Name: Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Découvrez la reconstitution fonctionnelle de la protéine CFTR pour étudier l'activité des canaux chlorures dans la mucoviscidose. Cette méthode permet de mesurer les effets des modulateurs moléculaires sur CFTR.

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

<ol><li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity%2C+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li>
<li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li>
<li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li>
<li>Genetic Analysis Consortium. , 
 <a target="_blank" href="http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html">http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/Home.html</a> (1989).</li>
<li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li>
<li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li>
<li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li>
<li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR.+J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li>
<li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li>
<li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus%2Finsect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li>
<li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li>
<li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li>
<li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li>
<li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li>
<li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+channels+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li>
<li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR%2C+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li>
<li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li>
<li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li>
<li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. Ch. 16. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamjeesingh%2C+M+%22Reliable+Lab+Solutions%3A+Essential+Ion+Channel+MethodsReliable+Lab+Solutions%22">Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions</a>. Conn, P. M. , Academic Press. 337-357 (2010).</li>
<li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li>
<li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li>
<li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+%28PKA%29+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li>
<li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Second+Messenger+Phosphoprotein+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li>
<li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li>
<li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li>
<li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs reconnaissent les conseils du Dr Mohabir Ramjeesingh au cours du développement des méthodes de purification décrites ici. Ces études ont été soutenus par des subventions de fonctionnement au CCS des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et la fibrose kystique Canada (CFC) canadiennes. PDWE a été financé en partie par des bourses de recherche par les IRSC et CFC. Les auteurs reconnaissent la fourniture de correcteur, potentialisateur et composés inhibiteurs du Dr R. Bridges (Université Rosalind de médecine et des sciences) et la distribution par les Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). Les auteurs reconnaissent également un service exceptionnel par le Baylor Culture Cellulaire Facility (NIH subvention P30 CA125123) dans l&#39;expression et Poids protéine CFTR mutant en utilisant le système de baculovirus. Les inactifs VX-770 analogique, V-09 à 1188, était un don de Vertex Pharmaceuticals.

Il n&#39;y a eu qu&#39;un nombre limité de protocoles de purification de pleine longueur, l&#39;isolement de la protéine CFTR fonctionnelle, à partir d&#39;une variété de systèmes de surexpression cellulaire. Le procédé décrit ici est avantageuse car elle permet une purification rapide de WT-CFTR ou haute enrichissement de F508del- et G551D-CFTR dans des quantités modérées qui est très fonctionnel dans des dosages compris ATPase et des mesures directes de la fonction du canal, y compris les mesures de canal unique dans ...

