Name: Un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement lactivité protéolytique Granzyme B: hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Découvrez un dosage colorimétrique pour mesurer l'activité protéolytique de la Granzyme B dans des échantillons humains, murins ou rats. Cette méthode spécifique évalue directement l'activité enzymatique via l'hydrolyse du substrat synthétique.

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Ce travail a reçu le soutien de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) par le biais de la subvention HA 6136/1-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche). JAT est soutenu par des subventions de programme et de projet du Conseil national de la santé et de la recherche médicale d’Australie.

NOTE: Les rates ont été dérivées de souris (6-10 semaines d&#39;âge) et toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices en matière d&#39;éthique des animaux du Centre Peter MacCallum Cancer (E486). 1. Préparation des échantillons. <ol><li> Préparation de cellules NK activées souris. <ol><li> Isoler les cellules NK naïfs primaires à partir de suspensions unicellulaires des rates de souris C57BL / 6 ou B6.GrzmB - / - (GZMB gène null) souris par sélection négative en utilisant des kits disponibles dans le commerce. </li><li> Suivez le protocole des fabricants. Brièvement, les cellules magnétiquement étiqueter &quot;non-NK» tels que les cellules T et B, des cellules dendritiques, des granulocytes, des macrophages et des cellules rouges du sang en utilisant des anticorps conjugués à la biotine par rapport à leurs marqueurs de surface spécifiques. Utilisez séparation magnétique avec des perles anti-biotine à épuiser les cellules &quot;non-NK». </li><li> Culture isolée des cellules NK pendant 5-7 jours dans un milieu contenant IL-2 (1000 U / ml) à 700 000 cellules / ml dans des plaques à 24 puitsà 37 &#160; ° C. </li><li> En variante, l&#39;utilisation de 19 cellules T activées, l&#39;antigène CTL primaire restreint OT1 de récepteur de cellule T de souris transgéniques 20, CTL générés dans des cultures mixtes de lymphocytes 21 ou de surnageants de cellules NK activées pour déterminer l&#39;activité de GZMB 19 sécrétée. </li></ol></li><li> Maintien de lignée humaine de cellules NK et l&#39;isolement des cellules NK primaires. <ol><li> Maintenir la leucémie humaine NK (cellules YT) dans Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal. En variante, les cellules NK purifier primaires à partir du sang périphérique de sujets sains et de stimuler pendant 2-3 jours dans un milieu contenant IL-2 à 100 U / ml comme décrit précédemment 22. </li></ol></li><li> Génération de lysats cellulaires. <ol><li> Laver les cellules trois fois dans du PBS (pH 7,4), puis à suspendre Nonidet P-40 tampon de lyse (0,1% de NP-40, 250 mM de NaCl, 25 mM de Hepes, 2,5 mM d&#39;EDTA). Idéalement, lyser un minimum de 5 x 10 6 </sjusqu&#39;à&gt; cellules NK, ou 1 x 10 7 cellules T dans un tampon de 100 pi. Ne pas ajouter des inhibiteurs de protease, comme beaucoup sont des inhibiteurs irréversibles des protéases à sérine, et en particulier tels que les tryptases GZMA. Incuber sur de la glace pendant 20 min, puis sédimenter les noyaux dans une microcentrifugeuse à 15 000 xg pendant 10 min. Jeter le culot nucléaire et transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li></ol></li><li> Déterminer la concentration en protéines des lysats. <ol><li> Utiliser un protocole de choix disponibles dans le commerce tels que, Bradford ou l&#39;acide bicinchoninique (BCA) et déterminer la concentration en protéines. Assurez-vous que la concentration est ~ 2 mg / ml minimum. lysats de conserver à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire (activité de granzyme est stable pendant plusieurs mois à -20 ° C). </li></ol></li></ol> 2. Granzyme B Dosage de l&#39;activité <ol><li> Préparation des réactifs <ol><li> Préparer un mM 10 des substrats (Boc-AAD-S-Bzl ou Ac-IEPD-PNA) dans le DMSO (~ 5 mg / ml) et stocker à -20 &amp; #176; C. Préparer une dilution de travail fraîchement et jeter après chaque jour, que Boc-AAD-S-Bzl hydrolyse partiellement sur le stockage dans le DMSO. </li><li> Préparer un mM 250 du réactif colorimétrique (5,5&#39;-dithio-bis (acide 2-nitrobenzoïque), DTNB) dans le DMSO (0,09 g / ml) et conserver à -20 ° C. Préparer une dilution de travail frais chaque jour. Ce réactif ne est nécessaire que pour les substrats avec des groupes d&#39;indicateurs SBzl, pas ANP. </li><li> Maquillage tampon frais (0,1 M HEPES, 0,05 M de MgCl2, pH 7,3) tous les 2-3 semaines. </li></ol></li><li> Amener DTNB et des substrats synthétiques à température ambiante. Diluer substrats (01:16, par exemple 100 pi de 1,6 ml de tampon) et DTNB (1: 250, par exemple 10 ul dans 2,5 ml de tampon) et bien mélanger. </li><li> Diluer au moins 100 pg de protéine de lysat de chaque échantillon dans un tampon à un volume final de 160 ul. En utilisant une pipette multicanaux ajouter 50 pi par puits en trois exemplaires (~ 33,3 ug / puits) dans un &#39;&#39; U &#39;&#39; vinyl fond de plaque de 96 puits.Inclure un «tampon seulement» commande (également en trois exemplaires). </li><li> Ajouter 100 pi de DTNB diluée au contrôle des échantillons / tampon (omettre cette étape lorsque vous travaillez avec Ac-IEPD-pNA. NOTE: Le clivage de Ac-IEPD-pNA par GZMB libère directement fluorogène pNA (figure 4B). </li><li> Utilisez une pipette multicanaux pour ajouter rapidement 50 pi de substrats dilué à chaque ensemble de trois exemplaires, en commençant avec le tampon, puis tous les contrôles négatifs et de finition avec des échantillons positifs attendus. </li><li> Placer la plaque dans le lecteur de plaque. Mesurer l&#39;activité Asp-ase par hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA dans un lecteur de microplaques à une DO de 405 nm. Utilisez un protocole de dosage cinétique, prendre 25 mesures, toutes les 15 secondes (environ 6 min temps de lecture total). </li><li> Utilisez les lectures d&#39;absorbance générés à chaque point de temps pour calculer manuellement le taux de clivage du substrat si le logiciel du lecteur de plaques ne peut pas générer une valeur pour Vmax. </li></ol> 3. Analyse de Data REMARQUE: Les données générées est présenté comme vitesse maximale, définis comme changement de DO au fil du temps (MOD / min). <ol><li> Pour analyser les données, déterminer le taux maximal de clivage du substrat, qui est calculée à partir du taux de changement d&#39;absorbance. Pour ce faire automatiquement en utilisant le logiciel de lecteur de plaque, qui a généralement cette option. </li><li> Alternativement après avoir vu les parcelles cinétiques de changement d&#39;absorbance, qui sont générées pendant l&#39;essai cinétique sur le lecteur de plaque, sélectionner manuellement les points de données qui donnent la ligne droite plus raide. Pour la plupart des essais, le taux maximum est atteint dans les 2 premières minutes de l&#39;essai. </li><li> Soustraire la valeur de DO initiale de la lecture la plus élevée de OD sur cette ligne droite et diviser par l&#39;intervalle de temps. Transfert des données brutes vers Microsoft Excel / Graph Pad pour l&#39;analyse statistique et l&#39;affichage graphique. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Historiquement, les granzymes ont été identifiées en tant que molécules effectrices clés de lymphocytes cytotoxiques (cellules CTL et NK) capables d&#39;induire une mort par apoptose rapide dans les cellules cibles. Ce est principalement due à l&#39;action de GZMB, qui clivé molécules de substrat cibles au aspartate (D) résidus et a pu activer la cascade des caspases par les deux clivage pro-caspases, ainsi que plusieurs de leurs cibles en aval ainsi. Cependant, il est maintenant reconnu que les GZMB expression ne est p...

