le comptage, utilisez le PBS pour diluer ou la centrifugation pour concentrer les cellules à une concentration finale de 1,0 fois 10 à la sixième cellule par millilitre.

Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de cinq millilitres étiquetés pour l’injection et placez-la sur de la glace. Ensuite, mettez de côté 24 embryons de poulet âgés de 9 jours pour une injection sous un stéréomicroscope et à l’aide d’une aiguille en verre fixée à un tube flexible relié à une seringue d’un millilitre avec un mouvement de pulsation lente. Injecter 1,0 fois 10 à la cinquième cellules d’un volume de 100 microlitres dans la circulation veineuse de la membrane choïque ou cam avec une lingette douce.

Tamponnez doucement le site d’injection pour endiguer l’écoulement du sang et absorber tout déversement d’effet. Étiquetez chaque contenant d’embryons de manière appropriée après chaque injection au microscope fluorescent. Confirmer la présence et la distribution de cellules fluorescentes dans le système vasculaire de la came.

Prenez note de tous les embryons dans lesquels le nombre de cellules tumorales semble faible ou la distribution est mauvaise. Enfin, placez les embryons de poulet dans une chambre d’humidité et incubez pendant sept à neuf jours avant d’énumérer les foyers métastatiques comme indiqué dans le protocole de texte comme indiqué ici après 24 heures de vie humaine, A 5 49 cellules cancéreuses du poumon traitées avec BRCA deux ciblant un SO et le cisplatine ont montré une diminution précoce et irréversible de la respiration par rapport aux cellules qui ont reçu un SO témoin et du cisplatine seul. La diminution de 39 % par rapport aux cellules témoins traitées a commencé environ 10 heures avant une baisse détectable de l’adhésion cellulaire, ce qui suggère qu’elle s’est produite indépendamment des changements du nombre de cellules et qu’il peut s’agir d’un événement formateur qui précède la mort cellulaire, comme démontré ici.

Aucune différence d’acidification n’a été observée au cours de l’expérience de 72 heures, ce qui suggère que le traitement par BRCA, deux, un SO et le cisplatine avaient peu ou pas d’effet sur le métabolisme du glucose. Dans cette expérience, des cellules cancéreuses du poumon humaines A 5 49 ont été traitées avec un SO témoin ou BRCA deux A SO en présence ou en absence de cisplatine et injectées dans la circulation veineuse de la came. Neuf jours plus tard, les cellules traitées avec BRCA deux a SO et cisplatine présentaient une fréquence de foyers métastatiques inférieure de 77 % par rapport aux cellules traitées avec le contrôle a SO et le cisplatine ou BRCA deux A SSO seuls, ce qui suggère que le traitement par BRCA deux a SO et cisplatine a le potentiel de diminuer ou de prévenir la charge métastatique chez les patients atteints de tumeurs solides.

À la suite de cette procédure, des méthodes plus traditionnelles telles que la prolifération cellulaire, les tests et les études de xénogreffes in vivo peuvent être effectuées afin d’explorer davantage la contribution d’une cible particulière à l’amélioration de la sensibilité aux médicaments.