Un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement l'activité protéolytique Granzyme B: hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 novembre 2014
Nous décrivons un test colorimétrique simple et quantitatif qui mesure spécifiquement l’activité protéolytique de Granzyme B (GzmB) chez l’homme, la souris ou le rat. Ce protocole peut être facilement adapté pour déterminer l’activité protéase d’autres protéases à sérine granulaire par hydrolyse d’autres substrats peptidiques synthétiques avec une séquence de reconnaissance appropriée.
L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer l'activité protéolytique de la protéase granzyme B. Cette mesure est réalisée en préparant d'abord un lysat des cellules d'intérêt, puis en ajoutant rapidement le substrat aux échantillons. L'activité du granzyme B est ensuite mesurée par une réaction colorimétrique. En fin de compte, le clivage hautement spécifique de alla alla as s benzo par le granzyme B peut être évalué en fonction de sa spécificité unique pour les résidus d'acide aspartique.
L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la détection de l'expression de la grand zone B par PCR ou par immunotransfert (Western blot), est que l'hydrolyse du benzyle est spécifique de la grand zone B et indique également que la protéase est active. Pour préparer la cellule, les lysats isolent d'abord les cellules NK primaires à partir de suspensions uniques de splénocytes provenant de souris de type sauvage C57BL/6 ou de souris contrôles nulles pour le gène de la granzyme B, par sélection négative à l'aide de kits disponibles commercialement, conformément aux instructions du fabricant, après activation des cellules. Laver la culture trois fois dans du PBS à vitesse maximale pendant deux à trois secondes, puis resuspendre le culot contenant au minimum 5 millions de cellules NK dans 100 microlitres de tampon de lyse NP-40 sur de la glace pendant 20 minutes.
Ensuite, centrifuger le lysat dans une microcentrifugeuse pendant 10 minutes à 15 000 Gs et transférer l'agent surnageant dans un nouveau tube. Après avoir déterminé la concentration en protéines selon le protocole commercial approprié, conserver l'échantillon à une concentration d'au moins environ deux milligrammes par millilitre à moins 20 degrés Celsius afin d'effectuer un dosage de l'activité de la granzyme B. Ensuite, diluer au minimum 100 microgrammes de lysat protéique par échantillon dans du tampon HEPES fraîchement préparé jusqu'à un volume final de 160 microlitres.
Ensuite, à l’aide d’une pipette multipuits, déposer 50 microlitres d’échantillon par puits en triplets dans une plaque de 96 puits en vinyle à fond en U. En prenant soin d’inclure trois puits témoins contenant uniquement du tampon, ajouter 100 microlitres de DTNB dilué à chacun. Puis ajouter rapidement 50 microlitres de substrat de benzoyl d’alala asks s fraîchement dilué aux puits contenant uniquement le tampon, suivis des éventuels témoins négatifs, et terminer par les échantillons positifs attendus.
Mesurez l'activité de l'ase en suivant l'hydrolyse de l'AlaAla-As-Bzl à l'aide d'un lecteur de microplaques, à une densité optique de 405 nanomètres, selon un protocole de dosage cinétique effectuant 25 lectures toutes les 15 secondes. Enfin, utilisez le logiciel du lecteur de microplaques pour calculer la vitesse maximale de clivage du substrat pour chaque puits, puis transférez les données brutes vers le logiciel approprié d'analyse statistique en utilisant des souris transgéniques invalidées pour le gène de la granzyme. Il a été démontré que le substrat peptidique synthétique AlaAla-As-Bzl est spécifiquement hydrolysé par la granzyme B. Une hydrolyse plus robuste du substrat synthétique peut être mesurée dans des lysats cellulaires provenant de cellules NK primaires de type sauvage, mais pas dans les cellules NK provenant d'animaux invalidés pour la granzyme B, utilisés comme contrôle.
Dans cette expérience, l'activité protéolytique de la granzyme A, qui possède une spécificité de substrat semblable à celle de la trypsine et est présente dans les lysats des deux types de cellules, était équivalente, mesurée par l'hydrolyse de BLT benzyle. I-E-P-D-P-N-A a été utilisé de manière générique pour tester l'activité de la granzyme B chez différentes espèces. Dans cette expérience représentative, l'analyse des séquences tétrapeptidiques a révélé que la granzyme B humaine, mais pas celle de la souris, peut cliver efficacement après la séquence IEPD, qui correspond à la séquence de reconnaissance présente dans la protéine Bid humaine et murine. En revanche, la réduction de la quantité de lysat de cellules leucémiques NK humaines de 30 microgrammes à 10 microgrammes donne toujours une quantité suffisante d'enzyme granzyme B pour hydrolyser le substrat I-E-P-D-P-N-A.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment choisir le substrat approprié ainsi que les contrôles expérimentaux pour l'analyse in vitro de l'enzyme B humaine et murine rouge.
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Aperçu
Cet article présente un dosage colorimétrique quantitatif permettant de mesurer l'activité protéolytique de la Granzyme B (GzmB) dans des échantillons humains, de souris ou de rat. La méthode peut être adaptée à d'autres protéases sériques granulaires en utilisant différents substrats peptidiques synthétiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Activité protéasique
- Biologie cellulaire
Contexte général
- La granzyme B est une protéase à sérine impliquée dans les réponses immunitaires.
- La mesure de son activité est essentielle pour comprendre son rôle dans la cytotoxicité médiée par les cellules.
- Les méthodes existantes telles que la PCR ou le Western blot ne mesurent pas directement l'activité protéasique.