Granzymes sont une famille de sérine-protéases présentes dans les lysosomes sécrétoires de cellules tueuses naturelles (cellules NK) et de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) 1. Cinq granzymes différentes existent chez l&#39;homme (A, B, H, K et M), et dix chez les souris (A - G, K, M et N) 2,3. Granzyme A et granzyme B (GZMA, GZMB) sont les plus abondants et ont été largement étudiées dans le contexte humain et de rongeur. La fonction classique de GZMB est l&#39;induction de l&#39;apoptose dans des cellules cibles exécutées en conjonction avec la perforine protéine formant des pores, ce qui permet d&#39;accéder à la granzyme cytosol de la cellule cible 4. Bien que l&#39;expression GZMB est sans équivoque trouvée dans les lymphocytes cytotoxiques, des études récentes se sont penchés sur une variété d&#39;autres types de cellules GZMB exprimant, y compris, mais sans s&#39;y limiter, les kératinocytes 5, basophiles 6, les mastocytes 7, les cellules dendritiques plasmacytoïdes 8, et les cellules B 9, 10.Dans ce contexte, les fonctions de GZMB non apoptotiques ont été révélés allant de participation dans les processus inflammatoires, le remodelage des tissus et d&#39;autres propriétés immunorégulatrices 11-14. Étant donné qu&#39;un rôle biologique plus large a été proposé pour GZMB qu&#39;on ne le pensait, les chercheurs ont besoin d&#39;outils fiables et spécifiques pour sa détection. L&#39;avantage est de GZMB exigence spécifique pour cliver du côté carboxylique de résidus acide aspartique, une propriété unique parmi les serine proteases eucaryotes 15. Souris, humaines et GZMB de rat sont structurellement très similaires, mais la spécificité de substrat étendu de GZMB de souris diffère légèrement de celle de fois humaine et de rat 16, ce qui signifie que certains substrats génériques avec Asp à la borne (P1) peuvent être clivées efficacement par GZMB des trois espèces, alors que d&#39;autres substrats avec des séquences plus complexes amont de P1 peuvent donner des résultats très variables. Dans le passé et li plus récenteterature, ce fait a causé de la confusion et une mauvaise interprétation de la signification biologique de certains résultats expérimentaux considérables, même si soigneusement contrôlée, des études cinétiques ont cherché à corriger la situation 17. Dans cet article, nous avons cherché à illustrer ces points en utilisant deux substrats disponibles dans le commerce, à savoir Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl et N-acétyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilide. Les deux réactifs faire générer différents groupes réactifs après le clivage (un sulfhydryle libre par rapport à un paranitroanilide gratuitement fluorescent), mais cela n&#39;a aucun effet sur le clivage protéolytique. Le protocole décrit est une adaptation moderne d&#39;un protocole très vieux 18, mais devrait aider les enquêteurs à utiliser les différents substrats de GZMB appropriée, tout en fournissant un cadre méthodologique pour détecter l&#39;activité d&#39;autres granzymes, comme GZMA et GzmH.

<table><tbody><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMSB05</td><td>Substrat de Granzyme B (souris et humain)</td></tr><tr><td>Ac-IEPD-pNA&nbsp ;</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMPNA009</td><td>Substrat Granzyme B (uniquement humain)</td></tr><tr><td>N-&#945 ;-CBZ-L-lysine-S-Bzl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3647</td><td>Substrat Granzyme A</td></tr><tr><td>Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SB025</td><td>Substrat Granzyme H</td></tr><tr><td>5,5'-dithio-bis(acide 2-nitrobenzoïque)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td>DTNB, Ellman' s Réactif</td></tr><tr><td>Kit d’isolement de cellules NK II souris</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-892</td><td>Kit de sélection négative</td></tr><tr><td>Kit d’isolement de cellules NK humain</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-657</td><td>Kit de sélection négative</td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Biorad iMark</td><td></td><td>Biorad Microplate Manager Version du logiciel MPM6.3</td></tr><tr><td>Serocluster U-bottom vinyle 96 puits</td><td>Corning, MA, USA</td><td>2797</td><td></td></tr></tbody></table>

un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement l&#39;activité protéolytique granzyme b: hydrolyse de boc-ala-ala-asp-s-bzl