transport de chlorure à travers les membranes apicales des cellules épithéliales dans les tissus tels que poumons, intestins, le pancréas et les glandes sudoripares est principalement médiée par la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR), un ATP et membre de phosphorylation réglementés de l&#39;ABC (ATP Binding Cassette) C sous-famille de protéines membranaires (revue dans 1). Comme d&#39;autres membres de la sous-famille SCBA, CFTR est un grand multi-enjambant protéine membranaire intégrale qui se lie l&#39;ATP à deux sites de liaison de nucleotides formée à l&#39;interface de ses domaines de nucleotides de liaison (NBD), où il possède une activité d&#39;ATPase modeste à une seule place. Cependant, contrairement à d&#39;autres membres de la sous-famille ABCC, CFTR a évolué comme un canal Cl réglementé unique, plutôt que comme un soluté transporteur actif. Des mutations dans la cause de la fibrose kystique CFTR, une maladie affectant plusieurs organes, y compris les poumons, tractus gastro-intestinal, du pancréas et des voies de reproduction, conduisant à morbidité et de la mortalité chez les jeunes adultes. Maladie pulmonaire représente généralement au début de la mortalité et de la fibrose kystique dans la plupart des cas est provoqué par la perte de fonction de la protéine CFTR à la surface de l&#39;épithélium des voies aériennes conductrices. L&#39;absence de l&#39;activité des canaux chlorure CFTR entraîne une réduction à la fois de Cl - et de circulation de l&#39;eau à travers l&#39;épithélium de surface pour modifier la couche de fluide sur la surface apicale de l&#39;épithélium cilié respiratoire. Il en résulte un liquide de surface des voies respiratoires visqueux qui altère la capacité des cellules epitheliales ciliées des voies respiratoires à des agents pathogènes efficacement claires sur les voies respiratoires. En conséquence, la plupart des patients atteints de mucoviscidose souffrent d&#39;épisodes récurrents d&#39;infection pulmonaire et une atteinte des poumons due à l&#39;inflammation. Comme prévu, les études du mécanisme d&#39;action de la protéine CFTR normale concentrent principalement sur les études électrophysiologiques détaillées de son activité voie de fenêtrage. Des études simples de canal ont montré directement que les fonctions de CFTR comme PKA-dépendante Cl- Canal qui possède une porte ATP réglementé 2. Études électrophysiologiques détaillés fournissent beaucoup d&#39;informations sur les canaux CFTR simples 1,3, mais il peut y avoir des préoccupations quant à savoir si les caractéristiques d&#39;un seul canal particulier qui a été étudié est le reflet de l&#39;ensemble de la population de canaux CFTR et donc le seul canal résultats doivent toujours être considérés ainsi que des méthodes pour étudier la population macroscopique. Dosage direct de l&#39;activité de canal de population de CFTR purifié a le potentiel de donner un aperçu du défaut moléculaire associée à des mutations pathogènes et à conduire la découverte de modulateurs chimiques qui la réparation des protéines CFTR mutant. À ce jour, il ya plus de 1900 mutations différentes dans CFTR pensé pour provoquer la fibrose kystique 4. La mutation majeure, F508del-CFTR, trouvé sur au moins un allèle dans environ 90% des patients en Amérique du Nord et en Europe conduit à un mauvais repliement des protéinesnd rétention dans le réticulum endoplasmique 5. F508del-CFTR a aussi d&#39;autres conséquences, y compris l&#39;activité du canal défectueux 6-9. L&#39;absence résultante de la protéine CFTR à la surface de cellule est associée à une maladie grave. G551D-CFTR, la mutation moins fréquente, est considérée comme étant encore correctement pliée est dysfonctionnel comme un canal chlorure à la surface de la cellule 6. Le développement de petits correcteurs de molécules et potentialisateurs a pour but de corriger de pliage et / ou le trafic de mutants tels que F508del-CFTR à la surface cellulaire, et potentialisant ou en augmentant l&#39;activité de canal de mutations telles que G551D lorsqu&#39;ils sont présents sur la surface des cellules, respectivement . Alors que les correcteurs VX-809 et VX-661 (ne sont pas encore approuvés pour une utilisation chez les patients, le potentialisateur Kalydeco (ivacaftor; VX-770) est utilisé à 150 mg toutes les 12 h chez les patients FC&gt; 6 ans avec au moins un G551D -CFTR mutation, et plus récemment pour les patients avec l&#39;un des G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pet G1349D. Kalydeco est à la fois sûr et des résultats dans l&#39;amélioration des mesures cliniques de la maladie CF 10, mais le mécanisme d&#39;action de cette petite molécule a été mal compris au moment de l&#39;approbation de la FDA pour une utilisation chez les patients. Une poignée de méthodes de purification CFTR ont été décrits précédemment 2,11-18, dont beaucoup exigent une longueur considérable de temps pour terminer. Dans une publication récente 19, un procédé de purification et reconstitution rapide unique a été décrit pour la protéine CFTR surexprimé dans le S f système d&#39;expression neuf cellulaire, et cette protéine purifiée dans les systèmes lipidiques définies a été utilisé pour développer un essai de l&#39;activité des canaux à l&#39;halogénure d&#39;CFTR pour une population de CFTR molécules. Le dosage récapitule les effets connus de phosphorylation, des nucléotides et des inhibiteurs sur la fonction de la protéine CFTR. Le système a été utilisé pour interroger les effets de la potentialisateur VX-770 / Kalydeco sur poids (-type sauvage), F508del- et G551D-CFTR et il a été montré pour la premièretemps que le médicament interagit directement avec la protéine CFTR à potentialiser son activité de canal de façon ATP-indépendant, ce qui démontre l&#39;utilité et l&#39;application de ces méthodes pour l&#39;étude de l&#39;interaction de la protéine CFTR et mutants avec des nucleotides et des petites molécules à partir d&#39;un point de vue de la population de répondre à des questions cliniquement pertinentes sur la protéine. Les procédés ont également été utilisés pour étudier d&#39;autres molécules de potentialisateur et de leurs dérivés 20, ainsi que les effets d&#39;un correcteur de petite molécule de l&#39;activité de la protéine 21. des dosages d&#39;efflux ont été utilisées dans de nombreuses études précédemment pour étudier l&#39;activité de mutants CFTR et les effets des composés CFTR-modulateurs sur son activité, y compris des dosages de cellules entières en utilisant des électrodes, des traceurs radioactifs et des fluorophores 22,23, des vésicules membranaires avec électrodes sélectives d&#39;ions 24 , et purifié CFTR reconstitué avec des traceurs radioactifs 25. Cependant thl&#39;utilisation de l&#39;e des électrodes sélectives d&#39;ions pour étudier CFTR reconstitué purifié a été rapporté récemment 19. Une adaptation de la méthode actuelle a été utilisé pour la reconstitution et la caractérisation fonctionnelle de deux protéines membranaires de Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène CF commun. Reconstitution de Alge purifié la protéine de la membrane externe couplé avec des mesures d&#39;efflux iodure ont été utilisés pour soutenir un modèle pour les tensioactifs anioniques alginate la sécrétion par ce transporteur 26. La reconstitution et les mesures de efflux d&#39;iodure ont été appliqués à la protéine purifiée wzx, ce qui a permis un modèle à proposer qui suggère un mécanisme de H + antiport dépendante de la translocation de lipide d&#39;oligosaccharide liée à travers la membrane bactérienne interne de 27 cette protéine. Dans les deux cas iodure a été utilisé comme un substitut pour le substrat anionique, mais à débit plus faible que l&#39;on pourrait attendre d&#39;un substrat natif. Le procédé peut être adapté pour l&#39;adaptation à d&#39;autres protéines ayant des cconduction des voies de transport ou pour des substrats anioniques ationic. Voici une procédure de purification rapide est décrit pour la protéine CFTR et sa reconstitution dans des protéoliposomes de lipide défini. La procédure de reconstitution rapide peut facilement être adapté pour une utilisation avec CFTR purifié par d&#39;autres procédés, à condition que le type de détergent utilisé dans la purification se prête à l&#39;élimination par des méthodes utilisées ici ou peut être remplacé par un détergent approprié avant la procédure de reconstitution. Procédé d&#39;efflux d&#39;iodure pour la mesure de l&#39;activité du canal CFTR de protéine purifiée et reconstituée est décrit en détail et certains résultats typiques qui peuvent être obtenus par cette méthode sont présentés.

