Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la fonction d'une population de canaux CFTR dans un système reconstitué et d'examiner la réponse de ces canaux à la présence de molécules modulatrices. Cela est réalisé en purifiant d'abord la protéine CFTR de type sauvage ou mutante à partir de cellules SF9 à l'aide d'une procédure de purification rapide, qui fournit une protéine CFTR fonctionnelle en solution détergente. La deuxième étape consiste à reconstituer la protéine purifiée dans des protéoliposomes composés de lipides définis, choisis par l'expérimentateur.

Ensuite, un gradient chimique d'iodure est établi à travers la membrane en éliminant l'iodure liposomal excédentaire afin de générer une force motrice pour le déplacement des ions à travers le canal CFTR. La dernière étape consiste à activer le canal et à initier la libération d'iodure à partir des liposomes protéiques en présence de la molécule modulatrice d'intérêt. Enfin, une électrode sélective à l'iodure est utilisée pour surveiller en temps réel la fonction du canal CFTR dans ce système reconstitué.

Cette méthode permet l'étude de l'activité du canal à chlorure d'une population purifiée de molécules de CFTR après leur réintégration dans des liposomes à base de phospholipides. Bien que cette méthode ait été choisie pour fournir des informations sur le fonctionnement du canal C-F-D-R-N neuf et l'effet de modulateurs de petite taille, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme la caractérisation fonctionnelle d'autres protéines membranaires. Pour réussir, les personnes novices dans cette méthode doivent s'assurer d'avoir optimisé les rapports protéine/lipide pour leur système, de ne pas travailler avec une protéine peu fonctionnelle ou non fonctionnelle, et d'avoir établi un gradient d'iodure suffisant à travers des vésicules bien scellées.

Pour préparer le lipide, commencez par sécher cinq milligrammes de phosphatidylcholine d'œuf ou de PC d'œuf dans un tube en verre non borosilicaté sous un courant d'argon pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, calculez le volume du tampon six comme indiqué dans le protocole écrit, puis ajoutez directement le tampon six au lipide. Scellez le tube en verre avec du perfil, puis vortexez le tube pendant deux minutes à température ambiante afin de suspendre le lipide dans le tampon.

Ensuite, resuspendre le lipide à température ambiante à l’aide d’une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue d’un millilitre jusqu’à ce qu’aucun film lipidique visible ne subsiste sur la paroi du tube. Le tampon deviendra trouble en raison de la suspension du lipide. Sonifier le lipide dans le tube pendant une impulsion de 22 secondes dans un bain à ultrasons contenant de la glace, puis placer le tube sur de la glace pendant une minute.

Répétez ce cycle trois fois. Ensuite, ajoutez la protéine CFTR aux lipides, afin d'obtenir un volume final d'un millilitre. Mélangez la protéine avec une suspension lipidique 10 fois à l’aide d’une aiguille de 25 gauge.

Placer l'échantillon sur de la glace pendant 30 minutes, en agitant le tube cinq fois toutes les cinq minutes pour mélanger pendant l'incubation. Casser l'onglet inférieur d'une colonne filtrante jetable pour liaison au détergent et centrifuger la colonne pendant deux minutes à 2000 × g. Pour éliminer le tampon de stockage, laver la colonne avec cinq millilitres de tampon 7 et centrifuger la colonne pendant quatre minutes à 2000 × g afin d'éluer le tampon de lavage.

Lavez la colonne trois fois, transférez l'échantillon entier de protéine-lipide d'un millilitre vers le haut de la résine de la colonne, puis incubez la colonne pendant deux minutes à température ambiante. Faites centrifuger la colonne à température ambiante pendant quatre minutes à 2000 ×g. Transférez ensuite l'échantillon trouble de protéa-liposome dans un tube microfuge propre et placez le tube sur de la glace. Imbibez cinq grammes de billes Cidex G 50 dans 50 millilitres de tampon neuf pendant au moins deux heures à température ambiante.

Ensuite, chargez quatre petites colonnes de criblage avec les billes saturées jusqu'à ce qu'elles soient remplies au moins aux trois quarts. Faites centrifuger les colonnes pendant quatre minutes à 2000 ×g pour éliminer l'excès de tampon du résine. Environ 2,25 millilitres de résine compactée doivent se trouver dans la colonne après la centrifugation.