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

La protéase sérine Granzyme B (GzmB) médie l’apoptose des cellules cibles lorsqu’elle est libérée par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) ou les cellules tueuses naturelles (NK). GzmB est le granzyme le plus étudié chez l’homme et la souris et, par conséquent, les chercheurs ont besoin d’outils spécifiques et fiables pour étudier sa fonction et son rôle dans la physiopathologie. Cela nécessite en particulier des tests qui ne reconnaissent pas les protéases telles que les caspases ou d’autres granzymes qui sont structurellement ou fonctionnellement liées. Ici, nous appliquons la préférence de GzmB pour le clivage après des résidus d’acide aspartique dans un dosage colorimétrique utilisant le peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB est la seule protéase à sérine de mammifère capable de cliver ce substrat. Le substrat est clivé avec une efficacité similaire par le GzmB de l’homme, de la souris et du rat, une propriété qui n’est pas partagée par d’autres substrats peptidiques disponibles dans le commerce, même ceux qui sont annoncés comme étant adaptés à cet effet. Ce protocole est démontré à l’aide de lysats non fractionnés de cellules NK activées ou CTL et convient également aux protéases recombinantes générées dans une variété de systèmes procaryotes et eucaryotes, à condition que les contrôles appropriés soient utilisés. Ce test est une méthode très spécifique pour déterminer l’activité pro-apoptotique potentielle des molécules cytotoxiques dans les lymphocytes de mammifères, et de leurs homologues recombinants exprimée par diverses méthodologies.

Le substrat Boc-AAD-S-Bzl est spécifique pour GZMB Le GZMB sérine-protéase est un constituant majeur des lymphocytes cytotoxiques (cellules CTL et NK) et est principalement responsable de l&#39;induction de la mort apoptotique rapide dans les cellules cibles, telles que des cellules infectées par des virus ou transformée. Ce est en grande partie en raison de sa préférence de substrat pour le clivage après certains résidus aspartate spécifiques en protéines sélectionnées, un ...

Nous décrivons un test colorimétrique simple et quantitatif qui mesure spécifiquement l’activité protéolytique de Granzyme B (GzmB) chez l’homme, la souris ou le rat. Ce protocole peut être facilement adapté pour déterminer l’activité protéase d’autres protéases à sérine granulaire par hydrolyse d’autres substrats peptidiques synthétiques avec une séquence de reconnaissance appropriée.