- Cet essai permet une mesure spécifique et directe de l'activité de la GzmB.
Objectif de l'étude
- Développer un essai simple permettant de quantifier l'activité de la granzyme B.
- Proposer une méthode pouvant être adaptée à d'autres protéases.
- Améliorer les techniques existantes en offrant une spécificité pour l'activité de la granzyme B.
Méthodes utilisées
- Préparation de lysats cellulaires à partir de lymphocytes NK primaires.
- Utilisation d'une réaction colorimétrique pour mesurer l'activité de la GzmB.
- Isolation de cellules NK à partir de spléens de souris de type sauvage et de souris invalidées pour le gène de la granzyme B.
- Hydrolyse du substrat pour évaluer l'activité protéasique.
Résultats principaux
- Le test mesure avec succès l'activité de la GzmB par le clivage d'un substrat spécifique.
- Il présente une grande spécificité pour la GzmB par rapport à d'autres méthodes.
- Les résultats indiquent que la protéase est active en fonction de l'hydrolyse du substrat.
- La méthode peut être adaptée à d'autres protéases sériques des granules.
Conclusions
- Le test mis au point est un outil fiable pour mesurer l'activité de la GzmB.
- Il présente des avantages par rapport aux méthodes traditionnelles en évaluant directement la fonction de la protéase.
- Cette approche peut améliorer la recherche sur les réponses immunitaires et la biologie des protéases.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
La mesure précise de l'activité protéolytique de la granzyme B est essentielle pour valider la fonction des lymphocytes cytotoxiques dans le développement de l'immunothérapie. Ce dosage colorimétrique fournit une lecture directe et spécifique de l'activité de la protéase, permettant une détection mécanistique de l'engagement de la cible et du potentiel pro-apoptotique dans les modèles précliniques. Sa compatibilité interspécifique soutient une continuité translationnelle depuis les études chez le rongeur jusqu'aux applications humaines.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des voies d'apoptose dépendantes de la granzyme B dans les lymphocytes cytotoxiques.
- Valeur opérationnelle : Distingue la protéase active de sa simple expression, réduisant ainsi les faux positifs lors de la validation des cibles.
- Valeur prédictive : Permet de confirmer fonctionnellement le rôle moteur de la granzyme B dans l'élimination immunitaire des tumeurs.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-utiliser pour test : Utilise un substrat Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hydrolysé exclusivement par la granzyme B dans les systèmes humain, murin et rat.
- Résultat quantitatif : Mesure les vitesses initiales d'hydrolyse par réaction colorimétrique couplée au DTNB à 405 nm pour l'analyse cinétique.
- Contrôle de spécificité : Écarte toute interférence des caspases et autres granzymes grâce à la spécificité unique pour l'aspartate.
- Reproductibilité : Compatible avec des lysats non fractionnés et des protéases recombinantes lorsqu'on inclut des contrôles appropriés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Applicable aux modèles de surveillance immunitaire des tumeurs, d'infection virale et de pathologie auto-immune où la granzyme B médie la mort des cellules cibles.
- Continuité translationnelle : Permet une mesure cohérente de l'activité à travers les espèces, facilitant l'extrapolation des données de la souris à l'humain.
- Décisions adaptées au risque : Fournit un biomarqueur fondé sur l'activité enzymatique pour hiérarchiser les candidats présentant un potentiel cytotoxique confirmé.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'optimisation du composé précurseur, où l'activité fonctionnelle de la protéase renseigne sur l'efficacité biologique et le mécanisme d'action.
- Biologie de la découverte : Confirme l'hypothèse selon laquelle la granzyme B induit l'apoptose dans les lymphocytes effecteurs par clivage spécifique du substrat.
- Essais de criblage : Fournit des mesures quantitatives normalisées permettant de comparer différentes conditions ou perturbations génétiques.
- Analytique : Génère des données cinétiques (Vmax) permettant la comparaison entre échantillons et l'évaluation statistique de la capacité protéolytique.
- Recherche translationnelle : Soutient la validation préclinique en vérifiant l'activité conservée de la granzyme B humaine, murine et rat.
- Réutilisation en milieu professionnel : Plateforme adaptable à d'autres protéases des granules par substitution du substrat, augmentant ainsi son utilité à long terme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : La mesure directe de la fonction protéolytique réduit la dépendance aux marqueurs indirects tels que les niveaux d'ARNm ou de protéines.
- Valeur opérationnelle : Format simple, basé sur des plaques, avec un temps de manipulation minimal et une compatibilité avec les lecteurs standards de microplaques.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions d'avancement ou d'arrêt fondées sur l'activité fonctionnelle plutôt que sur l'expression seule, améliorant ainsi la confiance prédictive.
- Impact sur le portefeuille : Facilite le développement ajusté au risque des immunothérapies en confirmant précocement la puissance mécanistique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans l'isolement des cellules immunitaires primaires et leur lyse dans des conditions contrôlées afin de préserver l'activité des protéases.
- Dépend de l'accès à un lecteur de microplaques capable de mesurer la DO à 405 nm en mode cinétique et d'un logiciel d'analyse compatible.
- Exige l'inclusion de témoins invalidés pour la granzyme B afin de confirmer la spécificité du test, comme indiqué dans la source.
- L'adaptation à d'autres protéases nécessite la validation de substrats alternatifs pour maintenir une spécificité et une fenêtre de signal équivalentes.
- Limite pratique : le test mesure l'activité totale du lysat et peut nécessiter une fractionnement pour des études de localisation subcellulaire.