Il est essentiel que la résine soit correctement hydratée pour l'élution avec les protéasomes liposomiques. Ensuite, transférez 125 microlitres de l'échantillon de protéasomes liposomiques au sommet de chaque colonne et centrifugez pendant quatre minutes à 2000 × g. Rassemblez les EIT pour les utiliser dans les expériences de FLX à l'iodure.

Placer un petit barreau aimanté en téflon dans un puits d'une plaque de 96 puits, puis ajouter 150 microlitres de VX sept 70 à une concentration de 20 micromolaire dans le tampon neuf dans le puits. Utiliser une pipette pour éliminer toutes les bulles d'air. Ensuite, ajouter 150 microlitres de l'échantillon de protéoliposomes dans le puits, pour un volume total de 300 microlitres.

Placer la plaque de 96 puits sur un agitateur magnétique à 130 tours par minute. Insérer la pointe de l'électrode sensible à l'iodure dans la solution sans toucher l'agitateur ou le fond du puits. Pour enregistrer les tracés du signal de l'électrode, filtrer le signal à l'aide d'un filtre passe-bas avec une fréquence d'échantillonnage de deux hertz, puis enregistrer les tracés provenant de l'échantillon pendant cinq minutes afin de permettre à l'échantillon d'atteindre l'équilibre.

Il devrait produire une ligne de base stable et presque plate. Ajoutez ensuite trois microlitres d'une solution mère de 100 millimolaire de chlorure de magnésium ATP à pH sept. Pour activer les canaux CFTR, laissez l'échantillon s'équilibrer pendant cinq minutes supplémentaires afin d'atteindre une nouvelle ligne de base.

Ensuite, ajoutez trois microlitres d'une solution mère de deux micromolaire de valinomycine afin d'éliminer le gradient électrochimique généré par l'activité de la CFTR. Enregistrez la diminution de la tension due à l'activité de l'iodure FLX médiée par la CFTR pendant au moins cinq minutes.

Ensuite, ajoutez trois microlitres d'une solution de Triton X-100 à 10 % à l'échantillon pour libérer l'iodure du lumen du liposome protéique en tant que témoin. Une libération importante d'iodure indique que l'iodure piégé dans les vésicules n'était pas limitant pour l'activité de la CFTR. Après avoir mesuré l'échantillon, préparez une série de dilutions de l'iodure de potassium allant de concentrations micromolaires à nanomolaires dans le tampon neuf.

En partant de la solution la plus diluée, enregistrez la réponse de l'électrode en millivolts pour chaque concentration en iodure afin de générer une courbe standard. L'activité du CFTR de type sauvage a été évaluée pour l'iodure. L'activité de flux de F a été mesurée en ano moles par seconde après reconstitution.

Le flux de F iodure est fortement stimulé en présence de CFTR et d'ATP par rapport au témoin dépourvu de CFTR, et par l'ajout d'ATP. Lorsque CFTR est phosphorylé par la protéine kinase dépendante de l'AMP cyclique, une sous-unité catalytique appelée PKA, un prétraitement inverse avec l'inhibiteur puissant CFTRinh-172 réduit le taux de flux de F iodure. La capacité de VX-770 à potentialiser le flux de F iodure du CFTR de type sauvage a été testée en l'absence et en présence de phosphorylation par PKA. VX-770 a augmenté le flux relatif de F iodure uniquement en présence de CFTR phosphorylé. L'efficacité de VX-770 a été évaluée à l'aide d'une variante de CFTR appelée ΔF508-CFTR, et l'analogue inactif V091188 n'a pas potentialisé l'activité du ΔF508-CFTR phosphorylé, tandis que VX-770 augmentait le flux relatif de F iodure. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée intégralement, de la purification jusqu'à la mesure de l'activité de CFTR, au cours d'une journée de travail typique de huit heures ; la purification de CFTR prend environ quatre heures et la reconstitution une heure supplémentaire avant le démarrage du test eFlex.

Après cette procédure, d'autres méthodes, notamment un dosage T PS et la mesure de la conductance d'un canal unique dans le para lipide S, peuvent être réalisées à l'aide de la même préparation de protéine CFDR afin de caractériser davantage l'interaction avec les petites molécules. Grâce à ces méthodes, un chercheur en fibrose kystique pourra répondre à des questions essentielles dans le domaine des modulateurs de CFTR, notamment de savoir si un modulateur interagit directement avec la protéine CFTR et quel est également son mécanisme d'action.