Un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement l&#39;activité protéolytique Granzyme B: hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer l'activité protéolytique de la protéase granzyme B. Cette mesure est réalisée en préparant d'abord un lysat des cellules d'intérêt, puis en ajoutant rapidement le substrat aux échantillons. L'activité du granzyme B est ensuite mesurée par une réaction colorimétrique. En fin de compte, le clivage hautement spécifique de alla alla as s benzo par le granzyme B peut être évalué en fonction de sa spécificité unique pour les résidus d'acide aspartique.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la détection de l'expression de la grand zone B par PCR ou par immunotransfert (Western blot), est que l'hydrolyse du benzyle est spécifique de la grand zone B et indique également que la protéase est active. Pour préparer la cellule, les lysats isolent d'abord les cellules NK primaires à partir de suspensions uniques de splénocytes provenant de souris de type sauvage C57BL/6 ou de souris contrôles nulles pour le gène de la granzyme B, par sélection négative à l'aide de kits disponibles commercialement, conformément aux instructions du fabricant, après activation des cellules. Laver la culture trois fois dans du PBS à vitesse maximale pendant deux à trois secondes, puis resuspendre le culot contenant au minimum 5 millions de cellules NK dans 100 microlitres de tampon de lyse NP-40 sur de la glace pendant 20 minutes.Ensuite, centrifuger le lysat dans une microcentrifugeuse pendant 10 minutes à 15 000 Gs et transférer l'agent surnageant dans un nouveau tube. Après avoir déterminé la concentration en protéines selon le protocole commercial approprié, conserver l'échantillon à une concentration d'au moins environ deux milligrammes par millilitre à moins 20 degrés Celsius afin d'effectuer un dosage de l'activité de la granzyme B. Ensuite, diluer au minimum 100 microgrammes de lysat protéique par échantillon dans du tampon HEPES fraîchement préparé jusqu'à un volume final de 160 microlitres.Ensuite, à l’aide d’une pipette multipuits, déposer 50 microlitres d’échantillon par puits en triplets dans une plaque de 96 puits en vinyle à fond en U. En prenant soin d’inclure trois puits témoins contenant uniquement du tampon, ajouter 100 microlitres de DTNB dilué à chacun. Puis ajouter rapidement 50 microlitres de substrat de benzoyl d’alala asks s fraîchement dilué aux puits contenant uniquement le tampon, suivis des éventuels témoins négatifs, et terminer par les échantillons positifs attendus.Mesurez l'activité de l'ase en suivant l'hydrolyse de l'AlaAla-As-Bzl à l'aide d'un lecteur de microplaques, à une densité optique de 405 nanomètres, selon un protocole de dosage cinétique effectuant 25 lectures toutes les 15 secondes. Enfin, utilisez le logiciel du lecteur de microplaques pour calculer la vitesse maximale de clivage du substrat pour chaque puits, puis transférez les données brutes vers le logiciel approprié d'analyse statistique en utilisant des souris transgéniques invalidées pour le gène de la granzyme. Il a été démontré que le substrat peptidique synthétique AlaAla-As-Bzl est spécifiquement hydrolysé par la granzyme B. Une hydrolyse plus robuste du substrat synthétique peut être mesurée dans des lysats cellulaires provenant de cellules NK primaires de type sauvage, mais pas dans les cellules NK provenant d'animaux invalidés pour la granzyme B, utilisés comme contrôle.Dans cette expérience, l'activité protéolytique de la granzyme A, qui possède une spécificité de substrat semblable à celle de la trypsine et est présente dans les lysats des deux types de cellules, était équivalente, mesurée par l'hydrolyse de BLT benzyle. I-E-P-D-P-N-A a été utilisé de manière générique pour tester l'activité de la granzyme B chez différentes espèces. Dans cette expérience représentative, l'analyse des séquences tétrapeptidiques a révélé que la granzyme B humaine, mais pas celle de la souris, peut cliver efficacement après la séquence IEPD, qui correspond à la séquence de reconnaissance présente dans la protéine Bid humaine et murine. En revanche, la réduction de la quantité de lysat de cellules leucémiques NK humaines de 30 microgrammes à 10 microgrammes donne toujours une quantité suffisante d'enzyme granzyme B pour hydrolyser le substrat I-E-P-D-P-N-A.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment choisir le substrat approprié ainsi que les contrôles expérimentaux pour l'analyse in vitro de l'enzyme B humaine et murine rouge.

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Dans cette vidéo, nous effectuons une zymographie, une technique électrophorétique, pour analyser l’activité protéolytique dans des échantillons biologiques.

Zymographie peptidique fluorescente : une technique modifiée pour détecter l’activité de la protéase à l’aide de substrats fluorogènes dans des gels de zymogramme

Cette vidéo décrit un test luminescent in vitro de caspase-3/7 pour quantifier la mort cellulaire ou l’apoptose. Le dosage mesure la luminescence produite suite au clivage de la caspase-3/7 d’un substrat DEVD proluminescent. La luminescence générée est proportionnelle à l’activité de la caspase-3/7.