<table><tbody><tr><td>fos-choline 14 détergent</td><td>Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td><td>F312</td><td>Affymetrix : Anatrace Products ; CAS#&nbsp ; :77733-28-9</td></tr><tr><td>cOmplete Inhibiteur de protéase sans EDTA</td><td>comprimés Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>04 693 132 001</td><td>Comprimés cocktail inhibiteur de protéase sans EDTA (1 sur 50 ml ou mini : 1 sur 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH ; Ref : 11873 580 001)</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Comprimés, Mini, sans EDTA, EASYpack&nbsp ;</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>05 892 791 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qaigen GmbH</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Colonnes de criblage</td><td>Fisher Healthcare</td><td>11-387-50</td><td></td></tr><tr><td>Filtres ultra-centrifuges Amicon, Ultracel-100K</td><td>Millipore (www.millipore.com)</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Protéine kinase A dépendante de l’AMPc (PKA), sous-unité</td> <td>catalytiqueNew England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td><td></td><td>Peirce PKA convient également</td></tr><tr><td>PC, Oeuf de poule</td><td>Avanti Lipides polaires (www.avantilipids.com)</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Lipides polaires (www.avantilipids.com)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>PS, Cerveau porcin</td><td>Avanti Lipides polaires (www.avantilipids.com)</td><td>840032C</td><td>CFTR a été reconstitué avec succès en Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC :POPC, ou un mélange de PE :PS :PC :ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)</td></tr><tr><td>PE, Chicken Egg</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td><td>841118C</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>45480</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Detergent removal spin column</td><td>Thermo Scientific</td><td>87779</td><td>Colonnes d’une capacité de 1 ml</td></tr><tr><td>valinomycine</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>V-0627</td><td></td></tr><tr><td>VX-770 (ivacaftor)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>microélectrode sélective à l’iodure</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td><td>LIS-146ICM</td><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; </td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Logiciel Clampex 8.1</td><td>Axon Instruments (www.axon.com)</td><td></td><td>nous utilisons des composants du système ClampX avec un filtre fait maison pour surveiller et enregistrer la réponse à notre électrode</td></tr><tr><td>Logiciel alternatif : Système ArrowLabb&nbsp ;</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td><td>LIS-146LICM-XS</td><td>Lazar Research vend un compteur qui peut s’interfacer avec un ordinateur et un logiciel pour enregistrer la réponse de la sonde.&nbsp ; Ce logiciel devrait remplir une fonction similaire à notre configuration.</td></tr><tr><td>petites barres d’agitation</td><td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td><td>SBM-0502-CMB</td><td>choisissez une barre d’agitation suffisamment petite pour s’insérer facilement dans un puits d’une plaque à 96 puits</td></tr><tr><td>Sephadex G50, fine</td><td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td><td>G112SP1G</td><td>Les sonicateurs à bain d’autres fabricants devraient également convenir</td></tr></tbody></table>

reconstitution fonctionnelle et activité du chan mesures de type sauvage purifiée et mutant protéine cftr

