Le lymphatiques mésentériques Duct Cannulated Rat Modèle: application à l'évaluation des lymphatique intestinale transport des médicaments

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la vitesse et l'ampleur du transport des lipides et des médicaments vers le système lymphatique intestinal après administration intestinale. Cela est réalisé en isolant et en canulant d'abord le canal lymphatique mésentérique afin de recueillir la lymphe. Dans une deuxième étape, le duodénum est canulé pour permettre l'infusion dans l'intestin, puis l'artère carotide est canulée afin de prélever des échantillons sanguins.

Dans la dernière étape, le traitement expérimental est administré dans le duodénum et la lymphe ainsi que le sang sont recueillis afin de quantifier les concentrations systémiques de lipides ou de médicaments. En fin de compte, ce modèle peut être utilisé pour évaluer l'absorption totale et le transport lymphatique intestinal des lipides et des médicaments après administration intestinale. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de canuler directement le canal lymphatique mésentérique et de recueillir la lymphe pendant toute la durée de l'expérience.

Ceci permet d'estimer la masse absolue de matière qui pénètre et circule dans la lymphe mésentérique. In vivo, bien que ce modèle permette l'évaluation in vivo du transport de médicaments et de lipides, il peut également être utilisé pour mesurer le transport lymphatique intestinal de tout facteur d'intérêt, ainsi que les modifications du transport lymphatique de ces facteurs en réponse à diverses contraintes ou à différents états pathologiques.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la canulation du canal lymphatique mésentérique est une procédure complexe et délicate en raison de la petite taille du canal, de sa fragilité et du jeûne des animaux. La démonstration transparente de la procédure sera assurée par mon collègue et membre du corps professoral de l'Université Monash, le Dr Natalie Cus, ainsi que par un postdoctorant senior du groupe, le Dr LJ Hugh. La veille de l'intervention chirurgicale, coupez les canules à la longueur appropriée et utilisez une lame chirurgicale stérile pour réaliser un biseau à l'extrémité de chaque morceau de tubulure. Ensuite, pour préparer la canule intraduodénale, faites reboucler la canule sur elle-même, puis chauffez-la afin de créer un point d'ancrage dans la tubulure.

Le jour de l'intervention chirurgicale, raser les poils du côté droit de l'abdomen, du cou et de la région de la clavicule gauche d'un rat adulte anesthésié, puis nettoyer les zones chirurgicales de manière aseptique à l'aide de trois frictions successives à la solution de povidone-iodée et à l'éthanol à 70 % afin de canuler le canal lymphatique. Placer l'animal sur le côté droit, face vers le haut, et utiliser une lame de scalpel stérile pour ouvrir la couche superficielle de la paroi musculaire abdominale par une incision droite de quatre centimètres, s'étendant du processus xiphoïde au flanc droit, environ deux centimètres en dessous de la marge costale. Rétracter l'intestin grêle sous la paroi abdominale gauche et utiliser deux à trois morceaux de gaze stérile imprégnés de sérum physiologique pour le maintenir en place.

Ensuite, placez le rat au-dessus d'une seringue en plastique de 10 millilitres positionnée horizontalement sous le dos de l'animal au niveau du rein droit. Pour faciliter la visualisation du canal lymphatique mésentérique, repérez le canal lymphatique mésentérique supérieur, d'un diamètre d'environ 0,5 à un millimètre, perpendiculaire au rein droit, et immédiatement rostral et parallèle à l'artère mésentérique pulsatile de couleur rouge foncé. Notez que chez les rats non jeûnes, comme illustré ici, le canal lymphatique mésentérique supérieur est blanc, opaque et plus facile à visualiser que chez les rats infestés.

Ensuite, passez une paire de forceps droits à travers le lit de tissu adipeux périnéal au niveau de la marge inférieure du rein droit, parallèlement au canal lymphatique mésentérique supérieur, et à travers les couches de tissu conjonctif situées immédiatement sous la veine cave. Puis, à l’aide de la pointe des forceps, faites passer la canule lymphatique à travers le lit de tissu adipeux périnéal, une extrémité étant placée immédiatement adjacente au canal lymphatique mésentérique, l’autre étant extériorisée de l’animal au niveau du rein droit. Ensuite, à l’aide d’un microscope chirurgical et de forceps de bijoutier, isolez le canal lymphatique mésentérique à travers les couches superficielles de tissu conjonctif et de tissu adipeux par une dissection émoussée, en commençant par l’extrémité inférieure, en prenant soin de ne pas endommager le canal lymphatique une fois qu’il est isolé.

Utilisez la pointe de la pince à pointe fine pour faire un petit trou dans le canal lymphatique. Après vous être assuré que la canule lymphatique est complètement remplie de solution anticoagulante et ne contient aucune bulle d'air, utilisez une petite paire de pinces pour insérer la canule lymphatique d'environ deux à quatre millimètres à l'intérieur du canal lymphatique mésentérique par la ponction. Si la canulation est réussie, un écoulement progressif de lymphe intestinale sera observé à partir de l'extrémité libre de collecte de la canule.

Lorsque cela se produit, déposer une petite goutte de colle de cyanoacrylate sur l'orifice d'entrée du canal lymphatique afin de fixer la canule, en prenant soin de ne pas obstruer le vaisseau avec un excès de colle pour canuler le duodénum. Tout d'abord, repérer le tissu correspondant à la section rose vif de l'intestin grêle ; en tirant doucement vers le bas, on met en évidence l'estomac. Ensuite, utiliser une aiguille stérile de calibre 23 pour pratiquer un petit trou de ponction dans le duodénum au niveau du pylore, à environ deux centimètres en dessous de la jonction entre l'estomac et le duodénum.