Caspase-3/7 Assay : Un test basé sur la luminescence pour quantifier l’apoptose en mesurant les activités de la caspase-3/7 dans les explants de peau de grenouille

Cette vidéo présente un test permettant de dépister l’activité protéolytique des protéases à l’aide de peptides fluorogènes. La protéase reconnaît son site de clivage sur le peptide, le clivant et séparant le quencher du fluorophore, permettant ainsi son émission de fluorescence. Le signal de fluorescence est détecté et analysé pour vérifier l’efficacité du clivage des différentes variantes peptidiques.

Un test de clivage peptidique fluorogénique pour cribler l’activité protéolytique des protéases

Cette vidéo présente un test permettant de surveiller l’activation des neutrophiles et l’exocytose des granules grâce à un test de dégranulation. Lors de l’activation par des composés pro-inflammatoires, les granules cytoplasmiques des neutrophiles contenant de la gélatinase fusionnent avec la membrane cellulaire, déchargeant leur cargaison. La présence de gélatinase dans le surnageant est évaluée par l’hydrolyse d’un substrat de gélatine conjugué à un fluorophore, confirmant l’activation et la...

Un test de dégranulation pour surveiller l’activation des neutrophiles et la libération de gélatinase

Cette vidéo montre un test de dégranulation de granules azurophiles dans des neutrophiles de souris, impliquant la stimulation des neutrophiles pour libérer des granules azurophiles contenant de la myéloperoxydase. La réaction enzymatique qui s’ensuit est utilisée pour quantifier les niveaux de myéloperoxydase, ce qui donne un aperçu de l’activation des neutrophiles.

Un test pour surveiller la dégranulation des granules azurophiles dans les neutrophiles après activation

Nous décrivons ici un système d’expression de granzyme rentable utilisant des cellules HEK293T qui produit des rendements élevés de protéase pure, entièrement glycosylée et enzymatiquement active.

Un rendement élevé et Expression System coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères

Ici, nous présentons des protocoles pour cribler et caractériser rapidement l’activité antimicrobienne des enzymes. Le test de diffusion sur microlames et le test de libération de colorant utilisent des substrats bactériens cibles pour l’évaluation qualitative et quantitative de l’activité enzymatique.

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Nous présentons ici un protocole détaillé pour une technique mis à jour le zymographic dans lequel les peptides fluorescents sont utilisés comme substrat biodégradable en lieu et place des protéines natives. Électrophorèse d’échantillons biologiques dans zymogrammes de peptides fluorescents permet la détection d’un plus large éventail de protéases que les techniques de zymographic précédente.

Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents

Le présent protocole décrit deux méthodes pour mesurer l’activité des caspases à travers un substrat fluorogénique à l’aide de la cytométrie en flux ou d’un spectrofluoromètre.

Mesure de l’activité des caspases à l’aide d’un dosage fluorométrique ou d’une cytométrie en flux

Nous décrivons ici des protocoles pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par protéolyse ciblant les chimères (PROTACS) qui impliquent les ubiquitine ligases Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) et Cereblon (CRBN).  Les méthodes biophysiques illustrées ici comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie de biocouche (BLI) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC).

le développement et l’application de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par la protéolyse ciblant les chimères (PROTACS)

Ce protocole décrit le développement d’une méthode d’essai colorimétrique pour déterminer la capacité des composés à inhiber ou à activer l’activité de l’élastase.

Quantification de la modulation de l’activité de l’enzyme élastase par analyse colorimétrique

Découvrez un dosage colorimétrique pour mesurer l'activité protéolytique de la Granzyme B dans des échantillons humains, murins ou rats. Cette méthode spécifique évalue directement l'activité enzymatique via l'hydrolyse du substrat synthétique.

Un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement l'activité protéolytique Granzyme B: hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

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