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

La fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) est un élément de formation de canal unique de l&#39;ATP Binding Cassette (ABC) superfamille des transporteurs. L&#39;activité du canal chlorure nucléotidique et la phosphorylation dépendant de la CFTR a été étudié fréquemment dans des systèmes de cellules entières et que les canaux individuels dans patches membranaires excisées. De nombreuses mutations de fibrose kystique qui causent ont été montré de modification de cette activité. Bien qu&#39;un petit nombre de protocoles de purification ont été publiées, un procédé de reconstitution rapide qui conserve l&#39;activité de canal et un procédé approprié pour l&#39;étude de l&#39;activité du canal de la population dans un système purifié ont fait défaut. Ici méthodes rapides sont décrites pour la purification et la reconstitution fonctionnelle de la protéine CFTR pleine longueur dans des protéoliposomes de composition lipidique défini qui conserve une activité de canal à l&#39;halogénure réglementé. Cette méthode de reconstitution avec un nouvel essai à base de flux de l&#39;activité de canal est un système adapté pourétudier les propriétés du canal de la population de CFTR sauvage et les mutants pathogènes F508del- et G551D-CFTR. Plus précisément, le procédé est utile pour l&#39;étude des effets directs de la phosphorylation, les nucleotides et les petites molécules telles que potentialisateurs et des inhibiteurs sur l&#39;activité du canal CFTR. Les méthodes sont également prêtent à l&#39;étude d&#39;autres canaux / transporteurs membranaires pour les substrats anioniques.

Décrit dans cette publication écrite sont des méthodes pour purifier, reconstituer et de mesurer l&#39;activité des canaux réglementé de la protéine CFTR. Figure 1a montre le flux de travail pour la purification, la reconstitution et procédures d&#39;efflux d&#39;iodure. Méthodes pour la reconstitution et l&#39;activité du canal de flux iodure mesures sont également présentés plus en détail dans la vidéo associée. Purification et la reconstitution de la protéine CFTR dans pr...

Décrit ici est un procédé rapide et efficace pour la reconstitution fonctionnelle de type sauvage purifiée et une protéine de CFTR mutante qui conserve l&#39;activité de ce canal de chlorure, qui est défectueux dans la fibrose kystique. Efflux d&#39;iodure de protéoliposomes reconstituées médiées par CFTR permet des études de l&#39;activité du canal et les effets de petites molécules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la fonction d'une population de canaux CFTR dans un système reconstitué et d'examiner la réponse de ces canaux à la présence de molécules modulatrices. Cela est réalisé en purifiant d'abord la protéine CFTR de type sauvage ou mutante à partir de cellules SF9 à l'aide d'une procédure de purification rapide, qui fournit une protéine CFTR fonctionnelle en solution détergente. La deuxième étape consiste à reconstituer la protéine purifiée dans des protéoliposomes composés de lipides définis, choisis par l'expérimentateur.Ensuite, un gradient chimique d'iodure est établi à travers la membrane en éliminant l'iodure liposomal excédentaire afin de générer une force motrice pour le déplacement des ions à travers le canal CFTR. La dernière étape consiste à activer le canal et à initier la libération d'iodure à partir des liposomes protéiques en présence de la molécule modulatrice d'intérêt. Enfin, une électrode sélective à l'iodure est utilisée pour surveiller en temps réel la fonction du canal CFTR dans ce système reconstitué.Cette méthode permet l'étude de l'activité du canal à chlorure d'une population purifiée de molécules de CFTR aprè

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Nous allons démontrer comment étudier l'effet d'une mutation ponctuelle unique sur la fonction d'un canal ionique.

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Expression hétérologue et purification du régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) sont des défis importants et les facteurs limitants dans le développement de thérapies pour la fibrose kystique. Ce protocole décrit deux méthodes pour l'isolement de quelques milligrammes de CFTR appropriés pour des études fonctionnelles et structurelles.

Purification de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire protéine exprimée dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

les arythmies cardiaques héréditaires sont souvent provoquées par des mutations qui modifient la distribution de surface d'un ou plusieurs canaux ioniques. Ici, on adapte les essais de cytométrie en flux pour fournir une quantification de l'expression de la protéine totale et de la surface cellulaire relative des canaux ioniques recombinants exprimés dans des cellules 201 TSA.

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