Ensuite, insérez l'extrémité en forme de crochet du cathéter duodénal à travers la perforation et fixez le cathéter en place à l'aide d'une goutte de colle acrylique Sano. Puis, utilisez des points de suture pour fermer l'incision de la paroi musculaire abdominale. La canulation de l'artère carotide peut être réalisée avant ou après la canulation du canal lymphatique mésentérique. Nous préférons généralement canuler l'artère carotide avant la canulation du canal lymphatique, afin de réduire le risque de déloger le cathéter lymphatique lors du déplacement de l'animal. Pour canuler l'artère carotide, marquez d'abord le cathéter de l'artère carotide à 2,5 centimètres du bout biseauté afin d'identifier la portion du tube à insérer dans l'artère.

Ensuite, reliez l'extrémité non biseautée de la canule à une aiguille de 25 gauge fixée à une seringue remplie de solution anticoagulante, puis remplissez la canule avec cette solution, en veillant à ce qu'aucun espace d'air ne soit présent. Puis, pratiquez une incision longitudinale d'un à 1,5 centimètre à travers la couche cutanée au-dessus du côté gauche de la trachée dans le plan sagittal, puis utilisez une pince à extrémité émoussée pour disséquer le tissu conjonctif sous-cutané et exposer les muscles cervicaux appariés situés en profondeur. Écartez les muscles cervicaux pour faire apparaître l'artère carotide gauche pulsatile, située à environ un centimètre sous la surface de la peau.

Ensuite, nettoyer le tissu conjonctif recouvrant l'artère par une dissection émoussée et utiliser des pinces à tissus effilées pour isoler une section d'environ un centimètre de l'artère. Puis, utiliser des pinces fines pour passer deux fils de soie sous l'artère carotide, en les positionnant à chaque extrémité de la section isolée. Ensuite, nouer le fil le plus éloigné du cœur et de la clavicule du rat, et placer une paire de pinces fines droites sous la carotide afin d'occlure le flux sanguin à travers l'artère.

À l’aide de ciseaux iris à pointe fine, pratiquez maintenant une petite incision sur la surface supérieure de l’artère, à environ un tiers de la distance depuis le haut de la zone isolée. Insérez la pointe de la canule dans l’artère à l’aide d’une pince courbe. Une fois insérée, retirez la pince droite à pointe fine, occluez le flux sanguin et avancez la canule de 2,5 centimètres dans l’artère en utilisant deux paires de pinces.

Un pour maintenir la canule à l'intérieur de l'artère afin d'empêcher le sang de refluer, et l'autre pour insérer la canule. Ensuite, utiliser une pince artérielle de petite taille pour maintenir la canule à l'intérieur de l'artère. Injecter une solution anticoagulante dans la canule, puis aspirer légèrement une petite quantité de sang pour confirmer la perméabilité du tube.

Ensuite, rincer la canule avec une solution anticoagulante et sceller l'extrémité à l'aide de la flamme d'un briquet. Enfin, utiliser les fils de suture pour fixer la canule en place et retirer le clamp artériel. Puis placer un troisième point de suture autour de l'artère et de la canule, raccourcir les fils de suture autour de l'artère et fermer la plaie du cou avec des points de suture supplémentaires ; après la période de récupération, injecter une formulation d'intérêt dans l'animal par l'intermédiaire de la canule duodénale.

Comme illustré sur le graphique après l'administration du modèle, le médicament lipophile halal fanene, le débit moyen du flux lymphatique chez les rats correctement cannelés était compris entre 0,4 et 1,3 millilitre par heure. Chez certains animaux, le débit lymphatique était légèrement inférieur durant les première à troisième heures suivant la canulation, avant d'augmenter, un phénomène couramment observé après une canulation lymphatique réussie chez les rats mal cannelés. Toutefois, le débit reste nettement plus faible que celui observé dans les expériences réussies tout au long de la période de collecte.

De même, dans ces expériences représentatives, le transport lymphatique cumulatif du triglycéride et du RIN halal était nettement plus faible chez les animaux mal canulés. Alors que dans les groupes correctement canulés, le transport cumulatif halalan moyen était de 15,1 % de la dose et le transport cumulatif de triglycérides s'élevait à 61 milligrammes sur 10 heures. Dans cette expérience représentative de transport des lipides, la proportion de la dose lipidique exogène marquée au radio-isotope transportée dans la lymphe était de 54 %. Ces valeurs ne différaient pas de manière significative de celles observées précédemment.

Pour une formulation similaire, la vitesse de transport des triglycérides et des médicaments vers la lymphe atteint un maximum peu de temps après l'administration des lipides et du médicament, puis revient à des niveaux de base. Comme c'est habituel dans les expériences sur le transport intestinal lymphatique des lipides et des médicaments. La vitesse de transport du médicament dans la lymphe au cours de chaque période de temps reflète ce phénomène observé pour le transport des triglycérides, puisque le médicament est transporté dans la lymphe.

En association avec les lipoprotéines riches en triglycérides. Une fois maîtrisée, la canulation peut être réalisée en moins de 30 minutes si aucune difficulté n'est rencontrée. Après cette procédure, les composants présents dans la lymphe recueillie peuvent être isolés et utilisés pour des expériences supplémentaires, telles que la réinfusion chez des animaux receveurs afin d'évaluer directement leur fonction, leur métabolisme, leur élimination ou leurs profils de distribution. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des techniques permettant d'isoler et de canuler le canal lymphatique mésentérique, l'artère carotide et le duodénum.

Grâce à ces techniques, vous devriez être en mesure d'évaluer le transport de médicaments, de lipides et d'autres facteurs depuis l'intestin à travers et vers la lymphe mésentérique in vivo.